與IL?4和/或IL?13結(jié)合的抗體及其用途的制作方法

本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年10月14日、中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?00880111668.6、發(fā)明名稱為“與il-4和/或il-13結(jié)合的抗體及其用途”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新穎的抗il-4抗體、抗il-13抗體以及雙特異抗il-4/抗il-13抗體及其在因不當(dāng)?shù)膇l-4和/或il-13活性或代謝而造成的哺乳動(dòng)物包括人的疾病或障礙的改善、治療和預(yù)防方面的用途。感興趣的抗體可能阻斷配體如il-4或il-13與受體或受體復(fù)合物如il-4rα、il-13rα1和il-13rα2的結(jié)合和/或信號(hào)傳導(dǎo)。本發(fā)明還披露了含有感興趣抗體的預(yù)防、免疫治療和診斷組合物以及它們?cè)陬A(yù)防或治療哺乳動(dòng)物包括人的疾病的方法中的用途，這些疾病是由淋巴樣細(xì)胞和非淋巴樣細(xì)胞，包括單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的不適當(dāng)代謝和/或活性而引起的。這些疾病包括自身免疫缺陷以及由炎癥引起或以炎癥為特征的疾病，如變應(yīng)性哮喘和皮炎。發(fā)明背景白介素-4(il-4)是一種對(duì)于淋巴b和t細(xì)胞以及許多非淋巴樣細(xì)胞，包括單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有廣譜生物效應(yīng)的多效性細(xì)胞因子。例如，il-4刺激幾個(gè)依賴于il-2和il-3的細(xì)胞系的增殖，誘導(dǎo)ii類主要組織相容性復(fù)合體在靜息b細(xì)胞上的表達(dá)，并增強(qiáng)人b細(xì)胞的igg4和ige分泌。il-4與th2-型的免疫響應(yīng)有關(guān)，是由th2細(xì)胞產(chǎn)生的，并促進(jìn)th2細(xì)胞的分化。多種障礙都牽涉到il-4，如過(guò)敏和哮喘。il-13是最近發(fā)現(xiàn)的由活化t淋巴細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞以及活化后的肥大細(xì)胞分泌的112個(gè)氨基酸的細(xì)胞因子(minty,a.等人,nature,1993,362,248-250,和mckenzie,a.n.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a,1993,90,3735-3739)。由于和il-4具有許多共同的生物特性，il-13被描述為一個(gè)il-4樣的細(xì)胞因子。在b細(xì)胞(defrance,t.等人,j.exp.med.,1994,179,135-143,punnonen,j.等人,proc.natl.acad.sci.(usa),1993,90,3730-3734,fior,r.等人,eur.cytokinenetwork,1994,5,593-600)、單核細(xì)胞(muzio,m.r.f.等人,blood,1994,83,1738-1743,dewaalmalefyt,r.等人,j.immunol,1993,151,6370-6381,doyle,a.等人,eur.j.immunol.1994,24,1441-1445,montaner,l.j.等人,j.exp.med.,1993,178,743-747,sozzani,p.等人,j.biol.chem.,1995,270,5084-5088)以及其它非造血細(xì)胞(herbert,j.m.等人,febslett.,1993,328,268-270,和derocq,j.m.等人,febslett.1994,343,32-36)上，其活性確實(shí)類似于il-4的活性。另一方面，與il-4相反，它對(duì)靜息或活化的t細(xì)胞并沒(méi)有特異效應(yīng)(zurawuki,g.等人,immunol.today,1994,15,19-26)。a.j.minty以及關(guān)于il-13的評(píng)論文章詳細(xì)地描述了il-13在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞以及有些造血前體上的多種生物活性。此外，還有幾份數(shù)據(jù)表明，這一細(xì)胞因子在其它細(xì)胞類型上具有多效效應(yīng)。這些直接受到il-13影響的非造血細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞以及腎和結(jié)腸癌。細(xì)胞內(nèi)生物分子所發(fā)射信號(hào)的分析階段之一是識(shí)別其膜受體。針對(duì)il-13受體的研究表明，il-13和il-4有共同的受體，或者至少具有共同受體復(fù)合物的一些組分，以及共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元素(zurawskis.m.等人,embojournal,1993,12,2663-2670,aversa,g.等人,j.exp.med.,1993,178,2213-2218,vita,n.等人,biol.chem.,1995,270,3512-3517,lefort,s.等人,febslett.,1995,366,122-126)。這一受體存在于多種類型細(xì)胞的表面，其數(shù)目隨所考慮細(xì)胞類型不同而有變化。a.j.minty指出了il-13和il-4受體的相當(dāng)?shù)姆植?interleukin-13forcytokinesinhealthanddisease(健康和疾病中的細(xì)胞因子白介素-13).編著d.g.remick和j.s.frie,marceldecker,n.y.1996)。細(xì)胞表面受體和受體復(fù)合物以不同的親和力與il-4和/或il-13結(jié)合。與il-4和/或il-13結(jié)合的受體和受體復(fù)合物的主要組分為il-4rα、il-13rα1和il-13rα2。這些鏈作為il-4rα/il-13rαl(ii型il-4r)或il-4rα/γc(i型il-4r)的單體或異源二聚體表達(dá)在細(xì)胞表面上。il-4rα單體和il-4rα/γc異源二聚體與il-4結(jié)合但不與il-13結(jié)合。il-13rα1和il-13rα2單體與il-13結(jié)合但不與il-4結(jié)合。il-4rα/il-13rα1異源二聚體既與il-4結(jié)合，也與il-13結(jié)合(murata等人,int.j.hematol.,1999,69,13-20)。th2-型免疫響應(yīng)促進(jìn)抗體生成和體液免疫，并被精心設(shè)計(jì)用來(lái)抵御細(xì)胞外病原體。th2細(xì)胞是產(chǎn)生ig的中介體(體液免疫)并產(chǎn)生il-4、il-5、il-6、il-9、il-10和il-13(tanaka,等人,cytokineregulationofhumoralimmunity，251-272,snapper,編輯，johnwiley和sons,newyork(1996))。th2-型免疫響應(yīng)的特征是產(chǎn)生某些類型的細(xì)胞因子(如il-4,il-13)以及特定類型的抗體(ige,igg4)，屬于典型的變應(yīng)性反應(yīng)，可能造成含淚眼和哮喘癥狀，如氣道炎癥和肺中氣道肌肉細(xì)胞的收縮。根據(jù)其生物學(xué)功能，il-4和il-13都是具有重要治療意義的細(xì)胞因子，在許多疾病中，包括哮喘，起著關(guān)鍵的作用(curropinallergyclinimmunol2005,vo.5,161-166)。il-4已被證明能夠抑制自身免疫疾病，il-4和il-13都證明具有增強(qiáng)抗腫瘤免疫響應(yīng)的潛力。由于這兩個(gè)細(xì)胞因子都涉及到變應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制，因此，這些細(xì)胞因子的抑制劑應(yīng)該能夠提供治療上的益處。相應(yīng)地，需要能夠抑制il-4、il-13的改進(jìn)的活性劑(agent)，以及既能抑制il-4也能抑制il-13的單一活性劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供可特異結(jié)合到il-4和/或il-13的人源化單克隆和雙特異新穎抗體及其片段和衍生物。有些抗il-4和/或il-13單或雙特異抗體及其片段可以改變，以防止形成鏈內(nèi)二硫鍵，從而形成在制備和體內(nèi)使用過(guò)程中均穩(wěn)定的分子。本發(fā)明的抗體在此處所述的生物測(cè)定中中和il-4和/或il-13活性。本發(fā)明包括所述抗體的可變重鏈和輕鏈的氨基酸序列及其對(duì)應(yīng)的核酸序列。本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括攜帶有本發(fā)明所述抗體序列的細(xì)胞系和載體。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是所述抗體在制備用于治療與il-4和/或il-13功能和代謝有關(guān)的疾病和障礙的藥物組合物中的用途。尤其是，本發(fā)明與癌癥、自身免疫缺陷以及由炎癥引起或以炎癥為特征的疾病，如變應(yīng)性哮喘和皮炎的治療有關(guān)。本申請(qǐng)還涉及下述各項(xiàng)：1.特異結(jié)合il-4的人源化抗體。2.項(xiàng)1的抗體，其包含由seqidno:3組成的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域。3.項(xiàng)1的抗體，其包含選自seqidno:4和seqidno:5的可變重鏈結(jié)構(gòu)域。4.項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的可選的抗體，其中所述抗體是抗體片段。5.項(xiàng)1的抗體，其包含恒定區(qū)的ch1、ch2和ch3結(jié)構(gòu)域。6.如項(xiàng)5的多肽，其中的igg抗體是igg4抗體。7.編碼如項(xiàng)1的多肽的核酸。8.含有如項(xiàng)7的核酸的載體。9.含有如項(xiàng)8的載體的細(xì)胞。10.特異結(jié)合il-13的人源化抗體。11.項(xiàng)10的抗體，其包含由seqidno:1組成的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域。12.項(xiàng)11的抗體，其包含由seqidno:2組成的可變重鏈結(jié)構(gòu)域。13.的項(xiàng)10–12中任一項(xiàng)的可選的抗體，其中所述抗體是抗體片段。14.項(xiàng)10-12中的任一項(xiàng)的抗體，其包含恒定區(qū)的ch1、ch2和ch3結(jié)構(gòu)域。15.如項(xiàng)14的多肽，其中igg抗體是igg4抗體。16.編碼如項(xiàng)15的多肽的核酸。17.含有如項(xiàng)16的核酸的載體。18.含有如項(xiàng)17的載體的細(xì)胞。19.特異結(jié)合il-13和il-4的雙特異抗體或雙特異抗體片段。20.項(xiàng)19的雙特異抗體或抗體片段，其進(jìn)一步包含可變的輕鏈和可變的重鏈。21.項(xiàng)20的雙特異抗體或抗體片段，其中所述可變輕鏈包含氨基酸序列seqidno:1和seqidno:3。22.項(xiàng)20的雙特異抗體或抗體片段，其中所述可變重鏈包含氨基酸序列seqidno:2和seqidno:5。23.項(xiàng)20的雙特異抗體或抗體片段，其中所述可變重鏈包含氨基酸序列seqidno:2和seqidno:4。24.項(xiàng)20的雙特異抗體或抗體片段，其中所述可變輕鏈包含氨基酸序列seqidno:1和seqidno:3，且所述可變重鏈包含氨基酸序列seqidno:2和seqidno:4。25.項(xiàng)24的雙特異抗體或抗體片段，其中所述seqidno:1和seqidno:3由肽連接體連接在一起，所述seqidno:2和seqidno:4由肽連接體連接在一起。26.項(xiàng)25的雙特異抗體或抗體片段，其中所述肽連接體由seqidno:6組成。27.特異地結(jié)合il-13和il-13的雙特異抗體，其中可變的輕鏈包含seqidno:1和seqidno:3，可變的重鏈包含seqidno:2和seqidno:4，且還包含恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。28.項(xiàng)27的雙特異抗體，其中所述恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域由ch1、ch2、ch3和cl組成。29.包含項(xiàng)1或項(xiàng)8的人源化抗體和可藥用載體的藥物組合物。30.包含在項(xiàng)19–28的可選的雙特異抗體或抗體片段和可藥用的載體的藥物組合物。31.項(xiàng)1或項(xiàng)10的人源化抗體，其進(jìn)一步與效應(yīng)分子綴合。32.項(xiàng)31的人源化抗體，其中所述效應(yīng)分子選自：異源多肽、藥物、放射性核苷酸和毒素。33.項(xiàng)19–28中任一項(xiàng)的可選的雙特異抗體或抗體片段，其進(jìn)一步與效應(yīng)分子綴合。34.項(xiàng)33的雙特異抗體或片段，其中所述效應(yīng)分子選自：異源多肽、藥物、放射性核苷酸和毒素。35.治療哺乳動(dòng)物中變應(yīng)性疾病的方法，其包括下述步驟：向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)19-28的可選的雙特異抗體或抗體片段。36.治療哺乳動(dòng)物中變應(yīng)性疾病的方法，其包括下述步驟：向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)1或10的人源化抗體。37.治療癌癥的方法，其包括下述步驟：向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)19-28的可選的雙特異抗體或抗體片段。38.治療癌癥的方法，其包括下述步驟：向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)1或10的人源化抗體。39.治療哺乳動(dòng)物中哮喘的方法，其包括下述步驟：向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)19-28的可選的雙特異抗體或抗體片段。40.治療哺乳動(dòng)物中哮喘的方法，其包括下述步驟：向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)1或10的人源化抗體。41.治療哺乳動(dòng)物中與il-4和/或il-13異常產(chǎn)生有關(guān)的疾病之方法，其包括下述步驟：向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)19-28的可選的雙特異抗體或抗體片段。42.治療哺乳動(dòng)物中與il-4和/或il-13異常產(chǎn)生有關(guān)的疾病之方法，其包括下述步驟：向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)1或10的人源化抗體。43.抑制哺乳動(dòng)物中th-2介導(dǎo)的反應(yīng)的方法，其包括下述步驟：向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)19-28的可選的雙特異抗體或抗體片段。44.抑制哺乳動(dòng)物中th-2介導(dǎo)的反應(yīng)的方法，其包括下述步驟：向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)項(xiàng)1或10的人源化抗體。45.編碼如項(xiàng)27的雙特異抗體的核酸。46.含有如項(xiàng)45的核酸的載體。47.含有如項(xiàng)46的載體的細(xì)胞。本文還敘述了其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，將在下列詳細(xì)說(shuō)明和附圖中闡述。附圖簡(jiǎn)述圖1是含有4個(gè)多肽鏈的雙特異抗il-4/il-13抗體分子的示意圖。兩個(gè)較輕的鏈由n-vlhb-b13-連接體-vlh8d4-8-cl-c(cl，輕鏈恒定區(qū))組成，兩個(gè)較重的鏈由n-vhhb-b13-連接體-vhh8d4-8-ch1-ch2-ch3-c組成。連接體序列(g4s)2為ggggsggggs(seqidno:6)。圖2顯示人源化的b-b13抗il-13抗體(seqidno:1和2)的可變結(jié)構(gòu)域之氨基酸序列以及人源化的8d4-8抗il-4抗體(seqidno:3,4和5)的可變結(jié)構(gòu)域之氨基酸序列。下劃線表示對(duì)所做的氨基酸改變。粗體表示cdr。本發(fā)明之詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明不局限于本文所述的具體方法學(xué)、方案、細(xì)胞系、載體或試劑，這是因?yàn)樗鼈兛砂l(fā)生變動(dòng)，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。而且，本文所使用的術(shù)語(yǔ)僅出于例示具體實(shí)施方案之目的，并非意在限制本發(fā)明之范圍。除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)和任何首字母縮略詞的含義與本發(fā)明領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。實(shí)施本發(fā)明時(shí)可使用任何類似或相當(dāng)于本文所述的方法和材料，本文僅敘述了例示性方法、設(shè)備和材料。出于敘述和披露可能與本發(fā)明一同使用和可能在本發(fā)明中使用的所報(bào)道的蛋白質(zhì)、酶、載體、宿主細(xì)胞和方法學(xué)的目的，本文所提及的所有專利和出版物均籍引用之方式整體并入本文。但是，本文任何部分均不可理解為是承認(rèn)因在先發(fā)明的緣故，本發(fā)明無(wú)權(quán)聲稱早于這些披露的內(nèi)容。在教導(dǎo)制備和使用il-4和/或il-13相關(guān)的方法和目標(biāo)產(chǎn)物之前，提供了一些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)的下列非限制性定義，以指導(dǎo)技術(shù)人員。“白介素-4＂(il-4)涉及天然出現(xiàn)或內(nèi)源的哺乳動(dòng)物il-4蛋白或與天然出現(xiàn)或內(nèi)源的相應(yīng)哺乳動(dòng)物il-4蛋白具有同樣氨基酸序列的蛋白(如重組蛋白，合成蛋白(即用合成有機(jī)化學(xué)方法制備的蛋白質(zhì)))。相應(yīng)地，如此處所定義的，該術(shù)語(yǔ)包括成熟的il-4蛋白、多態(tài)或等位變體、il-4的其它同種型，以及上述的修飾的或未修飾的形式(如脂化(lipidate)或糖基化)。天然出現(xiàn)或內(nèi)源的il-4包括野生型蛋白質(zhì)如成熟的il-4、多態(tài)或等位變體以及其它在哺乳動(dòng)物(如人，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物)中天然出現(xiàn)的同種型和突變體形式。這些蛋白可從如天然產(chǎn)生il-4的來(lái)源回收或分離出來(lái)。這些蛋白質(zhì)以及與天然出現(xiàn)或內(nèi)源的相應(yīng)il-4有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)是按相應(yīng)的哺乳動(dòng)物之名稱命名的。例如，當(dāng)相應(yīng)的哺乳動(dòng)物是人時(shí)，該蛋白質(zhì)則稱為人il-4。本領(lǐng)域已知幾種突變il-4蛋白質(zhì)，如wo03/038041中所披露的?！鞍捉樗?13＂(il-13)指的是天然出現(xiàn)或內(nèi)源的哺乳動(dòng)物il-13蛋白或與天然出現(xiàn)或內(nèi)源的相應(yīng)哺乳動(dòng)物il-13蛋白具有同樣氨基酸序列的蛋白(如重組蛋白，合成蛋白(即用合成有機(jī)化學(xué)方法制備的蛋白質(zhì)))。相應(yīng)地，如此處所定義的，該術(shù)語(yǔ)包括成熟的il-13蛋白、多態(tài)或等位變體、il-13的其它同種型(如通過(guò)可選剪接或其它細(xì)胞過(guò)程所產(chǎn)生的)，以及上述的修飾的或未修飾的形式(如脂化或糖基化)。天然出現(xiàn)或內(nèi)源的il-13包括野生型蛋白質(zhì)如成熟的il-13、多態(tài)或等位變體以及其它在哺乳動(dòng)物中天然出現(xiàn)的同種型和突變形式(如人，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物)。例如，此處所用的il-13包括人il-13變體，其中位于成熟的人il-13之110位置的arg被gin所置換(成熟的il-13的110位置相當(dāng)于前體蛋白質(zhì)的130位置)，gin與哮喘(特異反應(yīng)性和非特異反應(yīng)性哮喘)以及其它il-13的變體有關(guān)。(heinzmann等人,hummoigenet9:549-559(2000))。這些蛋白可從如天然產(chǎn)生il-13的來(lái)源回收或分離出來(lái)。這些蛋白質(zhì)以及與天然出現(xiàn)或內(nèi)源的相應(yīng)il-13有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)是按相應(yīng)的哺乳動(dòng)物之名稱命名的。例如，當(dāng)相應(yīng)的哺乳動(dòng)物是人時(shí)，該蛋白質(zhì)則稱為人il-13。本領(lǐng)域已知有幾種突變il-13蛋白質(zhì)，如wo03/035847中所披露的。就抗體鏈多肽序列而言，短語(yǔ)“基本相同”可理解為表現(xiàn)出與參照多肽序列至少70％、80％、90％、95％或更多的序列同一性的抗體鏈。就核酸序列而言，該術(shù)語(yǔ)可理解為表現(xiàn)出與參照核酸序列至少大于85％、90％、95％或97％或更高的序列同一性的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)"同一性"或"同源性"可指候選序列中與相應(yīng)序列殘基相同的核苷酸堿基或氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，所述候選序列為與相應(yīng)序列進(jìn)行比較，經(jīng)比對(duì)序列和引入空位(若有必要)以實(shí)現(xiàn)整段序列的最大同一性百分?jǐn)?shù)且不把任何保守性取代視為序列同一性部分后。無(wú)論n端或c端延伸或插入均不應(yīng)理解為降低同一性或同源性。用于比對(duì)的方法和計(jì)算機(jī)程序均易獲得，并為本領(lǐng)域所熟知?？墒褂眯蛄蟹治鲕浖y(cè)量序列同一性?？贵w或抗原的"功能片段、變異體、衍生物或類似物"等以及它們的多種形式等短語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)是指具有與全長(zhǎng)目的抗體或抗原在性質(zhì)上相同的生物活性的化合物或分子。例如，抗il-4抗體的功能片段或類似物是可結(jié)合il-4分子的片段或類似物，或是可防止或基本上降低配體或激動(dòng)或拮抗性抗體結(jié)合il-4的能力的片段或類似物。"取代型"變異體是天然序列中至少一個(gè)氨基酸殘基被除去并被不同的氨基酸插入其相同位置的變異體。所述取代可為單個(gè)的，其中該分子中僅有一個(gè)氨基酸被取代；或可為多個(gè)的，其中該相同分子有兩個(gè)或更多的氨基酸被取代。多個(gè)取代可位于連續(xù)的位點(diǎn)。同樣，一個(gè)氨基酸可被多個(gè)殘基取代，其中這樣的變異體包括取代和插入二者。"插入型"變異體是一個(gè)或多個(gè)氨基酸被插入到緊鄰一段天然序列某個(gè)特定位置處的氨基酸的變異體。緊鄰氨基酸意指與該氨基酸的α-羧基或α-氨基官能團(tuán)連接。"缺失型"變異體是天然氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被除去的變異體。通常情況下，缺失型變異體在其分子的特定區(qū)域內(nèi)有一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被缺失。術(shù)語(yǔ)"抗體"被用于最寬泛的含義，具體涵蓋單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、攜帶一個(gè)或多個(gè)cdr或源自cdr序列的抗體片段或合成多肽，只要這些多肽表現(xiàn)出所需的生物活性。抗體(abs)和免疫球蛋白(igs)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。一般情況下，抗體被認(rèn)為是具有確定或公認(rèn)的特異性的ig。因此，盡管抗體表現(xiàn)出與特異靶的結(jié)合特異性，但免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏靶特異性的抗體樣分子。本發(fā)明所述抗體可為任何種類(例如igg、ige、igm、igd、iga等)、或亞類(例如igg1、igg2、igg2a、igg3、igg4、iga1、iga2等)的抗體("類型"和"種類"、以及"亞型"和"亞類"在本文中可互換使用)。天然或野生型(即得自未人工操縱的群體成員)抗體和免疫球蛋白通常為約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈(l)和兩個(gè)相同的重鏈(h)組成。每條重鏈的一端具有可變結(jié)構(gòu)域(vh)，隨后是多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈的一端具有可變結(jié)構(gòu)域(vl)，另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域。所謂"未人工操縱"意指未經(jīng)旨在使其含有或表達(dá)外來(lái)抗原結(jié)合分子的處理。野生型可指一個(gè)群體中發(fā)現(xiàn)的最普遍的等位基因或種類或指得自未操縱動(dòng)物的抗體，相比較于等位基因或多態(tài)型，或得自以某種形式的操縱例如誘變、使用重組方法等改變?cè)摽乖Y(jié)合分子的氨基酸的變異體或衍生物。正如本文所使用，"抗il-4抗體"意指可特異結(jié)合本文所定義的il-4的抗體或源自這些抗體的多肽(衍生物)，其包括但不限于抑制或?qū)嵸|(zhì)降低il-4與其受體的結(jié)合或抑制il-4活性的分子。正如本文所使用，"抗il-13抗體"意指可特異結(jié)合本文所定義的il-13的抗體或源自這些抗體的多肽(衍生物)，其包括但不限于抑制或?qū)嵸|(zhì)降低il-13與其受體的結(jié)合或抑制il-13活性的分子。就抗體的可變結(jié)構(gòu)域而言，術(shù)語(yǔ)"可變"系指抗體之間有廣泛序列差異的相關(guān)分子的某些部分，且被用于針對(duì)其特異靶的特定抗體的特異識(shí)別和結(jié)合。但是，可變性在抗體的整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)不是均勻分布的?？勺冃约性诒环Q為互補(bǔ)決定區(qū)域(cdrs；即cdr1、cdr2和cdr3)或超變區(qū)的三個(gè)區(qū)段，它們均位于輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)。可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)保守程度更高的部分被稱為構(gòu)架(fr)區(qū)或構(gòu)架序列。天然重鏈和輕鏈的每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域均包括四個(gè)fr區(qū)，其主要采用β-折疊構(gòu)型，它們籍三個(gè)cdrs連接起來(lái)，cdrs形成環(huán)，所述環(huán)連接β-折疊結(jié)構(gòu)并在某些情形下形成部分的β-折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈的cdrs通常被fr區(qū)在鄰近連接起來(lái)，并且借助于來(lái)自其它鏈的cdr，有助于抗體靶結(jié)合位點(diǎn)(表位或決定簇)的形成(參看kabat等人sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,nationalinstituteofhealth,bethesda,md(1987))。正如本文所使用，免疫球蛋白氨基酸殘基的編號(hào)是依據(jù)kabat等人的免疫球蛋白氨基酸殘基編號(hào)系統(tǒng)而進(jìn)行的，除非另有說(shuō)明。一個(gè)cdr可具有特異結(jié)合關(guān)聯(lián)表位的能力。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)"絞鏈"或"絞鏈區(qū)"系指包含抗體的第一和第二恒定結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸的柔性多肽。術(shù)語(yǔ)"抗體片段"系指完整或全長(zhǎng)鏈或抗體的一部分，一般是靶結(jié)合區(qū)域或可變區(qū)域?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段。"功能片段"或"抗il-4和/或il-13抗體的類似物"是可防止或?qū)嵸|(zhì)降低所述受體結(jié)合配體或啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力的片段或類似物。正如本文所使用，功能片段一般與"抗體片段"含義相同，且就抗體而論，可指能防止或?qū)嵸|(zhì)降低所述受體結(jié)合配體或啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力的片段，例如fv、fab、f(ab')2等等。"fv"片段由一條重鏈的可變結(jié)構(gòu)域和一條輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域籍非共價(jià)結(jié)合方式而形成的二聚體(vh-vl二聚體)組成。在該構(gòu)型中，每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)cdrs相互作用，以確定vh-vl二聚體表面上的靶結(jié)合位點(diǎn)，與完整抗體的情況一樣。所述六個(gè)cdrs共同賦予完整抗體的靶結(jié)合特異性。但是，即使是單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或僅包括3個(gè)靶特異的cdrs的fv的一半)，仍可具有識(shí)別和結(jié)合靶的能力。"單鏈fv"、"sfv"或"scab"抗體片段包括抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域位于單條多肽鏈上。一般而言，所述fv多肽還包括一段位于vh和vl區(qū)域之間的多肽連接體，其通常為柔性分子，可使sfv形成適合于靶結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)"雙抗體(diabody)"系指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，這些片段可包括與同一多肽鏈的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)相連的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)。通過(guò)使用過(guò)短的連接體使得同一條鏈上的兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域無(wú)法配對(duì)，所述雙抗體結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈的結(jié)合結(jié)構(gòu)域配對(duì)，生成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。fab片段含有輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域以及重鏈的可變和第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)。fab'片段與fab片段的不同之處在于前者在ch1結(jié)構(gòu)域的羧基端加入數(shù)個(gè)殘基，以包括一個(gè)或多個(gè)來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。通過(guò)裂解位于f(ab')2胃蛋白酶消化產(chǎn)物的鉸鏈半胱氨酸處的二硫鍵，可生成fab'片段。對(duì)抗體另外進(jìn)行酶處理和化學(xué)處理可生成其它目的功能片段。術(shù)語(yǔ)"線性fab"系指miller等所述之四價(jià)抗體(miller等人(2003),jimmunol.170:4854-4861)。"線性fab"是由一連串相同的ch1-vh結(jié)構(gòu)域組成的，在每一個(gè)ch1-vh位置與相同的輕鏈配對(duì)。研發(fā)了這些分子是為了增加抗體的效價(jià)并透過(guò)親合力效應(yīng)來(lái)增強(qiáng)其功能性親和力，但是，它們是單特異性的。術(shù)語(yǔ)"雙特異抗體(bsabs)"系指在同一個(gè)分子里組合了兩個(gè)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。因此，雙特異抗體能夠同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同的抗原。除了診斷目的之應(yīng)用之外，雙特異抗體通過(guò)將強(qiáng)力效應(yīng)體系轉(zhuǎn)向患病區(qū)域，或增加抗體的中和或刺激活性，從而為開(kāi)發(fā)新的治療方法鋪平了道路。最初試圖使用化學(xué)融合的異綴合物分子將針對(duì)不同靶抗原的兩個(gè)完整抗體的結(jié)合特異性偶聯(lián)(staerz等人(1985),nature314:628-631)。已經(jīng)透過(guò)異雜交瘤技術(shù)從雜種雜交瘤中制備了雙特異抗體，體外顯示其具有與觀察到的異綴合物類似的性質(zhì)(milstein&cuello(1983)nature305:537-540)。盡管利用如上所述從細(xì)胞融合制備的異綴合物或雙特異抗體得到了令人有希望的結(jié)果，但是幾個(gè)因素卻使它們的大規(guī)模治療應(yīng)用變得不實(shí)際。這些因素包括：體內(nèi)大異綴合物的快速清除、產(chǎn)生任何一類分子所需要的高勞動(dòng)強(qiáng)度的技術(shù)、需要深入純化將異綴合物從單綴合物或單特異抗體分離出來(lái)，而且通常產(chǎn)率很低?；蚬こ淘絹?lái)越多地被用于設(shè)計(jì)、改變、生產(chǎn)具有一組期望的結(jié)合特性和效應(yīng)物功能的抗體或抗體衍生物?，F(xiàn)已研發(fā)了多種重組技術(shù)來(lái)有效地生產(chǎn)雙特異抗體，既可作為抗體片段(carter等人(1995),j.hematotherapy4:463-470；pluckthun等人(1997)immunotechology3:83-105；todorovska等人(2001)j.immunol.methods248:47-66)，也可作為全長(zhǎng)igg形式(carter(2001)j.immunol.methods248:7-15)。將兩個(gè)不同的scfvs組合產(chǎn)生具有最小分子量的稱為sc-bsabs或ta-scfvs的雙特異抗體形式(mack等人(1995),proc.acad.sci.usa.92:7021-7025；mallender等人(1994)j.biol.chem.269:199-206)?；蚬こ躺希啥刍倌軋F(tuán)如亮氨酸拉鏈融合兩個(gè)scfvs從而構(gòu)建雙特異抗體(kostelny等人(1992)j.immunol.148:1547-53；dekruif等人(1996)j.biol.chem.271:7630-4)。如上所述，雙抗體是很小的二價(jià)雙特異抗體片段。這些片段在同一肽鏈上包含通過(guò)使用連接體連結(jié)到vl的vh，所述連接體太短(少于12個(gè)氨基酸)使得同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無(wú)法配對(duì)。這些結(jié)構(gòu)域被迫與另一個(gè)鏈上互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分子間配對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。這些二聚抗體片段，或“雙抗體＂，為二價(jià)并具有雙特異性。(holliger等人(1993),proc.natl.acad.sci.usa.90:6444-6448)。雙抗體的大小與fab片段類似。以3到12個(gè)氨基酸的連接體連接的vh和vl結(jié)構(gòu)域的多肽鏈主要形成二聚體(雙抗體)，而由0到2個(gè)氨基酸殘基的連接體連接的則有利于形成三聚體(三抗體(triabody))和四聚體(四抗體(tetrabody))。除了連接體的長(zhǎng)度外，寡聚化的確切模式似乎取決于v-結(jié)構(gòu)域的組成和取向(hudson等人(1999),jimmunolmethods231:177-189)。雙抗體分子最后結(jié)構(gòu)的可預(yù)測(cè)性很差。盡管基于sc-bsabs和雙抗體的構(gòu)建體顯示很有趣的臨床潛力，但是，已經(jīng)證明，這樣的非共價(jià)結(jié)合的分子在生理?xiàng)l件下卻不夠穩(wěn)定。scfv片段的總體穩(wěn)定性取決于vl和vh結(jié)構(gòu)域自身的穩(wěn)定性以及結(jié)構(gòu)域界面的穩(wěn)定性。已經(jīng)顯示，scfv片段vh-vl界面的穩(wěn)定性不夠是不可逆scfv失活的主要原因，因?yàn)殡倪B接體所允許的界面瞬態(tài)打開(kāi)會(huì)使有利于聚集的疏水區(qū)塊(patch)曝露，因此造成不穩(wěn)定和低產(chǎn)率(和plückthun(2001),j.mol.biol.305:989-1010)。us5,989,830中披露了可選的從vh和vl結(jié)構(gòu)域制備雙特異二價(jià)抗原結(jié)合蛋白的方法。這樣的雙頭抗體片段是籍由表達(dá)編碼兩個(gè)多肽鏈的雙順?lè)醋虞d體獲得的，其中一個(gè)多肽鏈有兩個(gè)通過(guò)肽連接體串聯(lián)的vh(vh1-連接體-vh2)，另一個(gè)多肽鏈由互補(bǔ)的vl結(jié)構(gòu)域組成，所述vl結(jié)構(gòu)域由肽連接體串聯(lián)連接(vl1-連接體-vl2)。us5,989,830描述，每個(gè)連接體應(yīng)該包含至少10個(gè)氨基酸殘基。us2005/0003403a1描述了價(jià)態(tài)增加的多價(jià)蛋白復(fù)合物(ppc)。多價(jià)蛋白復(fù)合物包含兩個(gè)多肽鏈，它們通常彼此側(cè)向排列。每個(gè)多肽鏈通常包含3或4個(gè)包含氨基酸序列的“v區(qū)＂，當(dāng)與相對(duì)的多肽鏈上的對(duì)應(yīng)的v區(qū)匹配時(shí)，這些氨基酸序列能夠形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。每個(gè)多肽鏈上可用多達(dá)大約6個(gè)“v區(qū)＂。每個(gè)多肽鏈上的v區(qū)彼此線性連接，可由散開(kāi)的連接區(qū)連接。當(dāng)排列成ppc形式時(shí)，每個(gè)多肽鏈上的v區(qū)形成單個(gè)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。復(fù)合物可能包含一種或幾種結(jié)合特異性。但是，利用這樣的分子顯示了聚集，不穩(wěn)定性以及很差的表達(dá)產(chǎn)率(wu等人(2001)prot.eng.14:1025-1033)。這些是表達(dá)基于單鏈的抗體時(shí)可能出現(xiàn)的典型穩(wěn)定性問(wèn)題。(和plückthun(2001),j.mol.biol.305:989-1010)。因此，本發(fā)明的目的就是要提供雙特異多價(jià)抗體，利用其可避免形成聚集物。此外，它應(yīng)具有穩(wěn)定性，使之可用于治療應(yīng)用。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"系指得自基本同源抗體群的抗體，即組成該群體的單個(gè)抗體除可能有少數(shù)存在天然發(fā)生的突變外，均是相同的。本文的單克隆抗體具體包括"嵌合"抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與源自某特定物種或?qū)儆谀程囟贵w種類或亞類(類型或亞型)的相應(yīng)序列相同或同源，其中所述鏈的其余部分與源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w種類或亞類的抗體以及所述抗體片段的相應(yīng)序列相同或同源，只要這些抗體片段表現(xiàn)出結(jié)合il-4和/或il-13或影響il-4和/或il-13活性或代謝的所需生物活性(us專利號(hào)4,816,567；和morrison等人,procnatlacadsciusa81:6851(1984))。因此，來(lái)自同一類別抗體的cdr可移植到不同種類或亞類抗體的fr。單克隆抗體是高度特異性的抗體，針對(duì)單個(gè)靶位點(diǎn)、表位或決定簇。而且，與通常包括針對(duì)抗原不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品不同的是，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)靶上的單個(gè)決定簇。除其特異性以外，單克隆抗體在宿主細(xì)胞內(nèi)的合成是有利的，不受其它免疫球蛋白的污染，并為克隆提供了編碼其抗體鏈的相關(guān)基因和mrna。修飾語(yǔ)"單克隆"提示得自基本同源抗體群的抗體的性質(zhì)，其不應(yīng)理解為需要籍任何特定方法產(chǎn)生所述抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可從噬菌體抗體庫(kù)經(jīng)使用眾所周知的技術(shù)分離或從多克隆制品純化。依據(jù)本發(fā)明使用的親代單克隆抗體可通過(guò)kohler等人在nature256:495(1975)中所述的雜交瘤方法制備，或通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的重組方法制備。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"多價(jià)抗體"系指包含兩個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)、因而能夠結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)具有相同或不同結(jié)構(gòu)的抗原之抗體。術(shù)語(yǔ)"二價(jià)"表示抗體包含兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)"四價(jià)"表示抗體包含四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合位點(diǎn)"系指抗體中這樣的部份，其包含特異地與抗原之部份或全部結(jié)合，并與抗原之部份或全部成互補(bǔ)的區(qū)域。當(dāng)抗原很大時(shí)，抗體可能只能結(jié)合到抗原的一個(gè)特定的部份，該部份被稱為表位?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域可由一個(gè)或多個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域提供。優(yōu)選的是，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)和抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)結(jié)合形成的。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"抗原"系指能夠被本發(fā)明的抗體所結(jié)合的分子或分子之一部份?？乖捎幸粋€(gè)或多于一個(gè)表位。本發(fā)明抗體可識(shí)別的抗原之實(shí)例包括但不限于血清蛋白如細(xì)胞因子，例如il-4、il5、il9和il-13，生物活性肽、細(xì)胞表面分子如受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、離子通道、病毒和細(xì)菌蛋白。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"單特異的"系指本發(fā)明的多價(jià)抗體僅可識(shí)別出一個(gè)抗原，所有的抗原結(jié)合位點(diǎn)都是相同的。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"雙特異的"系指本發(fā)明的多價(jià)抗體可在同一或兩個(gè)不同的抗原上識(shí)別出兩個(gè)不同的表位。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"多特異的"系指本發(fā)明的多價(jià)抗體可在同一或多個(gè)不同的抗原上識(shí)別出多個(gè)不同的表位。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"連接體"系指一個(gè)經(jīng)過(guò)調(diào)整連接本發(fā)明抗體結(jié)構(gòu)可變結(jié)構(gòu)域的肽。肽連接體可包含任何氨基酸，優(yōu)選的為甘氨酸(g)和絲氨酸(s)。在重鏈多肽和輕鏈多肽之間或內(nèi)部，連接體彼此可為相同或不同。此外，連接體的長(zhǎng)度可為1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20個(gè)氨基酸。重鏈結(jié)構(gòu)域和輕鏈結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選的肽連接體單元為ggggs。重鏈和輕鏈的連接體單元的數(shù)目可以是相同的(對(duì)稱的順序)，也可以是彼此不同的(非對(duì)稱的順序)。肽連接體優(yōu)選足夠長(zhǎng)以便能夠提供足夠的柔性程度以防止抗體部分例如通過(guò)位阻干擾彼此的活性，從而允許蛋白質(zhì)適當(dāng)?shù)卣郫B，如有必要，還可讓抗體分子與同一細(xì)胞上兩個(gè)或多個(gè)可能分得很開(kāi)的受體相互作用；然而，優(yōu)選的是足夠短以允許抗體部份在細(xì)胞中保持穩(wěn)定。因此，肽連接體的長(zhǎng)度、組成和/或構(gòu)像可很容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員選定，以便優(yōu)化多價(jià)抗體所需要的性質(zhì)。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或它們的片段(例如抗體的fv、fab、fab'、f(ab')2或其它靶結(jié)合亞序列)，與人抗體相比，其含有源自非人免疫球蛋白的序列。一般而言，所述人源化抗體基本上總共包括一個(gè)、典型為兩個(gè)的可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有cdr區(qū)域?qū)?yīng)于非人免疫球蛋白的cdr區(qū)域，以及所有或基本上所有fr區(qū)域是人免疫球蛋白模板序列的fr區(qū)域。所述人源化抗體還可包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常是所選擇的人免疫球蛋白模板的恒定區(qū)。一般而言，目的是擁有在人體內(nèi)免疫原性最低的抗體分子。因此，有可能一個(gè)或多個(gè)cdrs中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸也可被更換成在人宿主體內(nèi)免疫原性更低的氨基酸，卻基本不最小化所述一個(gè)或多個(gè)cdrs對(duì)il-4和/或il-13的特異結(jié)合功能?；蛘撸琭r可為非人的，但免疫原性最強(qiáng)的那些氨基酸被替換為免疫原性較低的氨基酸。但是，上文所討論的cdr移植并非是獲得人源化抗體的唯一途徑。例如，僅修飾cdr區(qū)域可能不夠充分，因?yàn)闃?gòu)架區(qū)殘基參與決定cdr環(huán)的三維結(jié)構(gòu)和抗體與其配體的總親和力的現(xiàn)象并非鮮見(jiàn)。因此，可實(shí)施任何方法，以使非人親代抗體分子被修飾為對(duì)人免疫原性更低的抗體分子，而且并非總是需要與人抗體的全局序列同一性(globalsequenceidentity)。因此，也可通過(guò)例如僅取代數(shù)個(gè)殘基實(shí)現(xiàn)人源化，尤其是取代暴露在抗體分子上且沒(méi)有被包埋在該分子內(nèi)部因此不易接近宿主免疫系統(tǒng)的殘基。本文在取代抗體分子上的"活動(dòng)"或"柔性"殘基方面教導(dǎo)了該方法，其目標(biāo)是降低或減緩所形成分子的免疫原性，卻不破壞所述抗體對(duì)其表位或決定簇的特異性。例如參見(jiàn)studnicka等人,proteng7(6)805-814,1994；molimm44:1986-1988,2007；sims等人,jimmunol151:2296(1993)；chothia等人,jmolbiol196:901(1987)；carter等人,procnatlacadsciusa89:4285(1992)；presta等人,jimmunol151:2623(1993),wo2006/042333和美國(guó)專利號(hào)5,869,619。感興趣的人源化方法基于抗體的分子柔性在免疫識(shí)別期間和其時(shí)的影響。蛋白質(zhì)柔性與蛋白分子的分子運(yùn)動(dòng)有關(guān)。蛋白質(zhì)柔性是整個(gè)蛋白、部分蛋白或單個(gè)氨基酸殘基采取構(gòu)象集合(ensemble)的能力，其中所述構(gòu)象各自顯著不同。有關(guān)蛋白質(zhì)柔性的信息可通過(guò)進(jìn)行蛋白質(zhì)x射線結(jié)晶學(xué)實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)例如kundu等人,2002,biophysj83:723–732.)、核磁共振實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)例如freedberg等人,jamchemsoc1998,120(31):7916-7923)或進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)(md)模擬而獲得。在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行蛋白質(zhì)的md模擬，可通過(guò)計(jì)算原子之間的物理相互作用而允許測(cè)定所有蛋白質(zhì)原子在一段時(shí)間內(nèi)的運(yùn)動(dòng)。md模擬的輸出是所研究蛋白在模擬時(shí)間段內(nèi)的軌跡。該軌跡是蛋白質(zhì)構(gòu)象的集合，也稱為快照(snapshot)，所述蛋白質(zhì)構(gòu)象在模擬期間例如每1皮秒(ps)周期性采樣。正是通過(guò)分析快照的集合，人們能夠定量蛋白質(zhì)氨基酸殘基的柔性。因此，就含有柔性殘基的多肽而言，柔性殘基是采取不同構(gòu)象集合的殘基。md方法為本領(lǐng)域所周知，參見(jiàn)例如brooks等人,proteins:atheoreticalperspectiveofdynamics,structureandthermodynamics(wiley,newyork,1988)。數(shù)種軟件可進(jìn)行md模擬，例如amber(參見(jiàn)case等人(2005)jcompchem26:1668-1688),charmm(參見(jiàn)brooks等人(1983)jcompchem4:187-217；和mackerell等人(1998)theencyclopediaofcomputationalchemistryvol.1:271-177,schleyer等人eds.chichester:johnwiley&sons)或impact(參見(jiàn)rizzo等人,jamchemsoc；2000；122(51):12898-12900)。大多數(shù)蛋白質(zhì)復(fù)合物享有相對(duì)較大和較平的被包埋表面，業(yè)已表明結(jié)合伴侶蛋白的柔性提供了其彈性的來(lái)源，使得它們能夠構(gòu)象性彼此適應(yīng)(structure(2000)8,r137-r142)。因此，業(yè)已表明"誘導(dǎo)契合"的實(shí)例在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的界面中起了主要作用。此外，穩(wěn)定增長(zhǎng)的數(shù)據(jù)體表明蛋白質(zhì)實(shí)際上結(jié)合多種形狀、大小和組成的配體(proteinscience(2002)11:184-187)，且構(gòu)象多樣性似乎是識(shí)別不同伴侶蛋白能力的關(guān)鍵組分(science(2003)299,1362-1367)。柔性殘基參與了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)伴侶蛋白的結(jié)合(structure(2006)14,683-693)。柔性殘基可采取許多構(gòu)象，它們提供了相互作用區(qū)域的集合，其有可能被記憶b細(xì)胞識(shí)別并觸發(fā)免疫原性反應(yīng)。因此，可通過(guò)修飾許多來(lái)自構(gòu)架區(qū)的殘基使抗體人源化，使得構(gòu)象集合和受修飾抗體所展示的識(shí)別區(qū)域集合盡可能類似于人抗體所采取的構(gòu)象集合和識(shí)別區(qū)域集合。這一點(diǎn)可通過(guò)以下列方法修飾有限數(shù)目的殘基得以實(shí)現(xiàn)：(1)構(gòu)建親代mab的同源模型，進(jìn)行md模擬；(2)分析柔性殘基和鑒定非人抗體分子最柔性的殘基，以及鑒定有可能是異質(zhì)性或降解反應(yīng)來(lái)源的殘基或基序；(3)鑒定展示出與親代抗體最相似的識(shí)別區(qū)域集合的人抗體；(4)測(cè)定待突變的柔性殘基，可能為異質(zhì)性和降解來(lái)源的殘基或基序也發(fā)生突變；(5)檢查是否存在已知t細(xì)胞或b細(xì)胞表位。使用本文所教導(dǎo)的md計(jì)算經(jīng)使用隱式溶劑模型可發(fā)現(xiàn)柔性殘基，該溶劑模型描述了水溶劑與蛋白質(zhì)原子在模擬期間內(nèi)的相互作用的原因。一旦在可變輕鏈和重鏈內(nèi)鑒定出一組柔性殘基，即鑒定出與目的抗體高度類似的一組人重鏈和輕鏈可變區(qū)域構(gòu)架。例如可使用blast搜索在抗體人種系序列的數(shù)據(jù)庫(kù)中在一組柔性殘基上進(jìn)行。還可通過(guò)比較親代mab的動(dòng)力學(xué)與種系規(guī)范結(jié)構(gòu)庫(kù)的動(dòng)力學(xué)來(lái)進(jìn)行。檢索時(shí)排除cdr殘基和鄰近殘基，以確保對(duì)于抗原的高度親和力得以保留。隨后取代柔性殘基。當(dāng)幾個(gè)人殘基表現(xiàn)出類似同源性時(shí)，還通過(guò)可能影響人源化抗體的溶液行為的殘基性質(zhì)驅(qū)動(dòng)該選擇。例如，暴露的柔性環(huán)上優(yōu)選極性殘基，而不是疏水殘基。為不穩(wěn)定性和異質(zhì)性潛在來(lái)源的殘基也發(fā)生突變，即使它們?cè)赾drs上被發(fā)現(xiàn)。這些殘基包括暴露的甲硫氨酸，因?yàn)閬嗧啃纬煽赡苁怯捎谘趸?、?duì)酸敏感的鍵例如asp-pro二肽的鍵的蛋白水解切割(drugdevres(2004)61:137-154)；位于暴露的天冬酰胺殘基和隨后的小氨基酸例如gly、ser、ala、his、asn或cys處的脫酰胺作用位點(diǎn)(jchromatog(2006)837:35-43)和n-糖基化位點(diǎn)例如asn-x-ser/thr位點(diǎn)。一般情況下，暴露的甲硫氨酸會(huì)被leu所取代，暴露的天冬酰胺會(huì)被谷氨酰胺或天冬氨酸所取代，或其隨后的殘基會(huì)被更換。對(duì)于糖基化位點(diǎn)(asn-x-ser/thr)而言，可更換asn或ser/thr殘基。檢查形成的復(fù)合序列是否存在已知的b細(xì)胞或線性t細(xì)胞表位。例如，可利用公眾可用的iedb進(jìn)行檢索。如果在該復(fù)合序列中發(fā)現(xiàn)已知表位，則檢索和取代另一組人序列。與us專利號(hào)5,639,641的表面重塑方法不同的是，該方法探討了b細(xì)胞介導(dǎo)和t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫原性反應(yīng)。該方法還避免了有時(shí)使用cdr移植可觀察到的活性丟失問(wèn)題(us專利號(hào)5,530,101)。此外，在設(shè)計(jì)和選擇過(guò)程中還考慮了穩(wěn)定性和溶解度的問(wèn)題，從而產(chǎn)生對(duì)于低免疫原性、高抗原親和力和改善生物物理性質(zhì)最優(yōu)化的抗體。例如us專利號(hào)5,639,641披露了用于表面重塑抗體的策略和方法以及降低抗體在不同宿主體內(nèi)免疫原性的其它方法。簡(jiǎn)而言之，在一優(yōu)選方法中，(1)生成抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)域庫(kù)的位置比對(duì)，以產(chǎn)生重鏈和輕鏈可變區(qū)域構(gòu)架表面暴露的位置，其中所有可變區(qū)域的比對(duì)位置至少約98％是相同的；(2)定義一組重鏈和輕鏈可變區(qū)域構(gòu)架表面暴露的氨基酸殘基，以用于非人例如嚙齒類動(dòng)物抗體(或其抗體片段)；(3)鑒定一組與所述嚙齒類動(dòng)物表面暴露的氨基酸殘基最為一致的重鏈和輕鏈可變區(qū)域構(gòu)架表面暴露的氨基酸殘基；以及(4)除了在所述嚙齒類動(dòng)物抗體cdr的任何殘基的任何原子以內(nèi)的氨基酸殘基外，將步驟(2)所確定的一組重鏈和輕鏈可變區(qū)域構(gòu)架表面的暴露氨基酸替換為步驟(3)所鑒定的一組重鏈和輕鏈可變區(qū)域構(gòu)架表面的暴露氨基酸殘基，以生成保留結(jié)合特異性的人源化例如嚙齒類動(dòng)物抗體?？贵w可利用許多其它技術(shù)包括cdr移植(epo0239400；wo91/09967和us專利號(hào)5,530,101以及5,585,089)、貼面(veneering)或表面重塑(epo0592106；epo0519596；padlan,1991,molecimm28(4/5):489-498；studnicka等人,1994,proteng7(6):805-814和roguska等人,1994,pnas91:969-973)和鏈改組(us專利號(hào)5,565,332)進(jìn)行人源化。人抗體可籍許多本領(lǐng)域知曉的方法進(jìn)行制備，包括但不限于噬菌體展示方法(參見(jiàn)us專利號(hào)4,444,887,4,716,111,5,545,806和5,814,318和wo98/46645,wo98/50433,wo98/24893,wo98/16654,wo96/34096,wo96/33735和wo91/10741)，使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如嚙齒類動(dòng)物，使用嵌合細(xì)胞等。"抗體同源物"或“同源物”系指任何按此處所教導(dǎo)特異結(jié)合il-4和/或il-13的分子。因此，抗體同源物包括天然或重組抗體、不論修飾與否，保留了目的生物學(xué)性質(zhì)(例如結(jié)合il-4或il-13)的抗體部分，例如fab或fv分子、單鏈抗體以及攜帶一個(gè)或多個(gè)cdr區(qū)域的多肽等。所述同源物的氨基酸序列無(wú)需與天然存在的抗體氨基酸序列相同，但可經(jīng)改變或修飾以攜帶取代氨基酸、插入氨基酸、缺失氨基酸、除蛋白質(zhì)上正常存在的20個(gè)氨基酸以外的氨基酸等，以獲得具有增強(qiáng)或其它有利性質(zhì)的多肽。具有同源序列的抗體是其氨基酸序列與本發(fā)明的il-4,il-13或雙特異il-4/il-13抗體的氨基酸序列具有序列同源性的抗體。優(yōu)選地，同源性位于本發(fā)明抗體的可變區(qū)域的氨基酸序列。應(yīng)用于本文氨基酸序列的"序列同源性"定義為經(jīng)例如根據(jù)pearson&lipman,procnatlacadsciusa85,2444-2448(1988)的fasta檢索方法測(cè)定與其它氨基酸序列具有至少約90％、91％、92％、93％、94％或更多的序列同源性，更優(yōu)選地為至少約95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。嵌合抗體是具有不同抗體部分的抗體，其源自不同來(lái)源例如不同抗體、不同種類的抗體、不同動(dòng)物物種，例如具有源自鼠單克隆抗體的可變區(qū)與人免疫球蛋白恒定區(qū)配對(duì)的抗體等。因此，人源化抗體是一種嵌合抗體。用于生產(chǎn)嵌合抗體的方法為本領(lǐng)域所知曉，參見(jiàn)例如morrison,1985,science229:1202；oi等人,1986,biotechniques4:214；gillies等人,1989,jimmunolmethods125:191-202和us專利號(hào)5,807,715,4,816,567和4,816,397。人工抗體包括scfv片段、嵌合抗體、雙抗體、三抗體、四抗體和mru(參見(jiàn)winter&milstein的綜述,1991,nature349:293-299；和hudson,1999,curropinimm11:548-557)，其中每種均具有抗原結(jié)合或表位結(jié)合能力。在單鏈fv片段(scfv)中，抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域籍柔性勝肽連接起來(lái)。一般情況下，所述連接體是約為15個(gè)氨基酸的肽。如果連接體小得多，例如為5個(gè)氨基酸，則會(huì)形成雙抗體。抗體的最小結(jié)合單元為cdr，通常為具有足夠特異識(shí)別和結(jié)合能力的重鏈cdr2。這種片段被稱為分子識(shí)別單元或mru。幾個(gè)該類mrus可籍短的連接體肽連接到一起，從而形成具有高于單個(gè)mru親合力的人工結(jié)合蛋白。目的抗體的功能等效物也包括在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。術(shù)語(yǔ)"功能等效物"包括帶有同源序列的抗體、抗體同源物、嵌合抗體、人工抗體和修飾的抗體，例如，其中每個(gè)功能等效物是按照其結(jié)合il-4和/或il-13、抑制il-4和/或il-13信號(hào)傳導(dǎo)能力或功能，或抑制il-4和/或il-13結(jié)合到其受體的能力定義的。技術(shù)人員會(huì)理解名為"抗體片段"的一組分子與名為"功能等效物"的一組有重迭。制備保留il-4和/或il-13結(jié)合能力的功能等效物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，并為例如wo93/21319,eposer.no.239,400,wo89/09622,eposer.no.338,745和eposer.no.332,424所披露。本申請(qǐng)的功能等效物還包括修飾抗體，例如被任何類型的分子經(jīng)共價(jià)連接至抗體而修飾的抗體。例如，修飾抗體包括業(yè)已被已知的保護(hù)/阻斷基經(jīng)過(guò)例如糖基化、乙?；⒕垡叶蓟?、脫酰胺化、磷酸化、酰胺化、衍生化，蛋白水解切割、連接到細(xì)胞配體、連接到毒素或細(xì)胞毒性部分或其它蛋白等修飾的抗體。共價(jià)連接無(wú)需這樣的抗體，所述抗體免疫于生成抗個(gè)體基因型反應(yīng)。所述修飾可通過(guò)已知技術(shù)實(shí)現(xiàn)，其包括但不限于特定化學(xué)切割、乙酰化、甲?；⒋x合成等。此外，被修飾抗體可含有一個(gè)或多個(gè)非典型的氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用許多技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)結(jié)合親和力的優(yōu)化。一般情況下，這些技術(shù)包括取代目的位點(diǎn)處的多種氨基酸殘基、隨后篩選分析突變多肽對(duì)關(guān)聯(lián)抗原或表位的結(jié)合親和力。一旦抗體被鑒定和分離，通?？捎糜谏勺儺惪贵w或突變體或突變蛋白質(zhì)，其中例如所述抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被改變?？蛇x地或額外地，可向抗體引入構(gòu)架區(qū)殘基的一個(gè)或多個(gè)變動(dòng)(例如取代)，其中這些變動(dòng)導(dǎo)致抗體突變體對(duì)il-4和/或il-13的結(jié)合親和力升高?？山?jīng)修飾的構(gòu)架區(qū)殘基的實(shí)例包括非共價(jià)直接結(jié)合抗原的殘基(amit等人,science233:747-753(1986))；影響cdr構(gòu)象或與其相互作用的殘基(chothia等人,jmolbiol196:901-917(1987))；和/或參與vl-vh界面的殘基(ep239400)。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)這類構(gòu)架區(qū)殘基的修飾導(dǎo)致抗體與關(guān)聯(lián)抗原的結(jié)合親和力增加。例如，在本發(fā)明的該實(shí)施方案中可改變約1個(gè)到約5個(gè)構(gòu)架區(qū)殘基。有時(shí)，這足以產(chǎn)生適合用于臨床前試驗(yàn)的抗體突變體，即使其中高變區(qū)的任何殘基都沒(méi)有改變。但正常情況下抗體突變體可包括一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)變動(dòng)。也可改變恒定區(qū)以獲得理想或更加理想的效應(yīng)物性質(zhì)。被變動(dòng)的高變區(qū)殘基可隨機(jī)改變，尤其是當(dāng)親代抗體的初始結(jié)合親和力可使隨機(jī)產(chǎn)生的抗體突變體容易在本文所教導(dǎo)的測(cè)定中就改變的結(jié)合進(jìn)行篩選。一種獲得抗體突變體例如cdr突變體的方法是"丙氨酸掃描誘變"(cunningham&wells,science244:1081-1085(1989)和cunningham&wells,procnatacadsciusa84:6434-6437(1991))。一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基被丙氨酸或聚丙氨酸殘基替換。對(duì)所述取代表現(xiàn)出功能敏感性的這些高變區(qū)殘基隨后通過(guò)在或就取代位點(diǎn)引入進(jìn)一步或其它突變而精修。因此，盡管事先確定了引入氨基酸序列變動(dòng)的位點(diǎn)，但突變本身的性質(zhì)無(wú)需事先確定。根據(jù)被掃描殘基的所需性質(zhì)，可嘗試使用其它氨基酸進(jìn)行類似取代。鑒定待修飾氨基酸殘基更為系統(tǒng)的方法包括鑒定參與結(jié)合il-4和/或il-13的高變區(qū)殘基和很少或沒(méi)有參與il-4和/或il-13結(jié)合的高變區(qū)殘基。進(jìn)行非結(jié)合高變區(qū)殘基的丙氨酸掃描，其中檢測(cè)每個(gè)ala突變體對(duì)il-4和/或il-13的結(jié)合的增強(qiáng)。在另一實(shí)施方案中，選擇明顯參與il-4和/或il-13結(jié)合的這些殘基進(jìn)行修飾。修飾可包括缺失殘基或在目的殘基鄰近插入一個(gè)或多個(gè)殘基。但是，正常情況下修飾包括以另一個(gè)氨基酸取代殘基。保守性取代可以是第一取代。如果該取代導(dǎo)致生物活性發(fā)生變化(例如結(jié)合親和力)，那么可進(jìn)行另一次保守取代以確定是否得到更多實(shí)質(zhì)性變化。通過(guò)選擇其性質(zhì)與正常情況下位于某位點(diǎn)處的氨基酸有更多實(shí)質(zhì)差異的氨基酸，可對(duì)抗體范圍和生物性質(zhì)的呈現(xiàn)進(jìn)行更為實(shí)質(zhì)性的修飾。因此，在維持下列情況下可進(jìn)行該取代：(a)取代區(qū)域的多肽骨架結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)象；(b)該分子在靶位點(diǎn)處的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的大小。例如，根據(jù)常見(jiàn)側(cè)鏈性質(zhì)，天然存在的氨基酸可分為以下幾組：(1)疏水：甲硫氨酸(m或met)、丙氨酸(a或ala)、纈氨酸(v或val)、亮氨酸(l或leu)和異亮氨酸(i或ile)；(2)中性、親水：半胱氨酸(c或cys)、絲氨酸(s或ser)、蘇氨酸(t或thr)、天冬酰胺(n或asn)和谷氨酰胺(q或gln)；(3)酸性：天冬氨酸(d或asp)和谷氨酸(e或glu)；(4)堿性：組氨酸(h或his)、賴氨酸(k或lys)和精氨酸(r或arg)；(5)影響鏈取向的殘基：甘氨酸(g或gly)和脯氨酸(p或pro)，以及(6)芳香：色氨酸(w或trp)、酪氨酸(y或tyr)苯丙氨酸(f或phe)。非保守取代需要以來(lái)自另一組的氨基酸調(diào)換氨基酸。保守性取代需要將一氨基酸交換成組內(nèi)另一氨基酸。優(yōu)選的氨基酸取代包括下列氨基酸取代，其：(1)降低對(duì)蛋白水解的敏感性，(2)降低對(duì)氧化的敏感性，(3)改變結(jié)合親和力以及(4)賦予或修飾這些類似物的其它生理-化學(xué)或功能性質(zhì)。類似物可包括除天然存在肽序列以外的序列的多種突變蛋白質(zhì)。例如，可對(duì)天然存在的序列(優(yōu)選在形成分子間接觸的區(qū)域以外的多肽部分)進(jìn)行單個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代(優(yōu)選為保守性氨基酸取代)。除r基或側(cè)鏈的大小或構(gòu)象的改變以外，保守性氨基酸取代不應(yīng)實(shí)質(zhì)性改變親代序列的結(jié)構(gòu)特征(例如氨基酸替換不應(yīng)傾向于打斷親代序列中存在的螺旋，或破壞表征親代序列的其它類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)(proteins,structuresandmolecularprinciples,creighton,編輯，w.h.freemanandcompany,newyork(1984))；introductiontoproteinstructure(branden&tooze,eds.,garlandpublishing,newyork,n.y.(1991))；和thornton等人nature354:105(1991)。通常情況下，生物學(xué)性質(zhì)改善的抗體突變體具有與親代抗人il-4和/或il-13抗體的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列至少75％的氨基酸序列同一性或相似性，至少80％、至少85％、至少90％以及通常為至少95％的同一性的氨基酸序列。就親代抗體序列而言，同一性或相似性在本文中定義為經(jīng)比對(duì)序列和引入空位(若有必要)以實(shí)現(xiàn)最大的百分比序列同一性后，候選序列的與親代抗體殘基相同(即相同殘基)或類似(即基于相同側(cè)鏈性質(zhì)而來(lái)自同一組的氨基酸殘基，參見(jiàn)上文)的氨基酸殘基百分比?；蛘撸ㄟ^(guò)重鏈和輕鏈的fr和cdr區(qū)域或抗il-4、抗il-13或雙特異il-4/il-13抗體的fc區(qū)域的系統(tǒng)突變，可生成抗體突變體。生成抗體突變體的另一種方法包括使用噬菌體展示進(jìn)行親和力成熟(hawkins等人,jmolbiol254:889-896(1992)和lowman等人,biochemistry30(45):10832-10838(1991))。已知噬菌體外殼蛋白融合(smith,science228:1315(1985)；scott&smith,science249:386(1990)；cwirla等人,procnatlacadsciusa8:309(1990)；devlin等人,science249:404(1990)；wells&lowman,curropinstructbiol2:597(1992)和us5,223,409)可用于將所展示的蛋白或肽的表型與編碼它們的噬菌體顆粒的基因型聯(lián)系在一起?？贵w的fab結(jié)構(gòu)域也已被展示在噬菌體上(mccafferty等人,nature348:552(1990)；barbas等人,procnatlacadsciusa88:7978(1991)；和garrard等人,biotechnol9:1373(1991))。單價(jià)噬菌體展示由下述組成：將一組蛋白質(zhì)變體作為噬菌體外殼蛋白融合體展示于噬菌體顆粒上(bass等人,proteins8:309(1990)。以前業(yè)已通過(guò)連續(xù)應(yīng)用誘變、單價(jià)噬菌體展示和功能分析(lowman&wells,jmolbiol234:564578(1993)；us專利號(hào)5,534,617)如通過(guò)集中于抗體的cdr區(qū)域(barbas等人,procnatlacadsciusa91:3809(1994)；和yang等人,jmolbiol254:392(1995))實(shí)現(xiàn)了親和力成熟或多種蛋白平衡結(jié)合親和力的提高。可在噬菌體顆粒上構(gòu)建許多(例如106或更多)其序列特定位置上有差異的蛋白變異體的庫(kù)，其中每個(gè)噬菌體顆粒含有編碼特定蛋白變異體的dna。經(jīng)使用固定化抗原進(jìn)行多輪親和力純化后，分離單個(gè)噬菌體克隆，并從dna推演出所展示蛋白的氨基酸序列。產(chǎn)生抗體突變體后，可依據(jù)本文教導(dǎo)測(cè)定該分子相對(duì)于親代抗體的生物活性。正如上文指出，這涉及測(cè)定抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物活性或物理性質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，制備一組抗體突變體，篩選其對(duì)抗原的結(jié)合親和力。任選地可對(duì)選自篩選的一個(gè)或多個(gè)抗體突變體進(jìn)行一次或多次另外的生物活性測(cè)定，以確定抗體突變體具有新的或改進(jìn)的性質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體突變體保留了以親代抗體類似或更好/更高的結(jié)合親和力結(jié)合il-4和/或il-13的能力。通常根據(jù)抗體想要的用途，可對(duì)依此選擇的抗體突變體進(jìn)行進(jìn)一步修飾。這類修飾可包括進(jìn)一步改變氨基酸序列，與異源多肽的融合和/或共價(jià)修飾。例如，一般可使用絲氨酸取代未參與維持抗體突變體適宜構(gòu)象的半胱氨酸殘基，以改善該分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。相反，可向抗體加入半胱氨酸以提高穩(wěn)定性(尤其當(dāng)抗體是抗體片段例如fv片段時(shí))。另一類型的抗體突變體具有改變的糖基化模式?？赏ㄟ^(guò)缺失抗體上發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)糖類部分和/或加入一個(gè)或多個(gè)抗體上沒(méi)有的糖基化位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)?？贵w的糖基化一般為n連接到asn或o連接到ser或thr。三肽序列，天冬酰胺-x-絲氨酸和天冬酰胺-x-蘇氨酸是糖類部分經(jīng)酶催化連接到天冬酰胺側(cè)鏈的常見(jiàn)識(shí)別序列，其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸。例如n-乙酰半乳糖胺、半乳糖、巖藻糖或木糖連接到羥基氨基酸，大多數(shù)為絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向原抗體的序列加入或取代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基可增加o-連接糖基化的概率。理想情況下可修飾本發(fā)明所述抗體的效應(yīng)物功能，以增強(qiáng)抗體的效用。例如，可在fc區(qū)引入半胱氨酸殘基，從而在該區(qū)域形成鏈間二硫鍵。依此生成的同型二聚抗體可具有改善的內(nèi)化能力和/或增加的補(bǔ)體-介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷以及抗體依賴的細(xì)胞毒性(adcc)，參見(jiàn)caron等人,jexpmed176:1191-1195(1992)和shopes,immunol148:2918-2922(1993)?；蛘?，可改造具有兩個(gè)fc區(qū)的抗體，因而該抗體可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體裂解和adcc能力，參見(jiàn)stevenson等人,anti-cancerdrugdesign3:219230(1989)?？贵w的共價(jià)修飾涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)合成或通過(guò)抗體的酶切割或化學(xué)切割(若可行)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。通過(guò)抗體的靶向氨基酸殘基與有機(jī)衍生劑發(fā)生反應(yīng)可向抗體分子引入抗體的其它類型共價(jià)修飾，其中有機(jī)衍生劑能夠與所選側(cè)鏈或與n端或c端殘基反應(yīng)。半胱氨酰殘基可與α-鹵代乙酸酯(以及相應(yīng)的胺)例如氯乙酸或氯乙酰胺發(fā)生反應(yīng)，生成羧甲基或羧酰胺甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。還可通過(guò)例如與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸鹽、n-烷基馬來(lái)酰亞胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、p-chloromercuribenzoate、2-chloromercura-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑發(fā)生反應(yīng)，衍化得到半胱氨酰殘基?？赏ㄟ^(guò)與焦碳酸二乙酯在ph5.5-7.0下反應(yīng)衍化得到組氨酰殘基。還可使用對(duì)溴苯酰甲基溴，該反應(yīng)優(yōu)選在ph6.0的0.1m二甲胂酸鈉中進(jìn)行。賴氨酰(lysinyl)和α末端殘基可與琥珀酸或其它羧酸酐發(fā)生反應(yīng)，以逆轉(zhuǎn)殘基的電荷。用于衍化得到含有α-氨基殘基的其它適宜試劑包括亞氨酸酯例如甲基picolinimidate、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、o-甲基異脲和2,4-戊二酮，氨基酸可用乙醛酸被轉(zhuǎn)氨酶催化?？赏ㄟ^(guò)與一種或多種常規(guī)試劑例如苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環(huán)己二酮和茚三酮反應(yīng)來(lái)修飾精氨酰殘基。精氨酸殘基的衍化通常需要堿性反應(yīng)條件。而且，這些試劑可與賴氨酸以及精氨酸的ε-氨基發(fā)生反應(yīng)?？墒褂梅枷阕逯氐衔锘蛩南趸淄檫M(jìn)行酪氨酰殘基的特異修飾。例如，使用n-乙?；溥蚝退南趸淄榉謩e形成o-乙酰酪氨酰種類和3-硝基衍生物。使用125i或131i可碘化酪氨酰殘基以制備用于放射免疫測(cè)定的標(biāo)記蛋白。通過(guò)與碳二亞胺(r-n＝c＝c-r')反應(yīng)，羧基側(cè)鏈基團(tuán)(天冬?；蚬劝滨；?可被修飾，其中r和r'可為不同的烷基，例如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲戊基)碳二亞胺。而且，天冬氨酰和谷氨酰殘基經(jīng)與銨離子反應(yīng)可被轉(zhuǎn)化為天冬酰胺?；凸劝滨０孵；鶜埢?。谷氨酰胺?；吞於０孵；鶜埢Ｔ谥行曰驂A性條件下被脫去酰氨基，分別生成相應(yīng)的谷氨酰和天冬酰殘基。這些殘基脫去酰胺的形式落在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥化、絲氨酰或蘇氨酰殘基的羥基磷酸化、賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈α-氨基的甲基化(creighton,proteins:structureandmolecularproperties,w.h.freeman&co.,sanfrancisco,pp.79-86(1983))、n端胺的乙?；腿我鈉端羧基的酰胺化。另一類型的共價(jià)修飾涉及通過(guò)化學(xué)方式或酶方式將糖苷偶聯(lián)到抗體上。這些方法不需要在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生具有n-連接或o-連接的糖基化能力的抗體。根據(jù)所使用的偶聯(lián)方法，糖可被連接到：(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基；(c)游離硫氫基，例如半胱氨酸的硫氫基；(d)游離羥基，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基；(e)芳香殘基例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香殘基；或(f)谷氨酰胺的酰氨。wo87/05330和aplin&wriston,crccritrevbiochem,pp.259-306(1981)敘述了這類方法?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)或酶方式除去抗體上的任何糖類部分。例如化學(xué)去糖基化需要抗體暴露于化合物三氟甲磺酸或相當(dāng)?shù)幕衔?，從而?dǎo)致除連接糖(n-乙?；咸前坊騨-乙酰基半乳糖胺)以外的大多數(shù)或全部糖的切割，同時(shí)保持抗體的完整性。例如hakimuddin等人,archbiochembiophys259:52(1987)和edge等人,analbiochem118:131(1981)敘述了化學(xué)去糖基化?？赏ㄟ^(guò)例如thotakura等人,methenzymol138:350(1987)所述的許多內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶中的任意實(shí)現(xiàn)抗體上糖類部分的酶切割。另一類型的抗體共價(jià)修飾包括依據(jù)us專利號(hào)4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337所述方式將該抗體連接到許多非蛋白質(zhì)聚合物例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯類(polyoxylalkylene)的一種。獲得突變體或突變蛋白質(zhì)的另一種優(yōu)選技術(shù)是籍噬菌體展示進(jìn)行親和力成熟(hawkins等人,jmolbiol254:889-896(1992)和lowman等人,biochemistry30(45):10832-10838(1991))。簡(jiǎn)而言之，幾個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))被突變以產(chǎn)生每個(gè)位點(diǎn)所有可能的氨基酸取代。依此得到的抗體突變體作為與噬菌體顆粒上的蛋白的融合以單價(jià)形式被展示于噬菌體顆粒上。表現(xiàn)多種突變體的噬菌體可通過(guò)以下循環(huán)：多輪結(jié)合選擇，隨后對(duì)展示出高親和力的突變體而進(jìn)行分離和測(cè)序。選擇新結(jié)合多肽的方法可使用結(jié)構(gòu)相關(guān)多肽的庫(kù)。通過(guò)誘變產(chǎn)生與例如噬菌體外殼蛋白融合的結(jié)構(gòu)相關(guān)多肽的庫(kù)，并將其展示在顆粒表面。隨后這些顆粒與靶分子接觸，將對(duì)靶具有最高親和力的顆粒與具有低親和力的顆粒分離出來(lái)。隨后通過(guò)感染適宜的細(xì)菌宿主擴(kuò)增高親和力的結(jié)合物，并重復(fù)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合步驟。重復(fù)該過(guò)程，直至得到所需親和力的多肽。或者，還可使用多價(jià)噬菌體(mccafferty等人(1990)nature348:552-554和clackson等人(1991)nature352:624-628)來(lái)表達(dá)隨機(jī)點(diǎn)突變(例如籍使用易錯(cuò)dna聚合酶生成)，以生成噬菌體抗體片段的庫(kù)，并隨后篩選該庫(kù)對(duì)il-4和/或il-13的親和力(hawkins等人(1992)jmolbiol254:889-896)。優(yōu)選情況下，在親和力成熟過(guò)程中，可復(fù)制的表達(dá)載體處于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的嚴(yán)密調(diào)控下，調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件使得展示一個(gè)以上融合蛋白拷貝的顆粒的量或數(shù)目小于約1％。同樣在優(yōu)選情況下，展示一個(gè)以上融合蛋白拷貝的顆粒的量小于展示單個(gè)融合蛋白拷貝的顆粒量的10％。優(yōu)選情況下該量小于20％。通過(guò)互換構(gòu)架區(qū)或源自多個(gè)抗體的復(fù)合fr內(nèi)不同抗體鏈的不同cdr，可產(chǎn)生功能等效物。因此，例如，對(duì)于一組給定的cdrs而言，通過(guò)取代不同的重鏈例如igg1-4,、igm、iga1-2或igd，不同種類的抗體有可能生成不同的il-4和/或il-13抗體類型和同種型。與之類似，通過(guò)將一組給定cdrs包埋入整個(gè)合成的構(gòu)架區(qū)內(nèi)，可產(chǎn)生位于本發(fā)明范圍內(nèi)的人工抗體。本發(fā)明的抗體片段和功能等效物包括其特異結(jié)合il-4和/或il-13的程度可被檢測(cè)的分子。結(jié)合的可檢測(cè)程度包括目的抗體結(jié)合能力的至少10-100％范圍內(nèi)的所有值，優(yōu)選為至少50％、60％或70％，更優(yōu)選為至少75％、80％、85％、90％、95％或99％。具有大于目的抗體100％親和力的等效物也包括在內(nèi)。一般cdrs對(duì)于表位識(shí)別和抗體結(jié)合是重要的。但是，可對(duì)包含cdrs的殘基進(jìn)行變動(dòng)，而不干擾抗體識(shí)別和結(jié)合關(guān)聯(lián)表位的能力。例如，可進(jìn)行不影響表位識(shí)別但卻增加抗體對(duì)表位的結(jié)合親和力的變動(dòng)?；趯?duì)主要抗體序列的了解，幾項(xiàng)研究調(diào)查了向抗體序列多個(gè)位點(diǎn)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸變動(dòng)后對(duì)抗體性質(zhì)的效應(yīng)，例如結(jié)合和表達(dá)水平(yang等人,1995,jmolbiol254:392-403；rader等人,1998,procnatlacadsciusa95:8910-8915；和vaughan等人,1998,naturebiotechnology16,535-539)。因此，使用諸如寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變、盒誘變、易錯(cuò)pcr、dna改組或大腸桿菌的突變株等方法改變cdr1、cdr2或cdr3或構(gòu)架區(qū)中的重鏈和輕鏈基因的序列，可生成目的抗體的等效物(vaughan等人,1998,natbiotech16:535-539；和adey等人,1996,chap.16,pp.277-291,inphagedisplayofpeptidesandproteins,eds.kay等人,academicpress)。改變初級(jí)抗體核酸序列的方法可導(dǎo)致抗體的親和力提高(gram等人,1992,procnatlacadsciusa89:3576-3580；boder等人,2000,procnatlacadsciusa97:10701-10705；davies&riechmann,1996,immunotech2:169-179；thompson等人,1996,jmolbiol256:77-88；short等人,2002,jbiolchem277:16365-16370；和furukawa等人,2001,jbiolchem276:27622-27628)。通過(guò)例如選擇歷經(jīng)多輪選擇而選擇的多個(gè)氨基酸變化，可使用重復(fù)數(shù)輪的"多肽選擇"以選擇越來(lái)越高的親和力結(jié)合。第一輪選擇后可對(duì)配體的其它區(qū)域或氨基酸進(jìn)行其它輪的選擇，其中第一輪選擇涉及配體或抗體多肽的氨基酸選擇的首個(gè)區(qū)域。重復(fù)多輪選擇，直到實(shí)現(xiàn)所需的親和力性質(zhì)。改良抗體還包括具有改良特征的抗體，它們籍動(dòng)物免疫、雜交瘤形成和選擇具有特異特征的抗體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)而制備。"拮抗劑"系指能夠抑制靶分子一種或多種生物活性(例如籍il-4和/或il-13的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))的分子。拮抗劑通過(guò)滅活或殺滅被配體活化的細(xì)胞和/或干擾受體或配體活化(例如酪氨酸激酶活化)或配體結(jié)合到受體后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可干擾受體結(jié)合到配體且反之亦然。所述拮抗劑可完全阻斷受體-配體的相互作用，或?qū)嵸|(zhì)降低這種相互作用。"激動(dòng)劑"系指包括活化il-4和/或il-13一種或多種生物活性的蛋白質(zhì)、多肽、肽、抗體、抗體片段、綴合物、大分子、小分子的化合物。激動(dòng)劑可通過(guò)作為被配體活化的細(xì)胞的促分裂原作用和/或通過(guò)在配體結(jié)合到受體后干擾細(xì)胞失活或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制，從而與受體對(duì)配體的結(jié)合相互作用，反之亦然。出于本發(fā)明的目的，激動(dòng)劑的所有此類干涉位置均被視為相當(dāng)?shù)?。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"和"細(xì)胞培養(yǎng)物"包括它們的后代。還應(yīng)理解，由于有意或無(wú)意的突變，所有的后代不一定精確相同，例如在dna含量上。包括具有相同目的功能或生物性質(zhì)的變體后代，其中目的功能或生物性質(zhì)為針對(duì)原始細(xì)胞進(jìn)行篩選。術(shù)語(yǔ)"載體"意為核酸建構(gòu)體、載體，其含有核酸、轉(zhuǎn)基因、外源基因或目的基因，它們被有效地連接到適宜的調(diào)控序列以在適宜的宿主內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。這類調(diào)控序列包括例如影響轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、控制轉(zhuǎn)錄的任選操縱子序列、編碼適宜mrna核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體可為質(zhì)粒、噬菌體顆?；騼H僅是潛在的基因組插入物。一旦被轉(zhuǎn)化到適宜的宿主體內(nèi)，載體可獨(dú)立于宿主的基因組進(jìn)行復(fù)制和發(fā)揮功能，或在某些情形下可整合到宿主細(xì)胞的基因組上。在本說(shuō)明書(shū)中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體常見(jiàn)的使用形式。但是，本發(fā)明旨在包括發(fā)揮等效載體功能的此類其它形式的載體，它們?yōu)榛蛘秊楸绢I(lǐng)域所知曉，例如病毒、攜帶核酸的合成分子、脂質(zhì)體等。就治療目的而言"哺乳動(dòng)物"系指可被歸類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，其包括人、家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和動(dòng)物園動(dòng)物、競(jìng)技動(dòng)物或?qū)櫸?，例如狗、馬、貓、牛等?？稍诒疚乃龌虮绢I(lǐng)域知曉的測(cè)定中篩選或使用目的抗體。這類測(cè)定通常需要可檢測(cè)如被標(biāo)記的試劑。本文所使用的詞語(yǔ)"標(biāo)記"系指可直接或間接綴合到分子或蛋白例如抗體上的可檢測(cè)化合物或組合物。標(biāo)記可本身為可檢測(cè)的(例如放射性同位素標(biāo)記、顆粒或熒光標(biāo)記)，或就酶標(biāo)記而言可催化能被檢測(cè)的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。正如本文所使用，"固相"意為實(shí)體或分子例如本發(fā)明所述抗體可粘附其上的非水基質(zhì)。本文所包括的固相實(shí)例包括部分或全部由玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷形成的固相。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)上下文，所述固相可包括測(cè)定板的孔；在其它情況下可用于純化柱(例如親和力層析柱)。因此，所述固相可以是紙、珠、塑料、芯片等，可從許多材料例如硝化纖維素、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、硅等制備，還可采取許多構(gòu)象。依據(jù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法且例如參見(jiàn)下文，本領(lǐng)域業(yè)已知曉編碼il-4和il-13的基因或cdna，它們可被克隆到質(zhì)粒或其它表達(dá)載體，并在眾多表達(dá)體系的任意一種中進(jìn)行表達(dá)。編碼氨基酸序列突變體的核酸序列可通過(guò)許多本領(lǐng)域知曉的方法進(jìn)行制備。這些方法包括但不限于先前制備的目的分子的突變體或非突變體形式的寡核苷酸-介導(dǎo)(或定點(diǎn))誘變、pcr誘變和盒誘變(參見(jiàn)例如kunkel,procnatlacadsciusa82:488(1985))。本發(fā)明抗體或其片段、衍生物或類似物(例如本發(fā)明抗體的重鏈或輕鏈、本發(fā)明的單鏈抗體或本發(fā)明的抗體突變蛋白質(zhì))的重組表達(dá)包括構(gòu)建含有編碼本文所述的抗體或抗體片段的多核苷酸的表達(dá)載體。一旦獲得編碼抗體分子的多核苷酸，可通過(guò)本領(lǐng)域知曉的重組dna技術(shù)產(chǎn)生用于生產(chǎn)所述抗體的載體。構(gòu)建含有抗體編碼序列和適宜轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組dna技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組。通過(guò)常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞體內(nèi)，隨后通過(guò)常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或片段。在本發(fā)明的一個(gè)方面，編碼重鏈和輕鏈的載體可在宿主細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)，以表達(dá)本文詳述的整個(gè)免疫球蛋白分子?？墒褂迷S多宿主/表達(dá)載體體系來(lái)表達(dá)本發(fā)明的抗體分子。這些表達(dá)體系不僅代表可產(chǎn)生和隨后純化目的編碼序列的運(yùn)載體(vehicle)，還代表了以適宜核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)可原位表達(dá)本發(fā)明抗體分子的細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌和真核細(xì)胞常用于重組抗體分子的表達(dá)，尤其是用于全長(zhǎng)重組抗體分子的表達(dá)。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如cho細(xì)胞與例如攜帶來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的主要中間體即時(shí)早期基因啟動(dòng)子元件的載體的載體聯(lián)合是抗體的有效表達(dá)體系(foecking等人,gene45:101(1986)；和cockett等人,bio/technology8:2(1990))。正如本領(lǐng)域所知曉，還可使用植物和植物細(xì)胞培養(yǎng)物、昆蟲(chóng)細(xì)胞等來(lái)生產(chǎn)目的蛋白。此外，選擇可調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)或以所需的特異方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。蛋白產(chǎn)物的這些修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對(duì)于蛋白功能可能是重要的。不同的宿主細(xì)胞具有蛋白質(zhì)及基因產(chǎn)物翻譯后加工和修飾的性質(zhì)和特異機(jī)制?？蛇x擇適宜的細(xì)胞系或宿主體系，以確保所表達(dá)的目的抗體的正確修飾和加工。因此，可使用擁有用于主要轉(zhuǎn)錄物適宜加工、基因產(chǎn)物糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。這些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于cho、cos、293、3t3或骨髓瘤細(xì)胞。穩(wěn)定表達(dá)對(duì)于長(zhǎng)期高產(chǎn)率生產(chǎn)重組蛋白而言是優(yōu)選的。例如可改造穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。與其使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，不如使用受適宜表達(dá)調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸位點(diǎn)等)調(diào)控的dna和選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。引入外來(lái)dna后，可讓改造細(xì)胞在富集培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1至2天，隨后將其轉(zhuǎn)移至選擇性培養(yǎng)基上。重組質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記賦予對(duì)選擇的抗性，使得細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定整合到染色體上，并擴(kuò)展成細(xì)胞系。這些改造的細(xì)胞系不僅可用于抗體制備，還可用于篩選和評(píng)估直接或間接與抗體分子相互作用的化合物。可使用許多選擇體系，其分別包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(wigler等人,cell11:223(1977))、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(szybalska等人,procnatlacadsciusa48:202(1992))、谷氨酸合成酶在甲硫氨酸砜亞胺的存在下選擇(advdrugdelrev58,671,2006并參看lonzagroupltd.的網(wǎng)站或文獻(xiàn))以及tk、hgprt或aprt細(xì)胞中的腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(lowy等人,cell22:817(1980))。同樣，可使用抗代謝物抗性作為選擇下列基因的基礎(chǔ)：dhfr，其賦予甲胺蝶呤抗性(wigler等人,procnatlacadsciusa77:357(1980)；o'hare等人,procnatlacadsciusa78:1527(1981))；gpt，其賦予霉酚酸抗性(mulligan等人,procnatlacadsciusa78:2072(1981))；neo，其賦予氨基糖苷g-418抗性(wu等人,biotherapy3:87(1991))；以及hygro，其賦予潮霉素抗性(santerre等人,gene30:147(1984))?？沙Ｒ?guī)應(yīng)用重組dna
技術(shù)領(lǐng)域：
知曉的方法來(lái)選擇所需的重組克隆，這些方法的描述見(jiàn)于例如ausubel等人,eds.,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons(1993)；kriegler,genetransferandexpression,alaboratorymanual,stocktonpress(1990)；dracopoli等人,eds.,currentprotocolsinhumangenetics,johnwiley&sons(1994)；和colberre-garapin等人,jmolbiol150:1(1981)。通過(guò)載體擴(kuò)增可增加抗體分子的表達(dá)水平(例如參見(jiàn)bebbington等人,dnacloning,vol.3.academicpress(1987))。當(dāng)表達(dá)抗體的載體體系中的標(biāo)記物可擴(kuò)增時(shí)，培養(yǎng)物中抑制劑水平的升高會(huì)增加標(biāo)記物基因的拷貝數(shù)目。由于被擴(kuò)增區(qū)域與抗體基因有關(guān)聯(lián)，抗體的產(chǎn)生也會(huì)上升(crouse等人,molcellbiol3:257(1983))。可使用本發(fā)明的兩種或更多表達(dá)載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，例如第一載體編碼源自重鏈的多肽，而第二載體編碼源自輕鏈的多肽。這兩個(gè)載體可含有相同的選擇標(biāo)記物，這些標(biāo)記物可使重鏈和輕鏈多肽的表達(dá)相同?；蛘?，可使用編碼并可表達(dá)重鏈和輕鏈多肽的單個(gè)載體。在這種情況下，輕鏈應(yīng)置于重鏈之前，以避免產(chǎn)生過(guò)多不含毒性的重鏈(proudfoot,nature322:52(1986)；和kohler,procnatlacadsciusa77:2197(1980))。重鏈和輕鏈的編碼序列可包括cdna或基因組dna。一旦通過(guò)動(dòng)物、化學(xué)合成或重組表達(dá)產(chǎn)生本發(fā)明的抗體分子，可通過(guò)本領(lǐng)域知曉的任何純化免疫球蛋白分子的方法例如層析(例如離子交換、親和層析等，尤其是經(jīng)蛋白質(zhì)a和大小排阻層析后對(duì)il-4和/或il-13的親和層析)、離心、差異溶解度或通過(guò)蛋白純化的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化抗體分子。此外，本發(fā)明所述抗體或抗體片段可被融合到本文所述的異源多肽序列或本領(lǐng)域知曉的其它多肽序列，以便于純化。可通過(guò)本領(lǐng)域知曉的任何適宜方法生成本發(fā)明所述抗體。本發(fā)明所述抗體可包括多克隆抗體，盡管由于抗體修飾以優(yōu)化其在人體內(nèi)的使用以及優(yōu)化抗體本身的使用，但單克隆抗體仍是優(yōu)選的，這是因其生產(chǎn)和操縱特定蛋白方便。制備多克隆抗體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉(harlow等人,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,2nded.(1988))。本發(fā)明所述抗體優(yōu)選包括單克隆抗體?？墒褂秒s交瘤技術(shù)例如由kohler等人,nature256:495(1975)；us專利號(hào)4,376,110；harlow等人,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,2nded.(1988)和hammerling等人,monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas,elsevier(1981)描述的、重組dna方法例如制備和使用轉(zhuǎn)染瘤的方法或?yàn)榧夹g(shù)人員知曉的其它方法制備單克隆抗體?？捎糜诋a(chǎn)生單克隆抗體的方法的其它實(shí)例包括但不限于人b細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(kosbor等人,immunologytoday4:72(1983)；和cole等人,procnatlacadsciusa80:2026(1983))和ebv-雜交瘤技術(shù)(cole等人，monoclonalantibodiesandcancertherapy,pp.77-96,alanr.liss(1985))。這些抗體可為包括igg、igm、ige、iga和igd的任何免疫球蛋白類別和其任何亞類的抗體?？稍隗w外或體內(nèi)培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明mab的雜交瘤。在雜交瘤模型中，對(duì)宿主例如小鼠、人源化小鼠、攜帶人免疫系統(tǒng)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠、倉(cāng)鼠、兔、大鼠、駱駝或其它任何適宜的宿主動(dòng)物進(jìn)行免疫，以引發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異結(jié)合il-4或il-13的抗體的淋巴細(xì)胞?？蛇x地，在體外免疫籬笆細(xì)胞。使用適宜的融合劑例如聚乙二醇使淋巴細(xì)胞隨后與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice,academicpress,pp.59-103(1986))。一般而言，制備產(chǎn)生抗體的雜交瘤時(shí)，如需要人來(lái)源細(xì)胞時(shí)可使用外周血淋巴細(xì)胞("pbl")，或如需要非人哺乳動(dòng)物來(lái)源時(shí)則可使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。永生細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是嚙齒類、?；蛉藖?lái)源的骨髓瘤細(xì)胞。一般使用大鼠或小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系?？稍谶m宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，該培養(yǎng)基優(yōu)選含有可抑制未融合的永生細(xì)胞的生長(zhǎng)或生存的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親代細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hgprt或hprt)，用于雜交瘤的培養(yǎng)基一般會(huì)含有次黃嘌呤、氨蝶呤和胸苷("hat培養(yǎng)基")，它們是防止缺乏hgprt的細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。優(yōu)選的永生細(xì)胞系是有效融合并支持所選擇的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞穩(wěn)定高水平產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系，它們對(duì)培養(yǎng)基例如hat培養(yǎng)基敏感。這些骨髓瘤細(xì)胞系中有鼠骨髓瘤系，例如源自可從salkinstitutecelldistributioncenter,sandiego,calif獲得的mopc-21和mpc-11小鼠腫瘤和可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection),manassas,va獲得的sp2/0、fo或x63-ag8-653細(xì)胞的細(xì)胞系。還描述了人骨髓瘤和小鼠-人異骨髓瘤(heteromyeloma)細(xì)胞系用于產(chǎn)生人單克隆抗體(kozbor,jimmunol133:3001(1984)；和brodeur等人,monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,marceldekker,inc,pp.51-63(1987))。51-63(1987))。還可使用小鼠骨髓瘤細(xì)胞系nso(europeancollectionofcellcultures,salisbury,wilshire,uk)。另外一種選擇是使用電融合而非化學(xué)融合來(lái)形成雜交瘤。不使用融合，而是使用例如epsteinbarr病毒或其它轉(zhuǎn)化基因來(lái)永生化b細(xì)胞，例如參見(jiàn)zurawaki等人,monoclonalantibodies,編輯，kennett等人,plenumpress,pp.19-33.(1980)。19-33.(1980)。還可使用表達(dá)免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠和移植有人b淋巴細(xì)胞的重癥聯(lián)合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficient，scid)小鼠。測(cè)定生長(zhǎng)有雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中的針對(duì)il-4和/或il-13的單克隆抗體的產(chǎn)生?？赏ㄟ^(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定例如放射免疫測(cè)定(ria)、熒光細(xì)胞測(cè)量分析(flluorocytometricanalysis,facs)或酶連接免疫吸附測(cè)定(elisa)測(cè)定雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。這些技術(shù)為本領(lǐng)域知曉，并在技術(shù)人員的技藝范圍之內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)例如scatchard分析(munson等人,analbiochem107:220(1980))測(cè)定單克隆抗體對(duì)il-4和/或il-13的結(jié)合親和力。鑒定產(chǎn)生所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，這些克隆可通過(guò)有限稀釋方法進(jìn)行亞克隆，并按標(biāo)準(zhǔn)方法(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice,academicpress,pp.59-103(1986)進(jìn)行培養(yǎng)。適宜的培養(yǎng)基包括例如dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(d-mem)或rpmi-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可作為腹水腫瘤在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化方法例如蛋白質(zhì)a-sepharose、蛋白質(zhì)g-sepharose、羥磷灰石層析、凝膠排阻層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水液體或血清中適宜分開(kāi)或分離出經(jīng)亞克隆分泌的單克隆抗體。本領(lǐng)域存在許多用于產(chǎn)生單克隆抗體的方法，因此本發(fā)明不局限于它們僅在雜交瘤中的制備。例如，可通過(guò)重組dna方法例如us專利號(hào)4,816,567所述方法制備單克隆抗體。在這種情況下，術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"系指源自單個(gè)真核生物、噬菌體或原核生物克隆的抗體。使用常規(guī)方法(例如使用可特異結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈或來(lái)自人、人源化或其它來(lái)源的此類鏈的基因的寡核苷酸探針)可輕易分離和測(cè)序編碼本發(fā)明所述單克隆抗體的dna(innis等人,pcrprotocols.aguidetomethodsandapplications,academic(1990)和sanger等人,procnatlacadsci74:5463(1977))。雜交瘤細(xì)胞作為這類dna的來(lái)源。一旦分離，所述dna可被置于表達(dá)載體中，隨后該表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染到本來(lái)不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞、nso細(xì)胞、cos細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中，以在重組的宿主細(xì)胞體內(nèi)獲得單克隆抗體的合成。還可通過(guò)例如用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列取代同源鼠序列(us專利號(hào)4,816,567；和morrison等人,procnatlacadsciusa81:6851(1984))或通過(guò)將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價(jià)結(jié)合到免疫球蛋白編碼序列，從而對(duì)所述dna進(jìn)行修飾。這些非免疫球蛋白多肽可被替換為本發(fā)明抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或可被替換為本發(fā)明抗體的一個(gè)il-4或il-13結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域，以形成嵌合的二價(jià)抗體。這些抗體可為單價(jià)抗體。用于制備單價(jià)抗體的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾重鏈的重組表達(dá)。重鏈一般在fc區(qū)的任意位置被截短，以防止重鏈交聯(lián)。或者，相關(guān)半胱氨酸殘基可被另一氨基酸殘基取代或被缺失，以防止交聯(lián)?？赏ㄟ^(guò)已知技術(shù)生成識(shí)別特異表位的抗體片段。傳統(tǒng)上通過(guò)完整抗體的蛋白水解消化得到這些片段(例如參見(jiàn)morimoto等人,jbiochembiophysmethods24:107(1992)；和brennan等人,science229:81(1985))。例如使用酶如木瓜酶(產(chǎn)生fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生f(ab')2片段)對(duì)免疫球蛋白分子進(jìn)行蛋白水解切割，可產(chǎn)生本發(fā)明的fab和f(ab')2片段。f(ab')2片段含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的ch1結(jié)構(gòu)域。但是可直接通過(guò)重組的宿主細(xì)胞產(chǎn)生這些片段。例如，抗體片段可從抗體噬菌體庫(kù)分離得到?；蛘撸琭(ab')2-sh片段可直接從大腸桿菌中回收并籍化學(xué)方式偶聯(lián)形成f(ab’)2片段(carter等人,bio/technology10:163(1992)。根據(jù)另一方法，f(ab’)2片段可直接從重組的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離得到。產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈fv片段(fv)(wo93/16185)。對(duì)于某些用途包括人體內(nèi)使用抗體和體外檢測(cè)測(cè)定而言，可優(yōu)選使用嵌合的、人源化或人抗體。產(chǎn)生嵌合抗體的方法為本領(lǐng)域所知曉，例如參見(jiàn)morrison,science229:1202(1985)；oi等人,biotechniques4:214(1986)；gillies等人,jimmunolmethods125:191(1989)；和us專利號(hào)5,807,715；4,816,567以及4,816,397。人源化抗體源自在非人物種體內(nèi)生成的可結(jié)合il-4和/或il-13的抗體分子，其中來(lái)自其的一個(gè)或多個(gè)cdrs被插入到來(lái)自人免疫球蛋白分子的fr區(qū)。使用許多本領(lǐng)域知曉的多種技術(shù)例如cdr移植(epo239,400；wo91/09967；和us專利號(hào)5,225,539；5,530,101；以及5,585,089),貼面或表面重塑(epo592,106；epo519,596；padlan,molecularimmunology28:489(1991)；studnicka等人,proteinengineering7:805(1994)；和roguska等人,procnatlacadsciusa91:969(1994)),以及鏈改組(us專利號(hào)5,565,332)可人源化抗體。人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人的氨基酸殘基通常被稱作"導(dǎo)入"殘基，它們一般取自"導(dǎo)入"的可變結(jié)構(gòu)域。依據(jù)winter及其同事等人的方法(jones等人,nature321:522(1986)；riechmann等人,nature332:323(1988)和verhoeyen等人,science239:1534(1988))通過(guò)以非人的cdr或cdrs序列的部分替換人抗體的相應(yīng)序列，可基本上進(jìn)行人源化。因此，這些"人源化"抗體是嵌合抗體(us專利號(hào)4,816,567)，其中實(shí)質(zhì)小于完整人可變結(jié)構(gòu)域的序列已被來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列所取代。實(shí)踐中，人源化抗體一般是人抗體，其中一些cdrs殘基和可能的一些fr殘基被嚙齒類動(dòng)物抗體的類似位點(diǎn)所取代。重鏈恒定區(qū)和鉸接區(qū)可來(lái)自任何類別或亞類以獲得需要的效果，如一個(gè)特定的效應(yīng)物功能。通常，人構(gòu)架區(qū)的構(gòu)架殘基可被來(lái)自cdr供體抗體的相應(yīng)殘基取代，從而改變并有可能提高抗原結(jié)合。構(gòu)架取代可籍本領(lǐng)域知曉方法進(jìn)行鑒定，例如經(jīng)建立cdr與構(gòu)架殘基相互作用的模型來(lái)鑒定對(duì)于抗原結(jié)合的重要構(gòu)架殘基，以及經(jīng)序列比較以鑒定特定位置處的異常構(gòu)架殘基，例如參閱us專利號(hào)5,585,089和riechmann等人,nature332:323(1988)。更優(yōu)選地，人源化抗體保留對(duì)il-4和/或il-13的高親和力，并且保留或獲得其它有利的生物性質(zhì)。因此，利用親代序列和人源化序列的三維模型，通過(guò)分析親代序列和多種概念性人源化產(chǎn)物的方法，制備成人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通?？蔀楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員利用和熟知?？色@得說(shuō)明和展示所選擇候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。檢查此展示允許分析某些殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合il-4和/或il-13能力的殘基。籍此種方式，可從接收和導(dǎo)入序列選擇和合并fr殘基，使得所需抗體特性得到最大化，例如增加的對(duì)靶抗原的親和力，盡管是cdr殘基直接并最實(shí)質(zhì)性地影響il-4和/或il-13結(jié)合。還可修飾cdr區(qū)域，使其含有一個(gè)或多個(gè)與得自親代抗體(cdr得自該親代抗體)氨基酸不同的氨基酸，以提供增強(qiáng)或不同的目的性質(zhì)，例如更大的親和力或更大的親合力(avidity)的結(jié)合。可操縱和改變抗體恒定區(qū)的某些部分，以提供具有不同與或優(yōu)于親代抗體中觀察到性質(zhì)的抗體同源物、衍生物、片段等。因此，例如許多igg4抗體在鉸鏈區(qū)附近形成鏈內(nèi)二硫鍵。鏈內(nèi)鍵可使親代雙價(jià)分子變得不穩(wěn)定，形成含有重鏈及與之相連輕鏈的單價(jià)分子。這類分子可重新結(jié)合，但為隨機(jī)結(jié)合。經(jīng)觀察，修飾igg4分子鉸鏈區(qū)的氨基酸可降低鏈內(nèi)鍵形成的幾率，從而穩(wěn)定igg4分子，這將最小化雙特異性分子形成的幾率。若治療用抗體是igg4分子，這種修飾則是有利的，這是因?yàn)榉€(wěn)定性增強(qiáng)可將最小化分子在生產(chǎn)和制備過(guò)程中以及在體內(nèi)的解離幾率。單價(jià)抗體可能沒(méi)有與雙價(jià)親代分子相同的有效性。例如，當(dāng)將雙價(jià)igg4施用患者時(shí)，雙價(jià)igg4的百分比在兩周內(nèi)衰變?yōu)榧s30％。228位的氨基酸取代增強(qiáng)了igg4穩(wěn)定性。位于228位的絲氨酸可為另一氨基酸替換，例如其余19種氨基酸中的一種。尤其可對(duì)重組抗體作出這種變動(dòng)，其中核酸編碼序列經(jīng)突變可得到228位處的氨基酸替換。例如s可被替換為脯氨酸。另一組適合修飾的氨基酸包括鉸鏈區(qū)域的氨基酸，這些氨基酸影響含有重鏈的分子與fc受體之間的結(jié)合和被結(jié)合抗體的內(nèi)化。這類氨基酸包括igg1分子中從約233至約237的殘基(glu-leu-leu-gly-gly)(seqidno:49)中；從約252至約256的殘基(met-ile-ser-arg-thr)(seqidno:50)和從約318(glu)至約331(pro)的殘基，例如包括lys320、lys322和pro329。完全人抗體是人患者的治療性治療所特別希望的。可籍許多本領(lǐng)域知曉的方法制備人抗體，其中包括利用源自人免疫球蛋白序列的抗體文庫(kù)而進(jìn)行的上述噬菌體展示方法，參閱us專利號(hào)4,444,887和4,716,111；和wo98/46645,wo98/50433,wo98/24893,wo98/16654,wo96/34096,wo96/33735和wo91/10741。還可利用cole等人和boerder等人的技術(shù)制備人單克隆抗體(cole等人,monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss(1985)；和boerner等人,jimmunol147:86(1991))。還可使用轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)人抗體，這些小鼠不能表達(dá)有功能的內(nèi)源免疫球蛋白，但也表達(dá)某些人免疫球蛋白基因。例如，可籍隨機(jī)方式或同源重組將人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合物引入到小鼠的胚胎干細(xì)胞。或者，除了人重鏈和輕鏈基因以外，可將人的可變區(qū)、恒定區(qū)和多變區(qū)引入到小鼠胚胎干細(xì)胞中。通過(guò)同源重組引入人免疫球蛋白基因座，可使小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因分別或同時(shí)失去功能。具體而言，jh區(qū)的純合缺失可防止內(nèi)源抗體生成。被修飾的胚胎干細(xì)胞被擴(kuò)展并被顯微注射到胚泡中，形成嵌合小鼠。隨后繁育嵌合小鼠，產(chǎn)生表達(dá)人抗體的純合后代，例如參閱jakobovitis等人,procnatlacadsciusa90:2551(1993)；jakobovitis等人,nature362:255(1993)；bruggermann等人,yearinimmunol7:33(1993)；和duchosal等人,nature355:258(1992))。轉(zhuǎn)基因小鼠按正常方式用il-4或il-13細(xì)胞因子如il-4或il-13的全部或部份進(jìn)行免疫。利用常規(guī)雜交瘤技術(shù)可從免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠得到抗il-4和il-13的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠所攜帶的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在b細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)生重排，隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因此，利用這種技術(shù)有可能產(chǎn)生治療用的igg、iga、igm和ige抗體。若欲了解概況，可參閱lonberg等人,intrevimmunol13:65-93(1995)。對(duì)于對(duì)生產(chǎn)人抗體和人單克隆抗體以及生產(chǎn)這類抗體的方案的討論，可參閱例如wo98/24893；wo92/01047；wo96/34096；和wo96/33735；epono.0598877；和us專利號(hào)5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771以及5,939,598.此外，例如amgen(fremont,ca)、genpharm(sanjose,ca)和medarex,inc.(princeton,nj)等公司利用與上述類似的技術(shù)可從事抗il-4和/或il-13人抗體的提供。同樣，可免疫移植有人外周血白細(xì)胞、脾細(xì)胞或骨髓(例如以色列xtlbiopharmaceuticals公司的三源雜交瘤技術(shù))的小鼠，制備人mabs?？衫帽环Q為"導(dǎo)向選擇"的技術(shù)生成識(shí)別所選擇表位的完全人抗體。在該方法中，使用經(jīng)選擇的非人單克隆抗體如小鼠抗體來(lái)引導(dǎo)識(shí)別相同表位的完全人抗體的選擇(jespers等人,bio/technology12:899(1988))。使用重組技術(shù)時(shí)，抗體變異體可在細(xì)胞內(nèi)、周質(zhì)空間內(nèi)產(chǎn)生，或直接被分泌到培養(yǎng)基中。如果抗體變異體是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的，則第一步，例如通過(guò)離心或超濾除去微小碎片，其或是宿主細(xì)胞或是被裂解的片段。carter等人,bio/technology10:163(1992)描述了一種分離被分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的方法。簡(jiǎn)而言之，細(xì)胞漿與乙酸鈉(ph3.5)和edta接觸?？赏ㄟ^(guò)離心除去細(xì)胞碎片。當(dāng)抗體變異體被分泌到培養(yǎng)基中時(shí)，一般首先利用市售蛋白質(zhì)濃縮過(guò)濾器如amicon或milliporepellicon的超濾組件濃縮來(lái)自這些表達(dá)體系的上清液?？杉尤氲鞍酌敢种苿├鏿msf以抑制蛋白酶解，還可加入抗生素以防止外來(lái)污染物的生長(zhǎng)?？墒褂美缌u磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析純化從細(xì)胞制備的抗體組合物。蛋白質(zhì)a或蛋白質(zhì)g是否適合作為親和配體取決于抗體變異體上任意免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型?？墒褂玫鞍踪|(zhì)a純化基于人igg1、igg2或igg4重鏈的抗體(lindmark等人,jimmunolmeth62:1(1983))?？墒褂玫鞍踪|(zhì)g用于小鼠同種型和人igg3(guss等人,emboj5:1567(1986))。親和配體所結(jié)合的基質(zhì)最常見(jiàn)是瓊脂糖，但也可使用其它基質(zhì)。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)例如可控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯可允許比瓊脂糖所實(shí)現(xiàn)的更快的流速和更短的處理時(shí)間。當(dāng)抗體變異體包括ch3結(jié)構(gòu)域時(shí)，可使用bakerbondabxtm樹(shù)脂(jtbaker；phillipsburg,nj)進(jìn)行純化。還可利用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)，例如離子交換柱分級(jí)分離、乙醇沉淀、反相hplc、二氧化硅上的層析、肝素瓊脂糖上的層析、陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上的層析(例如多聚天冬氨酸柱)、色譜聚焦、sds-page和硫酸銨沉淀，這取決于待回收的抗體或變異體。進(jìn)行任何初步純化步驟后，含有目的抗體或目的變異體和污染物的混合物可進(jìn)行低ph疏水相互作用層析，其中使用ph約2.5-4.5的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(例如約0-0.25m鹽)下進(jìn)行。本發(fā)明的抗體可為雙特異性抗體。雙特異性抗體可為單克隆抗體，優(yōu)選為具有至少兩種不同抗原結(jié)合特異性的人或人源化抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙特異抗體、其片段等等對(duì)il-4和il-13具有結(jié)合特異性。生產(chǎn)雙特異性抗體的方法是眾所周知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)是基于兩個(gè)免疫球蛋白重鏈/輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中兩條重鏈具有不同的特異性(milstein等人,nature305:537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，雜交瘤(細(xì)胞雜交瘤(quadroma))產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中僅有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親和層析步驟進(jìn)行正確分子的純化。類似方法披露于wo93/08829和traunecker等人,emboj10:3655(1991)。例如kufer等人,trendsbiotech22:238-244,2004提供了生產(chǎn)雙特異性抗體的其它方法?？蓪⒕哂兴杞Y(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域融合到免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域序列上。優(yōu)選yu包括至少部分鉸鏈區(qū)、ch2和ch3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合。它可具有首個(gè)重鏈恒定區(qū)(ch1)，其含有至少在一個(gè)融合中出現(xiàn)的輕鏈結(jié)合所需的位點(diǎn)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合區(qū)和免疫球蛋白輕鏈(若需要)的dnas插入到不同的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)化到適宜的宿主生物體內(nèi)。對(duì)于產(chǎn)生雙特異性抗體的更多細(xì)節(jié)，可參閱例如suresh等人,methenzym121:210(1986)。本發(fā)明也考慮了異綴合物抗體。異綴合物抗體由兩個(gè)共價(jià)鍵連接的抗體組成。已經(jīng)建議例如用這類抗體靶向免疫系統(tǒng)細(xì)胞至不想要的細(xì)胞(us專利號(hào)4,676,980)。考慮，該抗體可用合成蛋白化學(xué)的已知方法在體外制備，包括涉及交聯(lián)劑的那些方法。例如，免疫毒素可用二硫化物交換反應(yīng)或形成硫酯鍵的方式來(lái)構(gòu)建。適合于該目的之試劑的例子包括iminothiolate)和甲基-4-mercaptobutyrimidate，以及如us專利號(hào)4,676,980中所披露的那些。此外，可以產(chǎn)生il-4和/或il-13的單結(jié)構(gòu)域抗體。這種技術(shù)的某些例子，已在wo9425591談及源自駱駝科重鏈ig的抗體時(shí)有所敘述，以及在us20030130496談及從噬菌體文庫(kù)分離單結(jié)構(gòu)域全人抗體時(shí)也有所敘述?？蛇x地，某些描述用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(us專利號(hào)4,946,778；bird,science242:423(1988)；huston等人,procnatlacadsciusa85:5879(1988)；以及ward,等人,nature334:544(1989))也可適應(yīng)于生產(chǎn)單鏈抗體。單鏈抗體是通過(guò)將fv域的重鏈和輕鏈片段以氨基酸橋連接生成單鏈多肽而形成的。大腸桿菌中的功能fv片段的組裝技術(shù)也可以利用(skerra等人,science242:1038(1988))。本發(fā)明包括了以重組方式與多肽融合或化學(xué)綴合(包括共價(jià)和非共價(jià)綴合)的抗體。本發(fā)明的融合或輟合的抗體可用于簡(jiǎn)化純化，參閱例如wo93/21232；ep439,095；naramura等人,immunollett39:91(1994)；us專利號(hào)5,474,981；gillies等人,procnatlacadsciusa89:1428(1992)；以及fell等人,jimmunol146:2446(1991)。標(biāo)記氨基酸序列可以是六組氨酸肽，如pqe載體提供的標(biāo)簽(qiagen,inc.,chatsworth,ca)，此外，其中許多還可經(jīng)商業(yè)渠道獲得，gentz等人,procnatlacadsciusa86:821(1989)。其它可用于純化的肽標(biāo)簽包括但不限于"ha"標(biāo)簽，它對(duì)應(yīng)于一個(gè)源自流感血凝素蛋白的表位(wilson等人,cell37:767(1984))以及"flag"標(biāo)簽。還可創(chuàng)造單肽鏈結(jié)合分子，其中重鏈和輕鏈fv區(qū)域相連。單鏈抗體("scfv")和它們的構(gòu)建方法在例如us專利號(hào)4,946,778中有所敘述?；蛘?，fab可以類似方式構(gòu)建和表達(dá)。與完全的鼠類單克隆抗體相比，所有完全和部分的人抗體均可具有較小的免疫原性，片段和單鏈抗體也可具有較小的免疫原性。抗體或抗體片段，可從用mccafferty等人,nature348:552(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫(kù)分離。clarkson等人,nature352:624(1991)和marks等人,jmolbiol222:581(1991)分別敘述了使用噬菌體文庫(kù)分離鼠類和人抗體。隨后的出版物敘述了以鏈改組生產(chǎn)高親和力(在nm的范圍內(nèi))人抗體(marks等人,bio/technology10:779(1992))，以及以組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建很大噬菌體文庫(kù)的策略(waterhouse等人,nuclacidsres21:2265(1993))。因此，這些技術(shù)是分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代。候選的抗il-4和/或il-13抗體是用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、facs、western免疫印跡技術(shù)或本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)已知的其它免疫化學(xué)技術(shù)檢測(cè)的。為了確定特定的抗體同源物是否與人il-4和/或il-13結(jié)合，任何傳統(tǒng)的結(jié)合測(cè)定均可應(yīng)用。有用的il-4和il-13結(jié)合測(cè)定包括facs分析、elisa測(cè)定、表面等離振子共振(biacore)、放射免疫分析等等，這些方法檢測(cè)抗體與人il-4和/或il-13的結(jié)合以及由此產(chǎn)生的功能。本文所教導(dǎo)的全長(zhǎng)和可溶形式的人il-4和il-13在這類測(cè)定中是有用的?？贵w或同源物與il-4和/或il-13或其可溶性片段的結(jié)合，可很方便地通過(guò)使用對(duì)該物種的免疫球蛋白具有特異性的第二種抗體來(lái)檢測(cè)，所檢測(cè)的抗體或同源物源自上述物種。為了確定特定的抗體或同源物是否顯著地阻斷il-4和/或il-13的結(jié)合，任何適宜的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定均可使用。有用的測(cè)定包括例如elisa測(cè)定、facs測(cè)定、放射免疫測(cè)定等，它們定量抗體或同源物與il-4和/或il-13結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)能力。優(yōu)選地，配體阻斷標(biāo)記的人il-4和/或il-13與固定化抗體或同源物結(jié)合的能力得以測(cè)量。本發(fā)明之抗體可在抗體識(shí)別或特異性結(jié)合的il-4和/或il-13的表位或部分方面來(lái)描述或規(guī)定。該表位或多肽部分可按本文所述而規(guī)定，例如通過(guò)n端和c端的位置、通過(guò)鄰近氨基酸殘基的大小、構(gòu)象表位等。本發(fā)明之抗體也可在交叉反應(yīng)性方面來(lái)描述或規(guī)定。結(jié)合與il-4和/或il-13有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少有65％、至少有60％、至少55％，以及至少50％同一性(使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)已知和本文所述的方法計(jì)算)的il-4和/或il-13多肽的抗體，也包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明之抗體也可以在與il-4和/或il-13的結(jié)合親和力方面來(lái)描述或規(guī)定?？筰l-4和/或il-13抗體可以低于約10-7m、低于約10-6m，或低于約10-5m的kd結(jié)合。目的抗體的較高結(jié)合親和力可以是有益的，例如具有約10-8至約10-15m、約10-8至約10-12m、約10-9至約10-11m，或約10-8至約10-10m平衡解離常數(shù)或kd的那些抗體。本發(fā)明還提供了一些抗體，如本
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內(nèi)任何已知的測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的方法如本文所述的免疫測(cè)定所確定，這些抗體競(jìng)爭(zhēng)性地抑制抗體與本發(fā)明之表位的結(jié)合。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體競(jìng)爭(zhēng)性地抑制與表位的結(jié)合達(dá)至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少為60％，或至少50％。本發(fā)明還包括含有目的抗體的輟合物。該輟合物包含兩個(gè)主要組分，目的抗體和可以是一種細(xì)胞結(jié)合劑、細(xì)胞毒性劑等的第二個(gè)組分。本文所用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞結(jié)合劑"是指一種能特異性識(shí)別細(xì)胞表面的分子并與其結(jié)合的活性劑。因此，細(xì)胞結(jié)合劑可以是cd抗原、病原體抗原如病毒抗原，分化抗原，癌癥抗原，細(xì)胞特異性抗原，組織特異性抗原，ig或ig樣分子等。細(xì)胞結(jié)合劑可以是目前已知或剛為人所知的任何類型，包括肽、非肽、糖類、核酸、配體、受體等，或其組合。該細(xì)胞結(jié)合劑可以是能與細(xì)胞結(jié)合的任何化合物，無(wú)論是以特異性或非特異性方式結(jié)合。一般而言，細(xì)胞結(jié)合劑可以是抗體(尤其是單克隆抗體)、淋巴因子、激素、生長(zhǎng)因子、維生素，營(yíng)養(yǎng)輸送分子(如轉(zhuǎn)鐵蛋白)，或其它任何細(xì)胞結(jié)合分子或物質(zhì)。可利用的細(xì)胞結(jié)合劑的其它例子包括：多克隆抗體；單克隆抗體；和抗體片段，如fab、fab'、f(ab')2以及fv(parham,j.immunol.131:2895-2902(1983)；spring等人,j.immunol.113:470-478(1974)；以及nisonoff等人,arch.biochem.biophys.89：230-244(1960))。第二個(gè)組分也可以是一種細(xì)胞毒性劑。本文所用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒性劑"是指能降低或阻斷細(xì)胞的功能或生長(zhǎng)，和/或?qū)е录?xì)胞破壞的物質(zhì)。因此，細(xì)胞毒性劑可以是一種紫杉醇、美登素(maytansinoids)，如dm1或dm4、cc-1065或cc－1065類似物、蓖麻毒蛋白、絲裂霉素c等。在某些實(shí)施方案中，如同本發(fā)明之輟合物的任何結(jié)合劑，細(xì)胞毒性劑是以共價(jià)鍵與目的抗體直接或通過(guò)一個(gè)可切割的或不可切割的連接體連接的。適宜的美登素的例子包括美登醇(maytansinol)和美登醇類似物。美登素能抑制微管的形成并對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性。適宜的美登醇類似物的例子包括含有經(jīng)修飾芳環(huán)的那些和在其它位置有修飾的那些美登素醇類似物。在下列us專利中披露了這類適宜的美登素：4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499；以及5,846,545。適宜的含有一個(gè)經(jīng)修飾芳環(huán)的美登醇類似物的例子包括：(1)c-19-脫氯(us專利號(hào)4,256,746)(例如通過(guò)ansamytocinp2的lah還原而制備)；(2)c-20-羥基(或c-20-脫甲基)+/-c-19-脫氯(us專利號(hào)4,361,650和4,307,016)(例如用鏈霉菌屬(stretomyces)或放線菌屬(actinomyces)脫甲基或用氫化鋰鋁(lah)脫氯而制備)；以及(3)c-20-脫甲氧基、c-20-酰氧基(-ocor)，+/-脫氯(us專利號(hào)4,294,757)(用?；弱；苽?。適宜的在其它位置有修飾的美登醇類似物的例子包括：(1)c-9-sh(us專利號(hào)4,424,219)(通過(guò)美登醇與h2s或p2s5的反應(yīng)而制備)；(2)c-14烷氧基甲基(脫甲氧基/ch2or)(us專利號(hào)4,331,598)；(3)c-14-羥甲基或酰基氧基甲基(ch2oh或ch2oac)(us專利號(hào)4,450,254)(從諾卡氏菌屬(nocardia)制備)；(4)c-15-羥基/?；趸?us專利號(hào)4,364,866)(通過(guò)鏈霉菌使美登醇轉(zhuǎn)化而制備)；(5)c-15-甲氧基(us4,313,946和4,315,929)(從trewianudiflora分離)；(6)c-18-n-脫甲基(us專利號(hào)4,362,663和4,322,348)(通過(guò)鏈霉菌使美登醇脫甲基化而制備)；以及(7)4,5-脫氧基(us專利號(hào)4,371,533)(通過(guò)美登醇的三氯化鈦/lah還原而制備)。細(xì)胞毒性輟合物可以體外方法制備。為了將細(xì)胞毒性劑、藥物或前藥與抗體連接，通常使用一個(gè)連接基。適宜的連接基是本
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內(nèi)周知的，包括二硫基、硫醚基、酸不穩(wěn)定基、光不穩(wěn)定基(photolabilegroup)，肽酶不穩(wěn)定基以及酯酶不穩(wěn)定基。例如，利用二硫化物交換反應(yīng)，或在目的抗體和藥物或前體藥之間形成硫醚鍵，即可構(gòu)建輟合物。如上所討論，本發(fā)明提供了編碼本文所披露抗體或其功能片段或變體變體的分離的核酸序列，含有編碼本發(fā)明的抗體或其功能片段的il-4和/或il-13結(jié)合部分的核苷酸序列的載體構(gòu)建體，含有這種載體的宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)多肽的重組技術(shù)。該載體通常包含本
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內(nèi)已知的組分，且一般包括但不限于一個(gè)或多個(gè)下列：信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記或選擇基因，促進(jìn)和/或增強(qiáng)翻譯的序列，增強(qiáng)子元件等。因此，表達(dá)載體包括與適宜的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯調(diào)控核苷酸序列，例如那些源自哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲(chóng)基因的核苷酸序列，有效地連接的核苷酸序列。其它調(diào)控序列的例子包括操縱子、mrna核糖體結(jié)合位點(diǎn)，和/或其它控制轉(zhuǎn)錄和翻譯(例如其起始和終止)的適宜序列。當(dāng)調(diào)控序列與適當(dāng)多肽的核苷酸序列功能相關(guān)時(shí)，核苷酸序列就是"有效連接的"。因此，如果啟動(dòng)子核苷酸序列控制該核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，那么該啟動(dòng)子核苷酸序列就是與例如抗體重鏈序列有效連接。此外，編碼與抗體重鏈和/或輕鏈序列非天然相連的適當(dāng)信號(hào)肽的序列，可納入表達(dá)載體。例如，信號(hào)肽(分泌前導(dǎo))的核苷酸序列可與多肽序列符合讀框地融合，使得該抗體被分泌到周質(zhì)空間或培養(yǎng)基中。在想要的宿主細(xì)胞中起作用的信號(hào)肽，增強(qiáng)了適當(dāng)抗體或其部分的細(xì)胞外分泌。該信號(hào)肽可在細(xì)胞分泌抗體時(shí)從多肽上被切割下來(lái)。這類分泌信號(hào)的例子是眾所周知的并包括例如在us專利號(hào)5,698,435、5,698,417，以及6,204,023中所述的那些分泌信號(hào)。載體可以是質(zhì)粒、單鏈或雙鏈病毒載體、單鏈或雙鏈rna或dna噬菌體載體、噬菌粒、黏粒或任何其它目的轉(zhuǎn)基因的載體。采用眾所周知的將dna和rna導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)，可將此類載體作為多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞。在噬菌體和病毒載體的情況下，也可采用眾所周知的感染及轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將載體作為包裝或包囊的病毒導(dǎo)入細(xì)胞。病毒載體可以是可復(fù)制型或復(fù)制缺陷型。在后一種情況下，病毒的繁殖一般只會(huì)在補(bǔ)充型(complementing)宿主細(xì)胞中發(fā)生，并需使用載有產(chǎn)生顆粒所必須的多種病毒成分的多種載體。使用源自現(xiàn)有dna構(gòu)建體的rna，無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可用于生產(chǎn)蛋白(參閱例如wo86/05807和wo89/01036，以及us專利號(hào)5,122,464)。本發(fā)明之抗體可從任何適宜的宿主細(xì)胞表達(dá)?？捎糜诒景l(fā)明的宿主細(xì)胞的例子包括原核細(xì)胞、酵母或較高級(jí)的真核細(xì)胞，并包括但不限于微生物如用含有目的抗體編碼序列的重組噬菌體dna、質(zhì)粒dna或黏粒dna表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(b.subtilis)、腸桿菌屬(enterobacter)，歐文氏菌屬(erwinia)，克雷伯菌屬(klebsiella)，變形桿菌屬(proteus)、沙門氏菌屬(salmonella)、沙雷菌屬(serratia)和志賀菌屬(shigella)，以及桿菌(bacilli)、假單胞菌屬(pseudomonas)和鏈霉菌屬)；用含有抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如酵母屬(saccharomyces)、畢赤酵母屬(pichia)、放線菌(actinomycetes)、克魯維酵母屬(kluyveromyces)、裂殖酵母屬(schizosaccharomyces)、念珠菌屬(candida)、木霉屬(trichoderma)，鏈孢霉屬(neurospora)，以及絲狀真菌，如鏈孢霉屬(neurospora)、青霉屬(penicillium,)、tolypocladium和曲霉屬(aspergillus))；用含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒、camv；或煙草花葉病毒，tmv)感染的，或用含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或包含重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如cos、cho、bhk、293或3t3細(xì)胞)。該構(gòu)建體含有源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或源自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如腺病毒后期啟動(dòng)子；或痘苗病毒7.5k啟動(dòng)子)。用于原核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體，一般含有一個(gè)或多個(gè)表型選擇標(biāo)記基因。表型選擇標(biāo)記基因是，例如編碼賦予抗生素抗性或提供自養(yǎng)要求的蛋白的基因。有用的原核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體的例子包括從商業(yè)可獲得的質(zhì)粒如pkk223-3(pharmaciafinechemicals,uppsala,sweden)、pgem1(promegabiotec,madison,wi)、pet(novagen,madison,wi)以及prset(invitrogen,carlsbad,ca)系列載體(studier,jmolbiol219:37(1991)；以及schoepfer,gene124:83(1993))所來(lái)源的那些載體。通常用于重組原核宿主細(xì)胞表達(dá)載體的啟動(dòng)子序列包括t7，(rosenberg等人,gene56:125(1987))、β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(chang等人,nature275:615(1978)；以及goeddel等人,nature281:544(1979))、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(goeddel等人,nuclacidsres8:4057(1980))，以及tac啟動(dòng)子(sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual,2版，coldspringharborlaboratory(1990))。酵母載體往往含有復(fù)制起點(diǎn)序列，如來(lái)自2μ酵母質(zhì)粒的、自主復(fù)制序列(ars)、啟動(dòng)子區(qū)域、多聚腺苷化序列、轉(zhuǎn)錄終止序列以及可選擇標(biāo)記基因。酵母載體的適宜的啟動(dòng)子序列包括下述的啟動(dòng)子：金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸酯激酶(hitzeman等人,jbiolchem255:2073(1980))或其它糖酵解酶(holland等人,biochem17:4900(1978))如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸酯變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶以及葡糖激酶，等等。其它用于酵母表達(dá)的適宜載體和啟動(dòng)子，在fleer等人,gene107:285(1991)中進(jìn)一步說(shuō)明。其它酵母和酵母轉(zhuǎn)化方案的適宜啟動(dòng)子和載體是本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)眾所周知的。酵母轉(zhuǎn)化方案也是眾所周知的。hinnen等人,procnatlacadsci75:1929(1978)敘述了這樣的一個(gè)方案，它在選擇性培養(yǎng)基中選擇trp+轉(zhuǎn)化子。任何真核細(xì)胞培養(yǎng)物都是可行的，無(wú)論是源自脊椎動(dòng)物還是無(wú)脊椎動(dòng)物的培養(yǎng)物。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子，包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞(luckow等人,bio/technology6:47(1988)；miller等人,geneticengineering,setlow等人,eds.,vol.8,pp.277-9,plenumpublishing(1986)；以及maeda等人,nature315:592(1985))。例如，桿狀病毒系統(tǒng)可用于生產(chǎn)異源蛋白。在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒(autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus，acnpv)可用作為載體用來(lái)表達(dá)外來(lái)基因。該病毒在草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)細(xì)胞中生長(zhǎng)。抗體編碼序列可在acnpv啟動(dòng)子(例如多角體蛋白啟動(dòng)子)的控制下被克隆。其它已經(jīng)鑒定的宿主包括伊蚊(aedes)、黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)和家蠶(bombyxmori)。多種各樣的轉(zhuǎn)染病毒株是公眾可獲得的，例如acnpv的l-1變體和家蠶npv的bm-5株。此外，如本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)眾所周知，棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽?；?petunia)、西紅柿和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可用作為宿主。脊椎動(dòng)物細(xì)胞、脊椎動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)基(組織培養(yǎng)基)中的繁殖，可以是一種常規(guī)步驟，雖然苛求細(xì)胞系確實(shí)存在，它需要例如具有獨(dú)特因子的專門培養(yǎng)基、滋養(yǎng)細(xì)胞等，參閱tissueculture,kruse等人,eds.,academicpress(1973)。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子為猴腎；人胚腎系；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-dhfr(cho,urlaub等人,procnatlacadsciusa77:4216(1980))；小鼠塞爾托利細(xì)胞；人宮頸癌細(xì)胞(例如hela)；犬腎細(xì)胞；人肺細(xì)胞；人肝細(xì)胞；小鼠乳腺腫瘤；以及ns0細(xì)胞。宿主細(xì)胞用載體轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生抗體，并在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有生長(zhǎng)因子、維生素、礦物質(zhì)等，以及適合于所用細(xì)胞和載體的誘導(dǎo)物。常用的啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列是源自多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(sv40)以及人的巨細(xì)胞病毒(cmv)。源自sv40病毒基因組的dna序列可用于提供其它遺傳元件(如sv40起點(diǎn)、早期和晚期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接和多聚腺苷化位點(diǎn))，以在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)結(jié)構(gòu)基因序列。病毒早期和晚期啟動(dòng)子是特別有用的，因?yàn)閮烧叨己苋菀讖牟《净蚪M作為片段獲得，所述片段也可能含有病毒復(fù)制起點(diǎn)。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的示例性表達(dá)載體可從商業(yè)渠道獲得。可從商業(yè)渠道獲得的培養(yǎng)基如ham'sf10、極限必需培養(yǎng)基(mem)、rpmi-1640和dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)都適合于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，ham等人,methenzymol58:44(1979)和barnes等人,analbiochem102:255(1980)，以及us專利號(hào)4,767,704；4,657,866；4,560,655；5,122,469；5,712,163；或6,048,728中所述的任何培養(yǎng)基也可作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基使用。這些培養(yǎng)基中任何一種，必要時(shí)都可補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)，鹽(如氯化物，如氯化鈉、氯化鈣或氯化鎂；以及磷酸鹽)、緩沖液(如hepes)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素，痕量元素(定義為無(wú)機(jī)化合物，通常其存在的最終濃度在微摩爾的范圍內(nèi))，以及葡萄糖或相當(dāng)?shù)哪芰縼?lái)源。任何其它必要的補(bǔ)充，都可以適當(dāng)?shù)臐舛劝ㄔ趦?nèi)，作為一項(xiàng)設(shè)計(jì)選擇。培養(yǎng)條件，如溫度、ph值等，都是本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)已知適合于細(xì)胞的，并使轉(zhuǎn)基因能夠理想表達(dá)。通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)任何已知的方法，就可獲得目的多核苷酸，并確定該多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗體的核苷酸序列是已知的，就可從化學(xué)合成的寡核苷酸裝配編碼抗體的多核苷酸(例如kutmeier等人,bio/techniques17:242(1994)所敘述的)，然后擴(kuò)增連接的寡核苷酸，例如通過(guò)pcr。可選地，編碼抗體的多核苷酸可從表達(dá)該抗體的細(xì)胞的核酸產(chǎn)生。如果含有編碼某特定抗體的核酸的克隆是不可得的，但抗體分子的序列是已知的，則可從適當(dāng)來(lái)源如文庫(kù)獲得編碼免疫球蛋白的核酸，所述核酸也許是對(duì)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞具有特異性的核酸，所述細(xì)胞如選擇來(lái)表達(dá)本發(fā)明之抗體的雜交瘤細(xì)胞?？蔀閜cr擴(kuò)增配置適宜的引物。然后，使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)眾所周知的任何方法，可將pcr所產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸克隆到可復(fù)制的克隆載體中去。一旦核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的抗體氨基酸序列被確定，就可使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)已知的操縱核苷酸序列的方法，如dna重組技術(shù)、定點(diǎn)誘變，pcr等(參閱，例如sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual,2版，coldspringharborlaboratory(1990)；以及ausubel等人,eds.,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons(1998)，操縱該抗體的核苷酸序列以獲得本文所述的目的等效物，產(chǎn)生含有不同氨基酸序列的抗體，例如，引起氨基酸取代、缺失和/或插入?？梢员娝苤姆椒z查重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，以鑒定cdr序列，例如，通過(guò)與其它重鏈和輕鏈可變區(qū)域的已知氨基酸序列的比較以確定序列高可變性的區(qū)域。使用常規(guī)dna重組技術(shù)，可將一個(gè)或多個(gè)cdr插入構(gòu)架區(qū)，例如插入人的構(gòu)架區(qū)使非人源抗體人源化，如上所述。通過(guò)該構(gòu)架區(qū)與一個(gè)或多個(gè)cdr的組合而產(chǎn)生的目的多核苷酸，可編碼與il-4和/或il-13特異性結(jié)合的抗體或至少編碼其ed結(jié)構(gòu)域。例如，這種方法可用于產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)參與鏈內(nèi)二硫鍵的可變區(qū)域半胱氨酸殘基的氨基酸的取代或缺失，以產(chǎn)生缺乏一個(gè)或多個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子。本發(fā)明的抗體或抗體片段可用來(lái)在體外或體內(nèi)檢測(cè)生物樣品中的il-4和/或il-13，因此也就可以檢測(cè)表達(dá)il-4和/或il-13的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗il-4和/或il-13抗體被用來(lái)確定組織中或來(lái)自該組織的細(xì)胞中il-4和/或il-13的存在及水平。例如，在用本發(fā)明之抗體或抗體片段的免疫測(cè)定中，可測(cè)定il-4和/或il-13在該組織或活檢樣品中的水平。組織或其活檢樣品可冷凍或固定。同一方法或其它方法可用于測(cè)定il-4和/或il-13的其它性質(zhì)，如它的水平、細(xì)胞定位、mrna水平、其突變等等。上述方法可用于例如在已知將要或疑患癌癥的受試者中診斷癌癥，其中將該患者中測(cè)量的il-4和/或il-13水平與正常參照受試者或標(biāo)準(zhǔn)相比。本發(fā)明的測(cè)定也可用于診斷關(guān)節(jié)炎或其它以b細(xì)胞的浸潤(rùn)和富集以及分化淋巴樣組織發(fā)展為特征的自身免疫性疾病。本發(fā)明還提供了為了研究或診斷應(yīng)用而進(jìn)一步標(biāo)記的單克隆抗體、人源化抗體及其表位結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中，該標(biāo)記是放射性標(biāo)記的、熒光團(tuán)、生色團(tuán)、顯像劑，或金屬離子。還提供了一種診斷方法，其中將所述標(biāo)記抗體或其表位結(jié)合片段施用給疑患癌癥、關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病或其它il-4和/或il-13介導(dǎo)的疾病的受試者，并且將所述標(biāo)記在受試者體內(nèi)的分布予以測(cè)量或監(jiān)視。本發(fā)明之抗體及其片段可作為親和純化劑使用。在此過(guò)程中，使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法，將抗體固定在固相上，如葡聚糖或瓊脂糖樹(shù)脂或?yàn)V紙上。被固定的抗體與含有il-4和/或il-13的樣品或待純化的載有所述il-4和/或il-13的細(xì)胞接觸，然后用適宜的溶劑洗滌支持物，該溶劑將除去樣品中除il-4和/或il-13或待純化細(xì)胞以外幾乎所有的物質(zhì)，il-4和/或il-13或待純化細(xì)胞則結(jié)合在被固定的本發(fā)明之抗體上。最后，用另一種適宜的溶劑(如甘氨酸緩沖液，ph5.0)洗滌支持物，這將從抗體上釋放il-4和/或il-13或細(xì)胞。為了診斷應(yīng)用，目的抗體通常會(huì)用可檢測(cè)的部分加以標(biāo)記。有許多標(biāo)記可供利用，通?？煞譃橐韵聨最悾?a)放射性同位素，如36s、14c、125i、3h和131i(抗體可用放射性同位素標(biāo)記，例如使用currentprotocolsinimmunology,vol.12,coligen等人,編輯，wiley-interscience,newyork(1991)所述的技術(shù)，并且放射性可用閃爍計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)量)；(b)熒光標(biāo)記，如稀土螯合物(銪螯合物)、熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰、麗絲胺、藻紅蛋白以及得克薩斯紅；熒光標(biāo)記可用例如currentprotocolsinimmunology(同上)披露的技術(shù)綴合到抗體上，其中熒光可用熒光計(jì)定量；以及(c)有多種酶底物標(biāo)記可供利用(us專利號(hào)4,275,149提供了綜述)，酶通?？纱呋孜锏幕瘜W(xué)改變，這可采用多種技術(shù)來(lái)測(cè)量，例如酶可催化底物顏色的變化，這可用分光光度來(lái)衡量；或者，酶可以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。定量熒光變化的技術(shù)是眾所周知的，例如使用發(fā)光計(jì)，或者該標(biāo)記可向熒光接受體提供能量。酶標(biāo)記的例子包括熒光素酶(例如，螢火蟲(chóng)熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶；us專利號(hào)4,737,456)、螢光素(luciferin)、2,3-dihydrophthalazinedione、蘋果酸脫氫酶、尿素酶，過(guò)氧化物酶如辣根過(guò)氧化物酶(hrpo)、堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過(guò)氧化物酶(lactoperoxiase)、微過(guò)氧化物酶(microperoxiase)等。使酶與抗體綴合的技術(shù)在o'sullivan等人,methenz,ed.langone&vanvunakis,academicpress,newyork,73(1981)中有所敘述。當(dāng)使用這些標(biāo)記時(shí)，有適宜的底物可供利用，例如：(i)對(duì)于辣根過(guò)氧化物酶可用氫過(guò)氧化物酶(hydrogenperoxiase)作為底物，其中氫過(guò)氧化物酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(opd)或3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺氫氯化物(tmb))；(ii)對(duì)于堿性磷酸酶(ap)可用對(duì)硝基苯基磷酸酯作為生色底物；以及(iii)β-d-半乳糖苷酶(β-d-gal)可用生色底物(例如對(duì)硝基苯基-β-d-半乳糖苷酶)，或熒光底物如4-甲基傘形基酮酰-β-d-半乳糖苷酶。其它酶-底物組合可供本
技術(shù)領(lǐng)域：
專業(yè)人員利用。對(duì)于一般性評(píng)述，可參閱us專利號(hào)4,275,149和4,318,980。有時(shí)，標(biāo)記與抗體是間接地綴合。例如，抗體可與生物素綴合，上述任何報(bào)導(dǎo)子都可與抗生物素蛋白綴合，反之亦然。生物素與抗生物素蛋白選擇性地結(jié)合，因此，標(biāo)記可與抗體以該間接方式綴合。或者，為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)記的間接綴合，抗體與小的半抗原(如地高辛)綴合，上述不同類型的標(biāo)記或報(bào)導(dǎo)子之一與抗地高辛抗體綴合。因此，使用第二種抗體可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記與抗體或突變蛋白的間接綴合。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體不必加以標(biāo)記，它的存在可使用與抗體(另一種形式的第二抗體)結(jié)合的標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)。本發(fā)明之抗體可用于任何已知的測(cè)定方法，如競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定、直接和間接夾心測(cè)定以及免疫沉淀測(cè)定。zola,monoclonalantibodies：amanualoftechniques(crcpress,inc.1987)。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定取決于帶標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物與試驗(yàn)樣品在與有限量抗體結(jié)合中的競(jìng)爭(zhēng)能力。試驗(yàn)樣品中抗原的量與跟抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。為便于測(cè)定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量，抗體在競(jìng)爭(zhēng)之前或之后通常是不溶的。結(jié)果，與抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和試驗(yàn)樣品可與未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和試驗(yàn)樣品方便地分離。夾心測(cè)定涉及使用兩種抗體，每一種都有能力與待檢測(cè)靶的不同免疫原部分(決定子或表位)結(jié)合。在夾心測(cè)定中，待分析試驗(yàn)樣品與直接或間接固定在固體支持物上的第一種抗體結(jié)合，然后直接或間接地加以標(biāo)記的第二種抗體與已經(jīng)結(jié)合的試驗(yàn)樣品結(jié)合，從而形成不溶性三部分復(fù)合物，參閱例如us專利號(hào)4,376,110。第二種抗體本身可用可檢測(cè)的部分加以標(biāo)記(直接夾心測(cè)定)，或可用抗免疫球蛋白抗體或用可檢測(cè)部分加以標(biāo)記的結(jié)合對(duì)(例如抗體/抗原、受體/配體、酶/底物)的其它適宜成員測(cè)量(間接夾心測(cè)定)。例如，一種類型的夾心測(cè)定是elisa測(cè)定，在這種情況下，該可檢測(cè)部分是酶。本發(fā)明還包括試劑試劑盒，例如其包括抗體、其片段、同源物、其衍生物等，例如帶標(biāo)記或具有細(xì)胞毒性的輟合物，以及抗體使用說(shuō)明書(shū)、殺死特定類型細(xì)胞的輟合物等等。該說(shuō)明書(shū)可包括在體外、體內(nèi)或離體使用抗體、輟合物等的指導(dǎo)?？贵w可以是液體形式或固體，通常是凍干的。該試劑盒可包含其它適宜的試劑，如緩沖液、重構(gòu)溶液以及為了預(yù)定用途的其它必要成分。考慮了以預(yù)定量包裝好的試劑組合與用于其用途的說(shuō)明書(shū)，所述用途例如用于治療用途或用于進(jìn)行診斷測(cè)定。當(dāng)抗體是帶標(biāo)記的時(shí)，例如用酶標(biāo)記的，那么該試劑盒可包括底物和酶所需的輔因子(例如提供可檢測(cè)生色團(tuán)或熒光團(tuán)的底物前體)。此外，其它添加劑，如穩(wěn)定劑、緩沖液(例如封閉緩沖液或裂解緩沖液)等也可包括在內(nèi)。多種試劑的相對(duì)量可以改變而提供試劑溶液的濃縮物，這就提供了用戶靈活性、節(jié)省空間、節(jié)省試劑等。這些試劑也可以干粉形式提供，通常是凍干形式，包括賦形劑，它在溶解時(shí)可提供具有適當(dāng)濃度的試劑溶液。本發(fā)明之抗體可用于治療哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，出于獲得臨床前數(shù)據(jù)的目的，將目的抗體或等效物施用給非人哺乳動(dòng)物。示例性的待治療非人哺乳動(dòng)物，包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、狗、貓、嚙齒類動(dòng)物以及其它哺乳動(dòng)物，其中進(jìn)行了臨床前研究。這種哺乳動(dòng)物可為需用抗體治療的疾病的建立的動(dòng)物模型，或可用于研究目的抗體的毒性。在每個(gè)這樣的實(shí)施方案中，可在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行劑量遞增研究?？贵w，無(wú)論有無(wú)第二個(gè)組分(如與之綴合的治療劑部分)，無(wú)論是單獨(dú)或與細(xì)胞毒性因子組合施用，均可作為治療劑使用。本發(fā)明涉及以抗體為基礎(chǔ)的療法，其中保留給動(dòng)物、哺乳動(dòng)物或人施用本發(fā)明之抗體，以治療il-4和/或il-13介導(dǎo)的疾病、障礙或狀況。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"治療"是指治療性治療和預(yù)防性或預(yù)防措施。它指的是預(yù)防、治愈、逆轉(zhuǎn)、減弱、改善、最小化、抑制或停止疾病狀態(tài)、疾病進(jìn)程、疾病致病因素(如細(xì)菌或病毒)或其它異常狀況的有害效應(yīng)。因此，本發(fā)明還包含多價(jià)抗體，包括雙特異抗il-4/il-13抗體，其具有與之相連的診斷或治療功能的效應(yīng)分子、原子或其它物質(zhì)。例如，抗體可具有放射性診斷標(biāo)簽或放射性細(xì)胞毒性原子或金屬或細(xì)胞毒性物質(zhì)如蓖麻毒蛋白鏈，與之相連用于癌癥的體內(nèi)診斷或治療。此外，本發(fā)明的抗體還可用于免疫測(cè)定、純化方法以及其它用到免疫球蛋白或其片段的方法。此類用途在本領(lǐng)域?yàn)槿怂熘Ｏ鄳?yīng)地，本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的抗il-13和/或抗il-4的抗體或其片段的組合物，所述抗體方便地和可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑組合，這是本領(lǐng)域的常規(guī)做法。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"藥物組合物"系指多種制備物的制劑。含有治療有效量的多價(jià)抗體的制劑為無(wú)菌液體溶液、液體懸浮劑或凍干形式，任選地包含穩(wěn)定劑或賦形劑。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"障礙"系指任何能夠得益于本發(fā)明抗體治療的狀況。這包括慢性和急性障礙或疾病，包括那些傾向于使哺乳動(dòng)物，尤其是人染上所述障礙的病理狀況。本文中非限制性的有待治療的障礙之實(shí)例包括癌癥、炎癥、自身免疫疾病、感染、心血管疾病、呼吸疾病、神經(jīng)疾病以及代謝性疾病。本發(fā)明的抗體可用來(lái)治療、抑制或預(yù)防疾病，如變應(yīng)性疾病、th2介導(dǎo)的疾病、il-13介導(dǎo)的疾病、il-4介導(dǎo)的疾病和/或il-4/il-13介導(dǎo)的疾病。此類疾病的實(shí)例包括霍奇金病、哮喘、變應(yīng)性哮喘、特應(yīng)性皮炎、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、潰瘍性結(jié)腸炎、硬皮病、變應(yīng)性鼻炎、copd3特發(fā)性肺纖維化、慢性移植排斥、博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化、輻射誘導(dǎo)的肺纖維化、肺部肉芽腫、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化、血吸蟲(chóng)病、肝纖維化、腎癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金病、非-霍奇金病、塞扎里綜合征、哮喘、濃毒性關(guān)節(jié)炎、皰疹樣皮炎、慢性特發(fā)性蕁麻疹、潰瘍性結(jié)腸炎、硬皮病、肥厚性疤痕、whipple病、良性前列腺增生、il-4受體起作用的肺部障礙、il-4受體介導(dǎo)的上皮屏障破壞起作用的狀況、il-4受體起作用的消化系統(tǒng)障礙、對(duì)藥物的變應(yīng)性反應(yīng)、川崎病、鐮狀細(xì)胞病、churg-strauss綜合征、grave's病、先兆子癇、sjogren's綜合征、自身免疫性淋巴組織增生綜合征、自身免疫性溶血性貧血、barrett's食管、自身免疫性葡萄膜炎、肺結(jié)核、囊性纖維化、變應(yīng)性支氣管肺真菌病、慢性阻塞性肺病、博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺病和纖維化、肺泡蛋白沉積癥(pulmonaryalveolarproteinosis)、成人呼吸窘迫綜合征、結(jié)節(jié)病、高ige綜合征、特發(fā)性嗜伊紅細(xì)胞增多綜合征(idiopathichypereosinophilsyndrome)、自身免疫性發(fā)皰病(autoimmuneblisteringdisease)、尋常型天皰瘡、大皰性類天皰瘡、重癥肌無(wú)力、慢性疲勞綜合征、腎病。術(shù)語(yǔ)"變應(yīng)性疾病"系指病理狀況，其中患者對(duì)一種正常情況下非免疫原性的物質(zhì)超敏并作出免疫反應(yīng)。變應(yīng)性疾病的一般特征是ige激活肥大細(xì)胞而造成炎癥反應(yīng)(如局部反應(yīng)、全身反應(yīng))，這類反應(yīng)可導(dǎo)致如流鼻涕那樣的良性癥狀，也可能是危及生命的過(guò)敏性休克和死亡。變應(yīng)性疾病的實(shí)例包括但不限于變應(yīng)性鼻炎(如花粉癥)、哮喘(如變應(yīng)性哮喘)、變應(yīng)性皮炎(如濕疹)、接觸性皮炎、食物過(guò)敏和蕁麻疹(蕁麻疹(hive))。此處所使用的"th2介導(dǎo)的疾病"系指一種疾病，其病理是(全部或部份)由cd4+th2t淋巴樣細(xì)胞調(diào)控的免疫反應(yīng)(th2型免疫反應(yīng))造成的，其特征地形成il-4、il-5、il-9和il-13。th2型免疫反應(yīng)與某些細(xì)胞因子(如il-4,il-13)和某些類別的抗體(如ige)的產(chǎn)生以及體液免疫有關(guān)。th2-介導(dǎo)的疾病的特征是th2細(xì)胞因子(如il-4,il-13)和/或某些類別的抗體(如ige)的升高水平的存在，包括例如變應(yīng)性疾病(如變應(yīng)性鼻炎、特發(fā)性皮炎、哮喘(如特發(fā)性哮喘)、變應(yīng)性氣道疾病(aad)、過(guò)敏性休克、結(jié)膜炎)，與il-4和/或il-13水平增高有關(guān)的自身免疫障礙(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、宿主vs移植物疾病、腎病(如腎病綜合征、狼瘡性腎炎))，以及與il-4和/或il-13水平升高有關(guān)的感染(如病毒、寄生蟲(chóng)、真菌(如白色念珠菌(c.albicans))感染)。有些癌癥與il-4和/或il-13的升高水平有關(guān)，或與il-4誘導(dǎo)的和/或il-13誘導(dǎo)的癌細(xì)胞增殖有關(guān)(如b細(xì)胞淋巴瘤、t細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、頭頸癌、乳腺癌和卵巢癌)。這些癌癥可用本發(fā)明的iigaud治療、抑制或預(yù)防。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"癌癥"系指或描述了哺乳動(dòng)物尤其是人的生理狀況，其典型特點(diǎn)是細(xì)胞無(wú)調(diào)控地生長(zhǎng)。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"自身免疫疾病"系指由于個(gè)體自身組織并針對(duì)自身組織的非惡性疾病或障礙。自身免疫疾病或障礙的實(shí)例包括但不限于炎癥性反應(yīng)如炎癥性皮膚病，包括銀屑病和皮炎；變應(yīng)性狀況如濕疹和哮喘；其它涉及t細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎癥反應(yīng)的癥狀；動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病(如i型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病)；多發(fā)性硬化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性障礙。本發(fā)明的抗體可以作為單獨(dú)施用的組合物使用，或可與其它活性劑聯(lián)合使用?？贵w可以與現(xiàn)有的il-13療法(例如現(xiàn)有的il-13活性劑如抗il-13rαl、il-4/13trap、抗il-13)加抗il-4抗體，以及現(xiàn)有的il-4活性劑(如抗il-4r、il-4突變蛋白質(zhì)、il-4/13trap)加抗il-13抗體和il-4抗體(如wo05/0076990(cat),wo03/092610(regeneron),wo00/64944(geneticinst.)以及wo2005/062967(tanox))一起用于組合療法中。本發(fā)明的抗體可以與一個(gè)或多個(gè)另外的治療或活性劑一起施用和/或配制。當(dāng)一個(gè)配體與另外的治療劑一起施用時(shí)，配體可在另外的治療劑施用前、同時(shí)或施用后施用。一般來(lái)說(shuō)，配體和另外的活性劑通常是提供治療效果重疊的方式施用。能夠與本發(fā)明的配體一起施用或一起配制的另外活性劑包括例如多種免疫治療藥物，諸如環(huán)孢素、甲氨蝶呤、阿霉素或順鉑、抗生素、抗真菌劑、抗病毒劑和免疫毒素。例如，當(dāng)施用拮抗劑來(lái)預(yù)防、抑制或治療肺部炎癥或呼吸疾病時(shí)(如哮喘)，拮抗劑可與下述聯(lián)合施用：磷酸二酯酶抑制劑(如磷酸二酯酶4抑制劑)、支氣管擴(kuò)張藥(如β2激動(dòng)劑、抗膽堿能藥、茶堿)、短效β激動(dòng)劑(如沙丁胺醇(albuterol)、舒喘靈(salbuiamol)、班布特羅、非諾特羅[sigmal]l、isoetherine、異丙腎上腺素、左旋沙丁胺醇(leva[iota]buterol)、澳西那林、吡布特羅、特布他林和tornlate)、長(zhǎng)效β激動(dòng)劑(如福莫特羅和沙美特羅)、短效抗膽堿能藥(如異丙托溴銨和氧托溴銨)、長(zhǎng)效抗膽堿能藥(如噻托溴銨)、茶堿(如短效制劑、長(zhǎng)效制劑)、吸入式類固醇(如倍氯米松、倍氯米松、布地奈德、氟尼縮松、丙酸氟替卡松和曲安西龍)、口服類固醇(如甲潑尼龍、潑尼松龍、prednisolon和潑尼松)、短效β激動(dòng)劑與抗膽堿能藥組合(如沙丁胺醇/舒喘靈/異丙托溴銨以及非諾特羅/異丙托溴銨)、長(zhǎng)效貝塔激動(dòng)劑與吸入式類固醇組合(如沙美特羅/氟替卡松以及福莫特羅/布地奈德)，以及溶粘蛋白劑(如厄多司坦、乙酰半胱氨酸、溴己新、carbocyslcine、guiiafencsin和碘化甘油。其它能夠與本發(fā)明的抗體共同施用以預(yù)防、抑制或治療哮喘(如變應(yīng)性哮喘)的合適的共治療劑包括皮質(zhì)類固醇(如倍氯米松、布地奈德、氟替卡松)、色苷酸鹽、奈多羅米、β激動(dòng)劑(如舒喘靈、特布他林、班布特羅、非諾特羅、茶丙特羅、tolubuterol、沙美特羅、fomtero)、扎魯司特、沙美特羅、潑尼松、潑尼松龍、茶堿、zileutron、孟魯司特以及白三烯改性劑。本發(fā)明的配體可以與很多適合治療疾病(如th-2介導(dǎo)的疾病、yl-a介導(dǎo)的疾病、il-13介導(dǎo)的疾病、il-4介導(dǎo)的疾病以及癌癥)的共治療劑共同施用，包括細(xì)胞因子、鎮(zhèn)痛藥/解熱藥、止吐劑以及化療藥物。如本
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內(nèi)眾所周知或本文所述，本發(fā)明之抗體可以可藥用的組合物形式提供。"生理上可接受的"、"藥理學(xué)上可接受的"等術(shù)語(yǔ)意為已經(jīng)聯(lián)邦或州政府的監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，或已列入美國(guó)藥典或其它普遍公認(rèn)的用于動(dòng)物尤其是人的藥典?？梢匀魏慰山邮艿姆绞綄?duì)哺乳動(dòng)物，尤其是人施用抗il-4、抗il-13以及雙特異抗il-4/il-13抗體。輸入方法包括但不限于胃腸外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)、硬膜外、吸入和口服途徑；若欲進(jìn)行免疫抑制治療，則病灶內(nèi)(intralesional)施用。胃腸外輸注包括肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用?？贵w或組合物可以任何方便途徑施用，例如通過(guò)輸注或快速注射、通過(guò)上皮或粘膜襯里(例如口腔粘膜、直腸和腸道粘膜等)吸收，并可與其它生物活性劑一起施用。施用可以是全身性或局部性。此外，也許需要以任何適當(dāng)途徑將本發(fā)明的治療抗體或組合物引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；心室內(nèi)注射借助于一心室內(nèi)導(dǎo)管，例如與一個(gè)貯器如奧莫耶貯器(ommayareservoir)連接的導(dǎo)管。此外，該抗體適合于以脈沖輸注方式給藥，尤其是以抗體劑量遞減的方式。優(yōu)選地，以注射方式給藥，優(yōu)選地靜脈內(nèi)注射或皮下注射，部分地取決于給藥是短期還是長(zhǎng)期。多種其它遞送系統(tǒng)是眾所周知的，可用于本發(fā)明之抗體的給藥，包括例如封裝于脂質(zhì)體、微粒、微膠囊(參閱langer,science249:1527(1990)；treat等人,inliposomesinthetherapyofinfectiousdiseaseandcancer；lopez-berestein等人,編輯,p.353-365(1989)；以及l(fā)opez-berestein,ibid.,p.317-327)以及能表達(dá)該化合物的重組細(xì)胞；受體介導(dǎo)的胞吞(參閱wu等人,jbiolchem262:4429(1987))；核酸作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體等的部分的構(gòu)建。活性成分也可封裝在例如以coascervation技術(shù)或界面多聚化制備的微膠囊中，例如分別在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子和納米膠囊)或微乳液中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚-(甲基methacylate)微膠囊。remington'spharmaceuticalsciences(雷氏藥學(xué)大全),16版,a.osal,編輯(1980)中公開(kāi)了這些技術(shù)。也可應(yīng)用經(jīng)肺給藥，例如使用吸入器或噴霧器，以及具有霧化劑的制劑?？贵w也可以干粉組合物的形式施用入患者肺部，參閱例如us專利號(hào)6,514,496。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，也許希望在需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明之治療抗體或組合物；這可通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)：例如但不限于，局部輸注、局部應(yīng)用、注射、經(jīng)由導(dǎo)管、以栓劑或植入的方式；所述植入物為多孔、非多孔或凝膠狀物質(zhì)，包括薄膜如sialastic膜或纖維。優(yōu)選地，當(dāng)施用本發(fā)明之抗體時(shí)，應(yīng)注意采用蛋白不吸收或不吸附的材料。在另一實(shí)施方案中，該抗體可經(jīng)由控制釋放系統(tǒng)遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用泵(參閱langer,science249:1527(1990)；sefton,crccritrefbiomedeng14:201(1987)；buchwald等人,surgery88:507(1980)；以及saudek等人,nengljmed321:574(1989))。在另一實(shí)施方案中，可使用聚合材料(參閱medicalapplicationsofcontrolledrelease,langer等人,編輯,crcpress(1974)；controlleddrugbioavailability,drugproductdesignandperformance,smolen等人,eds.,wiley(1984)；ranger等人,jmacromolscirevmacromolchem23:61(1983)；還參見(jiàn)levy等人,science228:190(1985)；during等人,annneurol25:351(1989)；以及howard等人,jneurosurg71:105(1989))。在又一實(shí)施方案中，控制釋放系統(tǒng)可放在治療靶的附近。通過(guò)混合具有所需純度的多肽與任選的"可藥用的"載體、稀釋劑、賦形劑或常用于本
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的穩(wěn)定劑(即緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑、非離子型洗滌劑、抗氧化劑以及其它多種添加劑)，參閱remington'spharmaceuticalsciences(雷氏藥學(xué)大全),16th版，osol,ed.(1980)，多肽或抗體治療制劑可制備成凍干制劑或水溶液儲(chǔ)存。這些添加劑在所用劑量和濃度下，對(duì)接受者一般都沒(méi)有毒性，因此，賦形劑、稀釋劑、載體等是可藥用的。"分離"或"純化"抗體基本上不含細(xì)胞物質(zhì)，或來(lái)自細(xì)胞或組織來(lái)源或衍生蛋白的培養(yǎng)基的其它污染蛋白，或在化學(xué)合成的情況下基本上不含化學(xué)前體或其它化合物。"基本上不含細(xì)胞物質(zhì)"這一措詞包括抗體制品，其中多肽/蛋白與細(xì)胞的細(xì)胞組分分開(kāi)，所述細(xì)胞的細(xì)胞組分中可以分離或重組產(chǎn)生所述抗體。因此，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)的抗體包括污染蛋白低于約30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(干重)的抗體制品。當(dāng)抗體是以重組方式產(chǎn)生時(shí)，也優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即以蛋白制品體積計(jì)，培養(yǎng)基含量低于約20％、10％、5％、2.5％或1％。當(dāng)抗體是以化學(xué)合成方式產(chǎn)生時(shí)，優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品和試劑，即目的抗體是與化學(xué)前體或涉及蛋白合成的其它化學(xué)品分開(kāi)的。因此，這些抗體制品含有低于約30％、20％、10％、5％或1％(干重)的化學(xué)前體或目的抗體以外的其它化合物。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是分離或純化的。本文所用的術(shù)語(yǔ)"低至不可檢測(cè)的聚集水平"，是指樣品中含有不超過(guò)5％、不超過(guò)4％、不超過(guò)3％、不超過(guò)2％、不超過(guò)1％且往往不超過(guò)0.5％的聚集(按蛋白重量計(jì))，例如以高效大小排阻層析法(hpsec)測(cè)量。本文所用的術(shù)語(yǔ)"低至不可檢測(cè)的片段化水平"，是指例如在hpsec所確定的一個(gè)單峰處，或例如還原毛細(xì)管凝膠電泳(rcge)所確定的兩個(gè)(2)峰(重鏈和輕鏈)處，樣品中含有等于或高于80％、85％、90％、95％、98％或99％總蛋白，且不含分別高于5％、高于4％、高于3％、高于2％、高于1％，或高于0.5％總蛋白的其它單峰。本文所用的rcge是指還原條件下的毛細(xì)管凝膠電泳，該還原條件足以使抗體或抗體類型分子或抗體衍生分子中的二硫鍵被還原。就含有il-4和/或il-13抗體或其結(jié)合片段的液體制劑而論，本文所用的術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定"和"穩(wěn)定的"是指制劑中的抗體或其抗原結(jié)合片段，在給定的制造、制備、運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件下，對(duì)于熱和化學(xué)解折疊、聚集、降解或片段化的抵抗力。本發(fā)明的"穩(wěn)定的"制劑在給定的制造、制備、運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件下，可保持等于或高于80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％的生物活性。所述抗體制品的穩(wěn)定性，可根據(jù)聚集、降解或片段化的程度來(lái)評(píng)估，并與參照進(jìn)行比較；采用的方法是本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)專業(yè)人員已知的，包括但不限于rcge、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)以及hpsec。術(shù)語(yǔ)"載體"是指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運(yùn)載體。這類生理載體可以是無(wú)菌液體，例如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、麻油等等。當(dāng)藥物組合物為靜脈內(nèi)施用時(shí)，水是適宜的載體。鹽水溶液以及葡萄糖和甘油的水溶液也可作為液體載體使用，尤其是用于可注射溶液。適宜的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米(rice)、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果需要，該組合物也可含有少量的潤(rùn)濕劑或乳化劑，或ph緩沖劑。該組合物可采取溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、緩釋制劑、貯庫(kù)(depot)等形式。該組合物可用傳統(tǒng)的黏合劑和載體如甘油三酯配制成栓劑?？诜苿┛珊袠?biāo)準(zhǔn)載體，如藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉(sodiumsaccharine)、纖維素、碳酸鎂等。適宜載體的例子在"remington'spharmaceuticalsciences,martin"中有所描述。這類組合物將含有效量的抗體，優(yōu)選地純化形式抗體，以及適量的載體以提供適合給患者施用的形式。如本領(lǐng)域內(nèi)周知，該制劑將構(gòu)建為適合于施用的方式。緩沖液有助于將ph值維持在近似于生理?xiàng)l件的范圍內(nèi)。優(yōu)選緩沖液存在的濃度范圍為大約2mm到大約50mm。適宜用于本發(fā)明的緩沖液包括有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸及其鹽，例如檸檬酸鹽緩沖液(例如檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖液(例如琥珀酸-琥珀酸單鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖液(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖液(例如富馬酸-富馬酸單鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸單鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩沖液(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖液(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)以及乙酸鹽緩沖液(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液、三乙胺鹽例如tris、hepes以及其它已知的此類緩沖液均可以使用?？杉尤敕栏瘎┮匝舆t微生物生長(zhǎng)，加入量范圍可為0.2％-1％(w/v)。適用于本發(fā)明的防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基芐基氯化銨、benzyaconium鹵化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯己雙胺、對(duì)羥基苯甲酸烷基酯如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇以及3-戊醇。等滲劑(isotonicifier)的存在可確保本發(fā)明之液體組合物的生理等滲性，其包括多元糖醇、優(yōu)選地三元或三元以上的糖醇，例如甘油、赤蘚醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇以及甘露醇?？紤]到其它成分的相對(duì)量，多元醇可以約0.1％至約25％(重量)的量存在，優(yōu)選地1％至5％。穩(wěn)定劑是指種類廣泛的賦形劑，其功能范圍可從填充劑至將治療劑溶解或有助于預(yù)防變性或粘在容器壁上的添加劑。典型的穩(wěn)定劑可以是多元糖醇；氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸、l-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機(jī)糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水蘇糖、阿糖醇、赤蘚醇、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌-肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)多醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即<10殘基)；蛋白質(zhì)，如人血清白蛋白、胎牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、糖類、單糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖，如棉子糖；多糖，如葡聚糖等等。穩(wěn)定劑范圍為每活性蛋白部分的0.1至10,000w/w。其它多種賦形劑包括填充劑(如淀粉)、螯合劑(如edta)、抗氧化劑(如抗壞血酸、甲硫氨酸或維生素e)以及共溶劑。根據(jù)所治具體適應(yīng)證的需要，本文的制劑也可包含一種以上活性化合物，優(yōu)選地那些具有互補(bǔ)活性彼此不會(huì)不利影響的化合物。例如，也許希望進(jìn)一步提供免疫抑制劑。這類化合物分子以有效地實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的量組合存在。本文所用的術(shù)語(yǔ)"表面活性劑"是指具有兩親結(jié)構(gòu)的有機(jī)物，由相反溶解傾向的基團(tuán)，通常是一個(gè)油溶性烴鏈和一個(gè)水溶性離子基團(tuán)組成。表面活性劑可根據(jù)表面活性部分的電荷而劃分為陰離子型、陽(yáng)離子型和非離子型表面活性劑。表面活性劑經(jīng)常作為潤(rùn)濕劑、乳化劑、增溶劑和分散劑，用于多種各樣的藥物組合物以及生物材料制品。可加入非離子型表面活性劑或洗滌劑(又稱為“潤(rùn)濕劑”)以助于治療劑的溶解，并保護(hù)治療蛋白以避免振蕩引起的聚集，也使得制劑暴露于剪切力表面應(yīng)激(shearsurfacestress)而不會(huì)引起蛋白的變性。適宜的非離子型表面活性劑包括聚山梨酯(20、80等)、polyoxamer(184、188等)、多元醇以及聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(等)。非離子型表面活性劑存在范圍可為約0.05mg/ml至約1.0mg/ml，優(yōu)選地約0.07mg/ml至約0.2mg/ml。本文所用的術(shù)語(yǔ)"無(wú)機(jī)鹽"是指任何因酸氫或酸中一部分或所有被金屬或起金屬作用的基團(tuán)置換而生成的不含碳化合物，并在藥物組合物和生物材料制劑中經(jīng)常用作為張力調(diào)節(jié)化合物。最常見(jiàn)的無(wú)機(jī)鹽是nacl、kcl、nah2po4等。本發(fā)明包括在醫(yī)生診所或?qū)嶒?yàn)室的商業(yè)冰箱和冷凍室溫度(如約-20℃至約5℃)下具有穩(wěn)定性的液體制劑，上述穩(wěn)定性是用例如高效大小排阻層析法(hpsec)來(lái)評(píng)估的，用于儲(chǔ)存目的，例如約60天、約120天、約180天、約1年、約2年或以上。本發(fā)明的液體制劑在室溫下也顯示了至少多個(gè)小時(shí)的穩(wěn)定性，例如根據(jù)hspec評(píng)估的，例如在使用之前1小時(shí)、2小時(shí)或約3小時(shí)。術(shù)語(yǔ)"小分子"和類似術(shù)語(yǔ)包括但不限于肽、素?cái)M肽(peptidomimetics)、氨基酸、氨基酸類似物、多核苷酸、多核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、分子量為每摩爾小于約10,000克的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物(即包括雜有機(jī)和/有機(jī)金屬化合物)、分子量為每摩爾小于約5,000克的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物、分子量為每摩爾小于約1,000克的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物、分子量為每摩爾小于約500克的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物，以及這類化合物的鹽、酯及其它可藥用的形式。因此，在癌癥的情況下，本發(fā)明的抗體可以單獨(dú)施用，也可與其它類型的癌癥治療組合施用，包括傳統(tǒng)的化療劑(紫杉醇(paclitaxel)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)和多柔比星(doxorubicin))，抗egfr劑(吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)和西妥昔單抗(cetuximab))，抗血管生成劑(貝伐單抗(bevacizumab)和舒尼替尼(sunitinib))，以及免疫調(diào)節(jié)劑如干擾素α和沙利度胺(thalidomide)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"治療劑"是指可用于與異常il-4和/或il-13代謝和活性相關(guān)的疾病、障礙、病癥等的治療、管理或改善的任何活性劑。此外，本發(fā)明的抗體可以與多種效應(yīng)分子綴合，例如異源的多肽、藥物、放射性核苷酸或毒素，參閱例如wo92/08495；wo91/14438；wo89/12624；us專利號(hào)5,314,995；以及epo396,387?？贵w及其片段可與治療部分綴合，例如細(xì)胞毒素(例如細(xì)胞抑制劑或殺細(xì)胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α發(fā)射體如213bi)。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括任何損害細(xì)胞的活性劑。例子包括紫杉醇(paclitaxol)、松胞菌素b(cytochalasinb)、短桿菌肽d(gramicidind)、溴乙啶(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、長(zhǎng)春堿(vinblastine)、秋水仙堿(colchicine)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、二羥基蒽醌(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、米拉霉素(mithramycin)、放線菌素(actinomycind)、1-去氫睪酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)及其類似物或同源物。治療劑包括但不限于抗代謝物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鳥(niǎo)嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)和氮烯咪胺(decarbazine))，烷基化劑(例如氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine(bsnu))和洛莫司汀(lomustine(ccnu))、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈脲霉素(streptozotocin)、絲裂霉素c(mitomycinc)和順二氯二胺鉑(ii)(ddp)順鉑(cisplatin))，蒽環(huán)類(anthracyclines)(例如柔紅霉素(daunorubicin)、道諾霉素(daunomycin)和多柔比星(doxorubicin))，抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)、放線菌素(actinomycin)、博來(lái)霉素(bleomycin)、米拉霉素(mithramycin)和氨茴霉素(anthramycin(amc)))，以及抗有絲分裂劑(例如長(zhǎng)春新堿(vincristine)和長(zhǎng)春堿(vinblastine))。使此類治療部分與抗體綴合的技術(shù)是眾所周知的，參閱例如arnon等人,inmonoclonalantibodiesandcancertherapy,reisfeld等人(eds.),p.243-56alanr.liss(1985)；hellstrom等人,incontrolleddrugdelivery,2nded.,robinson等人,eds.,p.623-53,marceldekker(1987)；thorpe,inmonoclonalantibodies'84:biologicalandclinicalapplications,pinchera等人,eds.,p.475-506(1985)；monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy,baldwin等人,eds.,p.303-16,academicpress(1985)；和thorpe等人,immunolrev62:119(1982)?？蛇x地，抗體可以與第二種抗體綴合，以形成抗體異綴合物，如雙功能抗體，參閱例如us專利號(hào)4,676,980。本發(fā)明的綴合物可用于改變給定的生物反應(yīng)，治療劑或藥物部分不應(yīng)被理解為只限于傳統(tǒng)的化學(xué)治療劑。例如，該藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白或多肽。這類蛋白可包括，例如毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白a、假單胞菌外毒素，或白喉毒素；蛋白，如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、組織纖溶酶原激活物；凋亡劑，例如tnf-α、tnf-β、aimi(wo97/33899)、aimii(wo97/34911)、fas配體(takahashi等人,intimmunol,6:1567(1994)),vegf(wo99/23105)；血栓形成劑；抗血管生成劑，例如血管他丁或內(nèi)皮他丁；或生物反應(yīng)改性劑，例如淋巴因子、白細(xì)胞介素-1(il-1)、白細(xì)胞介素-2(il-2)、白細(xì)胞介素-6(il-6)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、粒細(xì)胞集落刺激因子(gcsf)或其它生長(zhǎng)因子。用于體內(nèi)施用的制劑必須是無(wú)菌的。這可通過(guò)例如無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾而實(shí)現(xiàn)。例如，本發(fā)明的液體制劑可通過(guò)用0.2μm或0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾而滅菌?？梢灾苽渚忈屝椭破?。緩釋型制品的適宜例子包括含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質(zhì)，該基質(zhì)以成形物品的形式，例如薄膜或基質(zhì)。緩釋型基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯醇)、聚丙交酯(us專利號(hào)3,773,919)、l-谷氨酸和乙基-l-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如由乳酸-乙醇酸共聚物構(gòu)成的可注射微球)以及聚-d-(-)-3-羥基丁酸。例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等的聚合物能夠釋放分子長(zhǎng)達(dá)100天以上，但某些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間則較短。取決于所涉及的機(jī)制，可以制訂出用于穩(wěn)定的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過(guò)硫代-二硫化物交換而形成分子間的s-s鍵，那么通過(guò)修飾硫氫基殘基、從酸性溶液冷凍干燥、控制含濕量、使用適當(dāng)?shù)奶砑觿?、氨基酸取代和開(kāi)發(fā)特異的聚合物基質(zhì)組合物就可以達(dá)到穩(wěn)定?？贵w或變體組合物將以符合優(yōu)良醫(yī)療實(shí)踐的方式配制、定量以及施用。這方面考慮的因素包括要治的具體障礙、要治的具體哺乳動(dòng)物或人、個(gè)體患者的臨床狀況、致病原因、遞送活性劑部位、給藥方法、給藥方案以及醫(yī)療工作者所知的其它因素。要被施用的抗體或變體的"治療有效量"將取決于這些考慮，并可以是為了預(yù)防、改善或治療某種il-4和/或il-13介導(dǎo)的疾病、狀況或障礙所必須的最低量。任選地，抗體或變體與目前用于預(yù)防或治療所討論障礙的一種或多種活性劑一起配制。此類其它活性劑的有效量取決于制劑中存在的抗體的量、障礙或治療的類型，以及上面討論的其它因素。這些通常與此前所用的劑量一樣且通過(guò)同樣的給藥途徑使用，或?yàn)榇饲八脛┝康募s從1至99％。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"有效量"系指下述的療法(如預(yù)防或治療活性劑)的量，所述量足以降低il-4和/或il-13介導(dǎo)的疾病之嚴(yán)重性和/或縮短其持續(xù)時(shí)間，改善其一種或多種癥狀，防止il-4和/或il-13介導(dǎo)的疾病的發(fā)展或引起疾病的退化，或足以防止il-4和/或il-13介導(dǎo)的疾病或其一種或多種癥狀的發(fā)展、復(fù)發(fā)、發(fā)作或進(jìn)展，或加強(qiáng)或改善另一種對(duì)治療il-4和/或il-13介導(dǎo)的疾病有用的療法(如另一種治療活性劑)的預(yù)防和/或治療效果。在特定疾病或狀況的使用或治療中有效的治療抗體或其片段的量將取決于該疾病或狀況的性質(zhì)，并可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)測(cè)定。當(dāng)可能時(shí)，可先在體外得出劑量－反應(yīng)曲線以及本發(fā)明的藥物組合物。如果適宜的動(dòng)物模型系統(tǒng)可用，同樣可獲得劑量－反應(yīng)曲線，并利用其外推出實(shí)踐本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法的適宜的人劑量。但是，基于本領(lǐng)域的常識(shí)，有效地促進(jìn)降低炎癥作用的藥物組合物，例如，可提供的局部治療劑濃度為約5至20ng/ml之間，優(yōu)選地約10至20ng/ml之間。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療用多肽、抗體或其片段的水溶液可以皮下注射施用。每次劑量的范圍按每千克重量計(jì)可為約0.5mg至約50mg，或更優(yōu)選地，按每千克體重計(jì)為約3mg至約30mg。針對(duì)具體的疾病、患者群體、施用方式等，可憑經(jīng)驗(yàn)確定該劑量，以實(shí)踐本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)已知的藥學(xué)方法。取決于許多臨床因素，包括疾病類型、疾病嚴(yán)重程度以及患者對(duì)治療劑的敏感度，皮下注射的劑量安排可在每周一次至每天一次的范圍內(nèi)變化。本發(fā)明提供了制備抗體或其il-4和/或il-13結(jié)合片段的液體制劑的方法，其包括將純化抗體的級(jí)分濃縮至約15mg/ml、約20mg/ml、約30mg/ml、約40mg/ml、約50mg/ml、約60mg/ml、約70mg/ml、約80mg/ml、約90mg/ml、約100mg/ml、約200mg/ml、約250mg/ml、約300mg/ml或更高的最終濃度，例如使用具有適當(dāng)分子量(mw)截?cái)嘀?cutoff)(例如對(duì)于其f(ab')2片段的截?cái)嘀禐?0kd；對(duì)于fab片段的截?cái)嘀禐?0kd)的半滲透膜。此外，本發(fā)明也包括了穩(wěn)定的、具有改善體內(nèi)半衰期的目的產(chǎn)品的液體制劑。因此，目的抗體在受試者(優(yōu)選地人)體內(nèi)的半衰期為3天以上、7天以上、10天以上、15天以上、25天以上、30天以上、35天以上、40天以上、45天以上、2月以上、3月以上、4月以上、5月以上或更長(zhǎng)。為了延長(zhǎng)抗體在體內(nèi)的血清循環(huán)，可采用多種各樣的技術(shù)。例如，惰性聚合物分子如高分子量聚乙二醇(peg)，可以通過(guò)peg的位點(diǎn)特異性綴合到抗體的n端或c端或通過(guò)賴氨酸殘基上存在的ε氨基連接到抗體上，其中可以用或不用多功能連接體?？梢圆捎脤?dǎo)致生物活性損失最小的線性或支鏈聚合物衍生。綴合程度可通過(guò)sds-page和質(zhì)譜密切監(jiān)測(cè)，以確保peg分子與抗體的妥善綴合。未反應(yīng)的peg可通過(guò)大小排阻或離子交換層析與抗體-peg綴合物分離。采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法，例如本文所述的免疫測(cè)定法，可以測(cè)定peg衍生抗體的結(jié)合活性以及體內(nèi)功效。在體內(nèi)具有增加的半衰期的抗體，也可通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(即取代、插入或缺失)引入igg恒定結(jié)構(gòu)域或其fcr結(jié)合片段(如fe或鉸鏈fe結(jié)構(gòu)域片段)來(lái)產(chǎn)生，參閱例如wo98/23289；wo97/34631；以及us專利號(hào)6,277,375。此外，抗體可與白蛋白綴合使得抗體在體內(nèi)更穩(wěn)定，或在體內(nèi)具有較長(zhǎng)的半衰期。這些技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，參閱例如wo93/15199、wo93/15200和wo01/77137；以及epo413,622。抗體也可通過(guò)例如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保護(hù)基/阻斷基衍生化、蛋白水解切割、與細(xì)胞配體或其它蛋白連接等來(lái)修飾。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，按照常規(guī)步驟將該組合物配制成適合于人靜脈內(nèi)給藥的藥物組合物。通常，靜脈內(nèi)給藥的組合物是在無(wú)菌等滲緩沖水溶液中的溶液。在必要的情形，該組合物也可包含增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因或其它"卡因"類麻醉劑，以減輕注射部位的疼痛。通常，多種成分是以單位劑量的形式單獨(dú)供應(yīng)或混合在一起供應(yīng)，例如作為在密封容器中的干燥凍干粉末或無(wú)水濃縮物，所述密封容器如安瓿瓶或囊，并標(biāo)明活性成分的量。當(dāng)組合物以輸注方式給藥時(shí)，其可被分散在含有無(wú)菌藥用級(jí)水或鹽水的輸注瓶中。當(dāng)組合物以注射方式給藥時(shí)，可提供無(wú)菌注射用水或鹽水的安瓿瓶，例如以試劑盒形式提供，使得成分可在施用前先混合。本發(fā)明也提供，本發(fā)明的液體制劑是裝在密封容器中，如安瓿瓶或囊(sachet)中，其上標(biāo)明目的產(chǎn)品的量。本發(fā)明的液體制劑可在標(biāo)明抗體或抗體片段的量和濃度的密封容器中。例如，本發(fā)明的液體制劑可在密封容器中供應(yīng)，其具有的il-4和/或il-13抗體至少為15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、250mg/ml，或300mg/ml，以1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml或20ml的量。提供了含有對(duì)上述障礙治療有用物質(zhì)的制備物品。該制備物品包括容器和標(biāo)簽。適宜的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和試管。容器可從多種材料形成，例如玻璃或塑料。容器容納能有效地診斷、預(yù)防或治療il-4和/或il-13介導(dǎo)的狀況或疾病的組合物，并可具有無(wú)菌入口(例如容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶，其具有能被皮下注射針頭刺破的塞子)。容器上的標(biāo)簽或附帶的標(biāo)簽標(biāo)明該組合物是用于治療所選的狀況。該制備物品還可包括第二個(gè)容器，其含有可藥用的緩沖液，如磷酸緩沖鹽溶液、ringer's溶液和葡萄糖溶液。它還可包括從商業(yè)和用戶的立場(chǎng)看來(lái)所需的其它材料，包括緩沖液、稀釋劑、過(guò)濾器、針頭、注射器以及使用說(shuō)明的藥品說(shuō)明書(shū)。為了技術(shù)人員有利，本發(fā)明將以下列非限制性實(shí)例示例說(shuō)明，所述實(shí)例描述了一些本發(fā)明可籍以實(shí)施或在其中本發(fā)明可以實(shí)施的實(shí)施方案。實(shí)施例實(shí)施例1:小鼠抗人il-13單克隆抗體克隆b-b13的fv結(jié)構(gòu)域的測(cè)序下面的方法中所使用的試劑為購(gòu)自cellsciences,inc.(canton,ma,usa)的小鼠抗il-13單克隆抗體克隆b-b13。cellsciences為抗體b-b13的制備商diaclone(france)的美國(guó)分銷商。抗il-13單克隆抗體克隆b-b13的氨基酸序列是利用edmann端測(cè)序技術(shù)和質(zhì)譜分析的組合測(cè)定的。抗體經(jīng)過(guò)下述不同方法的處理，以便產(chǎn)生多肽或肽片段，這些片段然后用不同的方法分級(jí)分離以便制備樣品用于后面的edmann端測(cè)序和液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜(lc-ms/ms)分析，這是用相關(guān)的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)肽匹配?？贵w的sds-page，經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)焦谷氨基肽酶(pyrogluamino)處理以分離重鏈和輕鏈，然后印跡到聚偏氟乙烯(pvdf)膜和并進(jìn)行條帶的edmann端測(cè)序。用抗體的特異蛋白酶有限地部分水解，接著進(jìn)行sds-page并印跡到pvdf膜和并進(jìn)行條帶的edmann端測(cè)序。對(duì)整個(gè)抗體或重鏈和輕鏈sds-page凝膠條帶進(jìn)行有限部分化學(xué)切割，接著進(jìn)行sds-page并印跡到pvdf膜和并進(jìn)行條帶的edmann端測(cè)序。對(duì)整個(gè)抗體或重鏈和輕鏈的sds-page凝膠條帶以特異蛋白酶進(jìn)行蛋白水解并進(jìn)行l(wèi)c/ms/ms分析。將重鏈和輕鏈的sds-page凝膠條帶以特異蛋白酶進(jìn)行蛋白水解，接著用反向高壓色譜分級(jí)分離(rp-hplc)，再進(jìn)行各級(jí)分的edmann端測(cè)序和lc/ms/ms分析。以木瓜蛋白酶對(duì)抗體作有限的蛋白水解，通過(guò)sds-page分級(jí)分離fd(抗體重鏈vh-ch1片段)凝膠條帶，以特異蛋白酶蛋白水解，反向高效液相色譜(rp-hplc)，再進(jìn)行各級(jí)分的edmann端測(cè)序和lc/ms/ms分析。實(shí)施例2:小鼠抗人il-4單克隆抗體克隆8d4-8的fv結(jié)構(gòu)域測(cè)序試劑小鼠抗il-4單克隆抗體克隆8d4-8購(gòu)自biozoldiagnosticavertriebgmbh(eching,德國(guó))。biozol為生產(chǎn)8d4-8抗體的biolegend(sandiego,ca,usa)之德國(guó)分銷商。小鼠抗il-4單克隆抗體(克隆8d4-8)的氨基酸序列是利用edman測(cè)序和質(zhì)譜分析組合測(cè)定的(pham等人,2006,anal.biochem.352:77-86；roberts等人,2005,anal.chem.67:3613-25)。簡(jiǎn)言之，抗體被首先分離成輕鏈和重鏈，然后每個(gè)鏈用序列特異的蛋白酶或化學(xué)方法切割。得到的肽用反向色譜分離并用基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜(maldi)和/或lc-ms/ms分析。獨(dú)特的肽以及完整的重鏈和輕鏈然后進(jìn)行edman測(cè)序，以準(zhǔn)確地測(cè)定蛋白質(zhì)的序列。實(shí)施例3:小鼠抗人il-13單克隆抗體克隆b-b13的fv結(jié)構(gòu)域的人源化此處所描述的人源化規(guī)程被用來(lái)實(shí)現(xiàn)b-b13克隆的人源化。建議六個(gè)人源化的形式，包括cdr中的突變來(lái)解決有問(wèn)題的殘基(脫酰胺位點(diǎn)、暴露于溶劑的甲硫氨酸、酸不穩(wěn)定位置)。b-b13的vl&vh序列與2007年7月的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(pdb)版本進(jìn)行blast。檢索出大多數(shù)類似的輕鏈和重鏈氨基酸序列。發(fā)現(xiàn)可變輕鏈中最同源的為1egj。發(fā)現(xiàn)可變重鏈中最同源的為1fns。1egj&1fns結(jié)構(gòu)被用來(lái)建造可變結(jié)構(gòu)域的同源性模型，然后利用分子操作環(huán)境(moe)中實(shí)施的標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)ζ溥M(jìn)行能量最小化。moe是由chemicalcomputinggroup提供的一套綜合性的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件。其后對(duì)b-b13的3d同源性模型在廣義波恩隱含溶劑(generalizedbornimplicitsolvent)中進(jìn)行了1.7納秒的分子動(dòng)力學(xué)(md)計(jì)算。然后對(duì)每一個(gè)b-b13氨基酸，利用得到的1,700個(gè)md軌跡快照，與參照medoid位置相比較，計(jì)算其均方根差(rmsd)的分布。最后用一個(gè)統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)對(duì)每個(gè)氨基酸的均方根差分布與全局均方根差分布進(jìn)行比較，以決定該氨基酸從md計(jì)算來(lái)看，是否有足夠的柔性而有可能被視為與b細(xì)胞受體相互作用，從而成為免疫反應(yīng)活化的原因。將鼠b-b13可變區(qū)的柔性位置與下載到本地的2007年1月版immunogenetics數(shù)據(jù)庫(kù)中人抗體序列對(duì)應(yīng)的位置進(jìn)行了比較。只有那些柔性大于平均值三倍的殘基以及一些保存了這些柔性殘基3d結(jié)構(gòu)的側(cè)翼殘基才被保留用于搜索。選擇含相同柔性殘基最多的人抗體可變區(qū)，特別考慮位于cdr的范圍內(nèi)的位置，以便替換鼠b-b13抗體可變區(qū)的柔性殘基。cdr中的一些突變也包括在提議的形式中以避免有問(wèn)題的殘基。研究了下面的序列基序：asp-pro(酸性不穩(wěn)定鍵)、asn-x-ser/thr(糖基化)、asn-gly/ser/thr(曝露區(qū)域的脫酰胺化位點(diǎn))、met(曝露區(qū)域的氧化)。將產(chǎn)生的人源化序列就序列相似性而在uniprotkb/swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)中blast，得出了已經(jīng)作出合理假設(shè)的置信度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有序列都顯示出與人抗體數(shù)有很高的相似性程度。此外，所有的序列都不含任何列在免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)和分析資源(iedb數(shù)據(jù)庫(kù))中的已知b-或t-細(xì)胞表位。對(duì)重鏈提出三種形式(h1,h2,h3)并且對(duì)輕鏈提出三種形式(l1、l2和l3)。輕鏈的三種形式得自caa83271.1(genebank登錄號(hào)caa83271)。l1形式包含4個(gè)突變。l2形式包含一個(gè)另外的突變以除去cdr3中的dp位點(diǎn)(pro99)。與l2相比，l3在cdrs中加入了兩個(gè)另外的突變，它們是2個(gè)假定的脫酰胺位點(diǎn)(n34q,n96a)。重鏈的h1,h2和h3形式得自cac39364.1(genebank登錄號(hào)cac39364)。該模板不是得分最高的模板，但它是不包含與已知免疫原序列顯示高同源性(>70％)的得分最高的模板。h1形式包含6個(gè)突變，h2序列加入了兩個(gè)另外的突變來(lái)解決三個(gè)脫酰胺位點(diǎn)(n60a、n73t和n83t)。氨基酸的序列編號(hào)反映了其在蛋白之中的天然次序(n端到c端)。h3包含兩個(gè)另外的被認(rèn)為能夠提高效力的突變(y100r&d106k)。建議6個(gè)組合的vl和vh的變體以產(chǎn)生人源化抗體：vl1xvh1,vl2xvh2,vl1xvh3,vl3xvh1,vl3xvh2和vl3xvh3。如表1所示，對(duì)人源化的b-b13vl和vh變體中的氨基酸利用本申請(qǐng)書(shū)詳細(xì)說(shuō)明一節(jié)中給出的表面重整技術(shù)進(jìn)行了改變。左邊一欄表示原始的氨基酸以及它們?cè)谑骲-b13mab中的位置。表1實(shí)施例4:小鼠抗人il-4單克隆抗體克隆8d4-8的fv結(jié)構(gòu)域的人源化采用本文上面所述的人源化(表面重整)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)8d4-8克隆的人源化。制備了兩種人源化形式。一種形式在重鏈的cdr中包括一個(gè)被認(rèn)為能解決有問(wèn)題的殘基(曝露的酸性不穩(wěn)定位置)的突變。8d4-8的vl&vh序列與2007年7月的pdb版本進(jìn)行blast。檢索出大多數(shù)類似的輕鏈和重鏈氨基酸序列。發(fā)現(xiàn)可變輕鏈中最同源的為1ydj。發(fā)現(xiàn)可變重鏈中最同源的為1iqw。1ydg&1iqw結(jié)構(gòu)被用來(lái)建造可變結(jié)構(gòu)域的同源性模型，然后利用moe中實(shí)施的標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)ζ溥M(jìn)行能量最小化。其后對(duì)8d4-8的3d同源性模型在廣義波恩隱含溶劑(generalizedbornimplicitsolvent)中進(jìn)行了1.7納秒的分子動(dòng)力學(xué)(md)計(jì)算。然后對(duì)每一個(gè)8d4氨基酸，利用得到的1,700個(gè)md軌跡快照，與參照medoid位置相比較，計(jì)算其均方根差(rmsd)的分布。最后用一個(gè)統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)對(duì)每個(gè)氨基酸的均方根差分布與全局均方根差分布進(jìn)行比較，以決定該氨基酸從md計(jì)算來(lái)看，是否有足夠的柔性而有可能被視為與b細(xì)胞受體相互作用，從而成為免疫反應(yīng)活化的原因。將鼠8d4-8可變區(qū)的柔性位置與下載到本地的2007年1月版immunogenetics數(shù)據(jù)庫(kù)中人抗體序列對(duì)應(yīng)的位置進(jìn)行了比較。只有那些柔性大于平均值三倍的殘基以及一些保存了這些柔性殘基3d結(jié)構(gòu)的側(cè)翼殘基才被保留用于搜索。選擇含相同柔性殘基最多的人抗體可變區(qū)，特別考慮位于cdr的范圍內(nèi)的位置，以便替換鼠8d4-8抗體可變區(qū)的柔性殘基。最終制備一些另外的突變來(lái)避免問(wèn)題殘基。研究了下面的序列基序：asp-pro(酸性不穩(wěn)定鍵)、asn-x-ser/thr(糖基化)、asn-gly/ser/thr(曝露區(qū)域的脫酰胺化位點(diǎn))、met(曝露區(qū)域的氧化)。發(fā)現(xiàn)的唯一有問(wèn)題的殘基為重鏈cdr2中的dp位點(diǎn)。將產(chǎn)生的人源化序列就序列相似性而在uniprotkb/swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast，得出了已經(jīng)作出合理假設(shè)的置信度。全部序列都顯示出與眾多人抗體的高度相似性。此外，所有序列均不含有iedb數(shù)據(jù)庫(kù)中所列的任何已知b細(xì)胞或t細(xì)胞表位。提示對(duì)重鏈獲得了兩種形式(h1,h2)并且對(duì)輕鏈獲得了一種形式(l1)。輕鏈的l1形式得自bac01676.1(genebank登錄號(hào)bac01676)。l1形式包含3個(gè)突變。重鏈的h1和h2形式得自bac02418.1(genebank登錄號(hào)bac02418)。h1形式包含9個(gè)突變，h2形式包含一個(gè)額外的突變來(lái)除去cdr2中的dp位點(diǎn)(pro53)。制備了兩個(gè)組合，vl1xvh1和vl1xvh2。表2顯示利用人源化(表面重整)技術(shù)對(duì)人源化的8d4-8vl和vh變體中的氨基酸所作的改變。左邊一欄表示原始的氨基酸以及它們?cè)谑?d4-8mab中的位置。表2實(shí)施例5:嵌合抗il-13克隆b-b13單克隆抗體、嵌合抗il-4克隆8d4-8單克隆抗體以及人源化變體的克隆和生成抗il-13克隆b-b13和抗il-4克隆8d4-8的可變重鏈和輕鏈的氨基酸序列被逆轉(zhuǎn)譯為核苷酸序列，并用youngl.和dongq.(nucl.acidsres.(2004),32(7),e59)描述的重疊延伸pcr(oe-pcr)修改規(guī)程分別生成。pcr產(chǎn)物用invitrogentopota克隆試劑盒(目錄號(hào)：45-0641)被克隆到4-topo中，并用m13正向和m13反向引物測(cè)序?？勺兘Y(jié)構(gòu)域被分別融合到恒定的重鏈(ighg1，genebank登錄號(hào)q569f4)或輕鏈(igkc)genebank登錄號(hào)q502w4)中，用nhei和hindiii消化，每個(gè)結(jié)構(gòu)域被連接到durocher等人(2002),nucl.acidsres.30(2),e9描述的ptt載體的類似物(analogon)游離型表達(dá)載體pxl的nhei/hindiii位點(diǎn)，從而產(chǎn)生了嵌合的b-b13重鏈和輕鏈以及嵌合的8d4-8重鏈和輕鏈的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒。編碼抗il-13克隆b-b13和抗il-4克隆8d4-8的人源化變體的表達(dá)克隆也透過(guò)重疊延伸pcr(oe-pcr)，基于提議的原始序列氨基酸交換合成產(chǎn)生。編碼該抗體重鏈和輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌dh5a中繁殖。用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒是利用qiagenendofreeplasmidmega試劑盒從大腸桿菌中制備的。為轉(zhuǎn)染，在500ml搖瓶里的100ml體積的無(wú)血清freestyle培養(yǎng)基(invitrogen)中按3x105細(xì)胞/ml接種hek293freestyle細(xì)胞(invitrogen)。細(xì)胞在一個(gè)37℃、含有8％co2加濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在以110rpm旋轉(zhuǎn)的定軌搖床平臺(tái)上。接種三天后，利用一臺(tái)casy電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器(systemgmbh)測(cè)定了存活的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。存活率大于90％的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染，細(xì)胞密度為1-1.5x106細(xì)胞/ml。100ml細(xì)胞在一個(gè)有重鏈和輕鏈表達(dá)質(zhì)粒混合物(5x10-7μgdna/細(xì)胞)的500ml搖瓶里利用fugenehd(roche)在制備商說(shuō)明的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中dna:fugenehd比率為2:7。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在一個(gè)在以110rpm旋轉(zhuǎn)的定軌搖床平臺(tái)上的37℃培養(yǎng)箱(8％co2)中培養(yǎng)7天。在一個(gè)nuncf96-maxisorp-immuno板上包被山羊抗人igg(fc特異)[natuteca80-104a]。該抗體在碳酸鹽包被緩沖液(50mm碳酸鈉ph9.6)中稀釋到10ug/ml，每孔分配50ul。平板用膠帶密封，在4℃下儲(chǔ)存過(guò)夜。用洗滌緩沖液(pbsph7.4,0.1％tween20)洗滌平板三次。每孔分配有150ul封閉溶液(1％bsa/pbs)以覆蓋平板。室溫下經(jīng)過(guò)1小時(shí)后，用洗滌緩沖液洗三次。加入100ul樣品或標(biāo)準(zhǔn)(范圍為1500ng/ml到120ng/ml)，并在室溫下放置1小時(shí)。用洗滌緩沖液洗平板三次。加入用孵育溶液(0.1％bsa,pbsph7.4,0.05％tween20)按1:10.000稀釋的100ul山羊抗人igg-fc–hrp綴合物[natuteca80-104p-60]。室溫下經(jīng)過(guò)1小時(shí)孵育后，用洗滌緩沖液洗三次平板。向每孔中分配100ulabts底物(10mgabts片(pierce34026)溶于ml的0.1mna2hpo4，0.05m檸檬酸溶液，ph5.0。使用前加入10ul30％h2o2/10ml底物緩沖液)，并令其顯色。顯色后(大約10到15分鐘)，加入50ul的1％sds溶液以終止反應(yīng)。平板在a405讀數(shù)。蛋白質(zhì)在蛋白a(hitraptmproteinahpcolumns,gelifesciences)上以親和色譜純化。用100mm含有100mmnacl的乙酸鹽緩沖液ph3.5洗脫后，單克隆抗體配制在pbs溶液中并經(jīng)過(guò)0.22μm過(guò)濾。蛋白質(zhì)濃度通過(guò)測(cè)量在280nm的吸光度而測(cè)定。每一批用protein200pluslabchip試劑盒在agilent2100生物分析儀上在還原和非還原條件下進(jìn)行分析，以測(cè)定每個(gè)亞單位和單體的純度和分子量。實(shí)施例6:人源化抗il-13克隆b-b13變異體和人源化抗il-4克隆8d4-8變異體的表征重組人il-13和il-4試劑購(gòu)自chemicon(usa)。按下述方法進(jìn)行了biacore動(dòng)力學(xué)分析。利用表面等離振子技術(shù)在一臺(tái)biacore3000(gehealthcare)上對(duì)純化的抗體進(jìn)行了詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)表征。采用了一種捕獲測(cè)定，其利用一種物種特異的抗體(例如人-fc特異性mab1302,chemicon)對(duì)感興趣的抗體進(jìn)行捕獲和定向。捕獲抗體用標(biāo)準(zhǔn)程序通過(guò)伯胺(10000ru)固定在研究級(jí)cm5芯片(gelifescience)上。捕獲所分析的抗體并調(diào)節(jié)ru值，導(dǎo)致在流速為10μl/min時(shí)得到最大的30ru分析物結(jié)合。在0到50nm之間的hbsep濃度范圍(10mmhepesph7.4,150mmnacl,3mmedta,0.005％表面活性劑p20)，流速為30μl/min時(shí)，測(cè)量相對(duì)于重組il-4和il-13的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。用10mm甘氨酸ph2.5再生芯片表面。利用沒(méi)有捕獲的抗體的流動(dòng)池作為參照，在bia評(píng)估計(jì)劃包中對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了分析和計(jì)算。為了研究?jī)蓚€(gè)抗原的加成結(jié)合，應(yīng)用一個(gè)向?qū)?qū)動(dòng)(wizard-driven)的共注射方法，其中一個(gè)抗原注射后，立即注射il-13/il-4的抗原混合物。籍由測(cè)量tf-1細(xì)胞中il-4或il-13介導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制，測(cè)量了本發(fā)明抗體的生物活性。簡(jiǎn)而言之，申請(qǐng)人用il-4或il-13來(lái)刺激tf-1細(xì)胞的生長(zhǎng)。tf-1是一個(gè)生長(zhǎng)依賴于細(xì)胞因子并對(duì)很多細(xì)胞因子，包括il-4和il-13有反應(yīng)的細(xì)胞系。誘導(dǎo)的生長(zhǎng)(與不存在細(xì)胞因子時(shí)的基線條件相比)則代表了il-4或il-13的生物活性?？筰l-4、抗il-13以及雙特異的抗il-4/il-13抗體被表明阻斷il-4或il-13誘導(dǎo)的tf-1細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，雙特異的抗il-4/il-13抗體已被表明阻斷由組合的il-4和il-13刺激所誘導(dǎo)的tf-1細(xì)胞增殖。阻斷效應(yīng)按劑量依賴方式測(cè)量以產(chǎn)生ic50(50％抑制時(shí)的抗體濃度)作為抗體對(duì)其靶，即il-4或il-13的中和能力。下面更詳細(xì)地介紹所采用的方法細(xì)節(jié)。tf-1細(xì)胞(atcc,crl-2003)被保持在含有新加入hgm-csf(最終濃度為4ng/ml)的完全培養(yǎng)基(含有高葡萄糖、25mmhepes緩沖液和谷氨酰胺、10％fbs、1xp/s、1mm丙酮酸鈉的dmem)中。il-13(15ng/ml)或il-4(1ng/ml)處理前24小時(shí)。細(xì)胞在96孔板上按0.05x106/ml接種在不含hgm-csf的完全培養(yǎng)基中。在加入到細(xì)胞之前，在37℃預(yù)溫育系列稀釋的具有對(duì)應(yīng)細(xì)胞因子的抗體30分鐘。細(xì)胞培養(yǎng)了72小時(shí)(37℃、5％co2)。加入了celltiter96aqueous的mts/pms溶液。然后孵育細(xì)胞3小時(shí)。該階段后，在490nm利用一個(gè)培養(yǎng)板讀數(shù)器記錄吸光度。用speed軟件計(jì)算了ic50值。人源化b-b13變異體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和中和活性示于表3中(nt、未測(cè))。表3與原來(lái)的鼠b-b13(13倍)和嵌合b-b13(6倍)相比，一種人源化的b-b13變異體，hub-b13vl3xvh2，具有顯著更高的親和力。當(dāng)這些人源化的抗il-13抗體用于治療哮喘患者時(shí)，改善的親和力可導(dǎo)致效能和效力的提高。此外，用于人時(shí)，與鼠抗體或嵌合抗體相比，人源化抗體可具有降低的免疫原性。人源化8d4-8變異體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和中和活性示于表4中。表4與原來(lái)的鼠8d4-8(11倍)和嵌合8d4-8(2倍)相比，一個(gè)人源化的8d4-8變異體，hu8d4-8vl1xvh1，具有顯著更高的親和力。當(dāng)這個(gè)人源化的抗il-4抗體用于治療哮喘患者時(shí)，改善的親和力可導(dǎo)致效能和效力的提高。此外，用于人時(shí)，與鼠抗體或嵌合抗體相比，人源化抗體可具有降低的免疫原性。實(shí)施例7：人源化抗il-4/il-13雙特異抗體的克隆和生成用于表達(dá)雙特異抗體(bsab)的形式是us5,989,830描述的雙結(jié)構(gòu)域雙頭形式的igg變體。這一形式中，igg分子在其相應(yīng)的重鏈和輕鏈的n端被第二個(gè)抗體的另外一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域延伸。因此，得到的igg分子是個(gè)由兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈組成的異四聚體。重鏈由兩個(gè)可變的重結(jié)構(gòu)域(vh1-vh2)組成，來(lái)自由連接體連接在一起的兩個(gè)不同的抗體，所述連接體由十個(gè)氨基酸(g4s)2組成，并且被融合到igg4恒定結(jié)構(gòu)域。輕鏈由兩個(gè)可變的輕域(vl1-vl2)組成，來(lái)自由連接體連接在一起兩個(gè)不同抗體，所述連接體由十個(gè)氨基酸(g4s)2組成，并被融合到恒定κ區(qū)域。8d4-8變體的可變重結(jié)構(gòu)域和輕結(jié)構(gòu)域的序列是由pcr產(chǎn)生的，在其各自的編碼(g4s)2-(ggatcc)-8d4-8之一部份的5’-端引入了bamhi限制位點(diǎn)(ggatcc)。8d4-8人源化變異體vh的3’序列以apai限制位點(diǎn)(編碼ch1結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)氨基酸)結(jié)束，用于后面融合到ighg4序列(缺失了末端lys并帶有s241p和l248e雙突變的q569f4)。vl8d4-8的3’-端以編碼恒定κ鏈的前兩個(gè)氨基酸的bsiwi限制位點(diǎn)結(jié)束，用于后面融合到igkc(genebank登錄號(hào)q502w4)。b-b13變體的可變重結(jié)構(gòu)域和輕結(jié)構(gòu)域的序列是由pcr產(chǎn)生的，在其各自的編碼(g4s)2-(b-b13)-(ggaggcggagggtccggaggcggaggatcc(seqidno:7))之一部份的3’-端引入了bamhi限制位點(diǎn)。b-b13變異體的vh和vl序列是由nhei限制位點(diǎn)在其各自的5’-端產(chǎn)生的，接著是atg起始密碼子和編碼序列的前導(dǎo)肽。b-b13和8d4-8的vh透過(guò)它們的bamhi位點(diǎn)在(g4s)2連接體內(nèi)被融合到一起。b-b13和8d4-8的vl透過(guò)它們的bamhi位點(diǎn)在(g4s)2連接體內(nèi)被彼此融合到。因此，產(chǎn)生的重鏈和輕鏈的串聯(lián)具有以下組成。雙特異抗體重鏈：nhei-前導(dǎo)肽-vh-b-b13-(g4s)2-vh8d4-8-apai。雙特異抗體輕鏈：nhei-前導(dǎo)肽-vl-b-b13-(g4s)2-vl8d4-8-bsiwi。所有pcr中間片段用invitrogentopota克隆試劑盒(目錄號(hào)：45-0641)克隆到4-topo中，并用m13正向和m13反向引物進(jìn)行測(cè)序。序列確認(rèn)后，重鏈串聯(lián)通過(guò)其apai位點(diǎn)融合到ighg4序列，可變的輕鏈串聯(lián)透過(guò)其bsiwi位點(diǎn)融合到igkc。產(chǎn)生的雙結(jié)構(gòu)域重鏈和輕鏈用nhei和hindiii消化，每個(gè)被連接到游離型基因表達(dá)載體pxl的nhei/hindiii位點(diǎn)中，分別產(chǎn)生了用于tbti重鏈和輕鏈哺乳動(dòng)物表達(dá)的質(zhì)粒。根據(jù)下面表5所示的b-b13和8d4-8的人源化vh和vl形式的組合，產(chǎn)生了四個(gè)人源化雙特異抗il-4/抗il-13構(gòu)建體。表5雙特異抗il-4/抗il-13ab抗il-13fv抗il-4fvhutbti3_1_1b-b13vl3xvh28d4-8vl1xvh2hutbti3_2_1b-b13vl3xvh28d4-8vl1xvh1hutbti3_1_2b-b13vl2xvh28d4-8vl1xvh2hutbti3_2_2b-b13vl2xvh28d4-8vl1xvh1實(shí)施例8：人源化雙特異抗體的表征結(jié)合和中活性測(cè)定按上面實(shí)施例中的說(shuō)明進(jìn)行。表6給出了四個(gè)人源化的抗il-4/il-13抗體變異體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。所有四個(gè)雙特異抗體構(gòu)建體均以高親和力結(jié)合到il-4和il-13。表6人源化抗il-4/il-13雙特異抗體變異體的中和活性總結(jié)于表7中。hutbti3-1_1和hutbti3-2_1完全中和了il-13或il-4誘導(dǎo)的tf-1細(xì)胞增殖，ic50如下所示。表7眾所周知，突變的il-13等位基因高頻率的與哮喘相關(guān)聯(lián)(heinzmanna.等人,2000,hummolgenet9,4,第549-559頁(yè))。因此，研究了雙特異抗體對(duì)突變的il-13蛋白質(zhì)(人il-13r112q變體，peprotech,rockyhill,nj,usa)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明，hutbti3-1_1和hutbti3-2_1與il-13變異體的結(jié)合和與野生型il-13的結(jié)合類似。表8顯示人源化抗il-4/il-13分子與突變的il-13蛋白質(zhì)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。表8序列表<110>塞諾菲-安萬(wàn)特股份有限公司(sanofi-aventisusinc)e·勞(rao,ercole)v·米科爾(mikol,vincent)d·李(li,danxi)j·克魯伊普(kruip,jochen)m·戴維森(davison,matthew)<120>與il-4和/或il-13結(jié)合的抗體及其用途<130>us2008/020<160>7<170>patentin版本3.5<210>1<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化小鼠/小鼠vl3區(qū)域<400>1aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercysargalasergluservalaspsertyr202530glyglnsertyrmethistrptyrglnglnlysalaglyglnpropro354045lysleuleuiletyrleualaserasnleugluserglyvalproala505560argpheserglyserglyserargthraspphethrleuthrileasp65707580provalglnalagluaspalaalathrtyrtyrcysglnglnasnala859095gluaspserargthrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105110<210>2<211>118<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化小鼠/小鼠vh2區(qū)域<400>2gluvalglnleulysgluserglyproglyleuvalalaproglygly151015serleuserilethrcysthrvalserglypheserleuthraspser202530serileasntrpvalargglnproproglylysglyleuglutrpleu354045glymetiletrpglyaspglyargileasptyralaaspalaleulys505560serargleuserileserlysaspserserlysserglnvalpheleu65707580glumetthrserleuargthraspaspthralathrtyrtyrcysala859095argaspglytyrpheprotyralametaspphetrpglyglnglythr100105110servalthrvalserser115<210>3<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化小鼠/小鼠vl1區(qū)域<400>3aspileglnmetthrglnserproalaserleuservalservalgly151015aspthrilethrleuthrcyshisalaserglnasnileaspvaltrp202530leusertrppheglnglnlysproglyasnileprolysleuleuile354045tyrlysalaserasnleuhisthrglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrglyphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspilealathrtyrtyrcysglnglnalahissertyrprophe859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelysarg100105<210>4<211>124<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化小鼠/小鼠vh1區(qū)域<400>4glnvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala151015servallysilesercyslysalaserglytyrserphethrsertyr202530trpilehistrpilelysglnargproglyglnglyleuglutrpile354045glymetileaspproseraspglygluthrargleuasnglnargphe505560glnglyargalathrleuthrvalaspgluserthrserthralatyr65707580metglnleuargserprothrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095thrargleulysglutyrglyasntyraspserphetyrpheaspval100105110trpglyalaglythrleuvalthrvalserserala115120<210>5<211>124<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化小鼠/小鼠vh2區(qū)域<400>5glnvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala151015servallysilesercyslysalaserglytyrserphethrsertyr202530trpilehistrpilelysglnargproglyglnglyleuglutrpile354045glymetileaspalaseraspglygluthrargleuasnglnargphe505560glnglyargalathrleuthrvalaspgluserthrserthralatyr65707580metglnleuargserprothrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095thrargleulysglutyrglyasntyraspserphetyrpheaspval100105110trpglyalaglythrleuvalthrvalserserala115120<210>6<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>連接體<400>6glyglyglyglyserglyglyglyglyser1510<210>7<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>7ggaggcggagggtccggaggcggaggatcc30當(dāng)前第1頁(yè)12