通用樣品制備的制作方法

本申請是申請日為2011年7月27日、中國申請?zhí)枮?01180035818.1、發(fā)明名稱為“通用樣品制備”的發(fā)明申請的分案申請。發(fā)明領域本發(fā)明屬于體外診斷學領域。具體而言，在此領域內，其關注用于診斷目的的核酸的樣品制備。更精確地，本發(fā)明提供了一種用于自多種不同類型的流體樣品至少同時分離第一和第二靶核酸的方法。發(fā)明背景自復雜的生物學混合物諸如例如臨床樣品分離生物學材料諸如核酸或蛋白質具有相當大的意義，尤其對于診斷目的。核酸樣品制備的診斷性應用的例子包含病毒諸如人乳頭狀瘤病毒(hpv)、西尼羅病毒(wnv)的制備及隨后的檢測或針對人免疫缺陷病毒(hiv)、乙肝病毒(hbv)和/或丙肝病毒(hcv)的存在的獻血常規(guī)篩選。此外，所述擴增技術適用于細菌性靶物諸如分枝桿菌或沙眼衣原體(chlamydiatrachomatis)和淋病奈瑟氏球菌(neisseriagonorrhoeae)，或對腫瘤標志物的分析。本領域中已經(jīng)開發(fā)出眾多不同方法，例如，將樣品中不期望的組分變性、沉淀并除去，隨后沉淀并分離所討論的分析物(例如基于醇的核酸沉淀)。另一種辦法是將相應的生物學材料結合至固體支持材料，所述固體支持材料可以例如以層析柱形式提供。出于診斷目的，且尤其為了自動化分離隨后進行中或高通量分析的生物學材料，經(jīng)常使用結合顆粒。這類顆粒可以具有功能化表面，即它們經(jīng)常用抗體、核酸捕捉探針等包被以結合期望的分析物?；蛘撸鼈兛梢跃哂形葱揎椀谋砻嬷T如特別用于核酸分離的玻璃表面。然而，出于診斷目的而有待分析的靶核酸可以存在于多種不同來源中。實際上，通常使用于不同來源中核酸的樣品制備規(guī)程適合于：1.流體樣品的類型2.核酸的類型。在從不同來源分離不同核酸時，也可能不得不考慮其它標準?，F(xiàn)有技術已經(jīng)通過對所述不同類型的樣品提供不同制備方法解決了此多樣性。本發(fā)明提供了用于從多種不同類型的流體樣品至少分離第一和第二靶核酸的改良方法。發(fā)明描述本發(fā)明提供了一種用于從多種不同類型的流體樣品至少同時分離第一和第二靶核酸的方法。在第一個方面，本發(fā)明涉及一種用于從多種不同類型的流體樣品至少同時分離第一和第二靶核酸的方法，所述方法包括下列自動化步驟a.在與流體樣品數(shù)目對應的數(shù)目的容器中將固體支持材料和所述多種不同類型的流體樣品在一定條件下組合在一起達一段時間，該條件和時間段足以允許包含所述靶核酸的核酸在所述固體支持材料上固定化，b.在分離站中將所述固體支持材料自存在于所述流體樣品中的其它物質分離，c.在分離站中純化所述核酸，其通過將所述流體樣品與所述固體支持材料分開，并將所述固體支持材料用清洗緩沖液清洗一次或多次進行，其中物理條件和所述時間段對于所述多種不同類型的流體樣品的成員是相同的。特別但不僅對于具有高樣品通量的臨床實驗室，高度有利的是提供用于從多種不同類型的流體樣品快速、簡便且可靠地同時分離多種靶核酸的這類改良方法。包括上文提及的自動化步驟的方法展示出多種優(yōu)點。首先，將依照本發(fā)明的樣品制備規(guī)程與例如rna逆轉錄和靶核酸擴增以自動化方式組合顯著降低對手動干預的需要以及由此潛在的污染風險。此外，提供其中有多種不同樣品，即不同核酸來源的單一方法的可能性顯著促成降低核酸診斷的總體復雜性。如果例如不得不對每種類型的流體樣品應用不同方法，就像現(xiàn)有技術中的情況那樣，那么樣品制備是復雜、耗時且資源密集得多的。通常，必須采用不同試劑，這導致成本增加，并且阻礙快速且不復雜的自動化解決辦法的開發(fā)。依照本發(fā)明的樣品制備展現(xiàn)出適合于處理含有不同類型核酸諸如例如dna和rna的多種不同樣品類型的靈活性和工作流。不同來源，即樣品類型包含所有種類的人體液，諸如例如血液、痰、鼻拭樣、尿液、汗液或其它，等等。依照本發(fā)明的方法需要相當少的動手實踐時間，并且測試的實施比現(xiàn)有技術中使用的樣品制備方法簡單得多。依照本發(fā)明的方法在例如臨床病毒學領域中提供一項主要的優(yōu)點，因為其允許平行實驗中數(shù)種病毒的平行樣品制備和優(yōu)選地下游擴增。該方法特別可用于管理需要頻繁的病毒監(jiān)測的移植后患者。由此，依照本發(fā)明的方法促進節(jié)省成本的診斷學，并且促成抗病毒劑的使用和病毒性并發(fā)癥以及住院的降低。這同樣適用于臨床微生物學領域。一般而言，效率會在更快的周轉時間和改善的測試靈活性方面增加。因此，這導致做出診斷對患者要求的測試運行數(shù)目的降低和潛在更短的住院期(例如如果可以更快地提供診斷，那么需要抗微生物療法的患者會更快地接受它，并且因此更早恢復)。另外，患者顯示更小的發(fā)病率，并且因此引起更少的支持療法(例如敗血癥診斷延遲相關的加強監(jiān)護)相關成本。更快地提供陰性結果對于抗生素的開藥過量可以具有重要的含意。例如，如果使用依照本發(fā)明的方法獲得的測試結果能夠比用標準樣品制備方法，接著用例如實時pcr更快地排除病原體，那么就不會迫使臨床醫(yī)師使用經(jīng)驗抗生素。或者，如果使用經(jīng)驗抗生素，那么可以縮短相應治療的持續(xù)時間。就設計一種包括用依照本發(fā)明的方法的樣品制備的測定法而言，熟練技術人員會特別但不僅僅受益于下列優(yōu)點：·軟件復雜性的降低(導致編程錯誤的風險降低)·將測定法開發(fā)努力聚焦于化學優(yōu)化而非化學以及儀器控制參數(shù)·可靠得多的系統(tǒng)，因為總是使用單一方法，并且可以最佳地設計硬件來實施此方案·給實施依照本發(fā)明方法的熟練技術人員提供作為同一過程的部分平行運行多種不同分離的靈活性·成本降低。在本發(fā)明的意義中，核酸的“純化”、“分離”或“提取”指如下的情況：可以在診斷測定法中例如通過擴增分析核酸前，通常必須從含有不同組分的復雜混合物的生物學樣品中將它們純化、分離或提取。對于第一步，可以使用允許核酸富集的方法。經(jīng)常，要分析的核酸在所討論的流體樣品內的溶液中不是游離的，而是位于閉合結構諸如例如細胞或病毒內。在診斷用測定法中，目的經(jīng)常是特別是鑒定流體樣品諸如臨床樣品中病原性細胞或病毒。這類病原體可以例如包含rna病毒如例如人免疫缺陷病毒(hiv)、丙肝病毒(hcv)、西尼羅病毒(wnv)、人乳頭狀瘤病毒(hpv)、日本腦炎病毒(jev)、圣路易斯(st.louis)腦炎病毒(slev)和其它，或dna病毒如例如乙肝病毒(hbc)、巨細胞病毒(cmv)和其它，或細菌如例如沙眼衣原體(ct)、淋病奈瑟氏球菌(ng)和其它。依照本發(fā)明的方法對于從上文提及的以及其它的生物體中提取核酸是有用的。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文描述的方法，其中步驟a.進一步包括將核酸從其細胞和/或病毒環(huán)境中釋放，其通過裂解多種不同流體樣品中潛在存在的細胞和/或病毒殼體進行。為了釋放細胞或病毒顆粒的內容物，可以將它們用酶或化學藥品處理以將細胞壁或病毒顆粒溶解、降解或變性。此過程通常被稱為裂解。所得的含有這類裂解材料的溶液被稱為溶胞物。適合于裂解細胞和/或病毒殼體或類似結構的試劑通常在裂解緩沖液內提供。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，上文所描述的方法在步驟a.中進一步包括向多種不同流體樣品添加裂解緩沖液。由于依照本發(fā)明的方法對于高通量、效率和并行化是特別有利的，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述裂解緩沖液對于所述多種不同類型的流體樣品的成員是相同的。那樣，樣品制備規(guī)程的復雜性得到進一步降低，因為不必對要處理的不同樣品單個提供不同裂解試劑。此外，該規(guī)程在用單一裂解緩沖液工作時可以更容易地控制?？梢岳缬枚嗦芬埔汗軓膯蝹€容器中取出裂解緩沖液，隨后同時分配到不同樣品中。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，上文所描述的方法中的裂解緩沖液包含一種或多種選自下組的組分：·離液劑·緩沖物質·醇·還原劑。離液劑(其通常擾亂溶液中水分子的有序結構以及分子之中和之間的非共價結合力)可以對樣品制備規(guī)程做出數(shù)種貢獻。具體但不僅僅，它們可以通過擾亂核酸酶三級結構作為rna酶抑制劑應用。通常，不必對裂解緩沖液應用另外的rna酶抑制劑。除此之外，離液劑還促成對生物膜，諸如質膜或細胞器膜(若存在的話)的破壞。還有，它們可以在核酸對表面如玻璃的粘著結合中起重要的作用(見下文)。在本發(fā)明上下文中優(yōu)選的離液劑是胍鹽如硫氰酸胍或鹽酸胍或氯化胍或異硫氰酸胍、尿素、過氯酸鹽諸如例如過氯酸鉀、其它硫氰酸鹽或碘化鉀。特別優(yōu)選的是硫氰酸胍。然而，在本發(fā)明的范圍內也可以使用其它離液劑。一般地，緩沖物質對于維持溶液中某個ph值或ph范圍是重要的。這是大多數(shù)生物學系統(tǒng)的先決條件，并且通常對于體外反應也是期望的。它對于本發(fā)明的方法也可以是有利的。在本發(fā)明上下文中優(yōu)選的緩沖液是檸檬酸鹽緩沖液諸如檸檬酸鈉，而且還有tris(三-(羥甲基)-氨基甲烷)緩沖液諸如trishcl、磷酸鹽、n-(2-羥乙基)-哌嗪-n’-(2-乙磺酸)(hepes)、乙酸鹽緩沖液，而且也可以在本發(fā)明上下文中使用其它緩沖液。在用于核酸制備的裂解緩沖液中使用醇也可以是有利的，如本領域中技術人員已知的。在本發(fā)明上下文中特別優(yōu)選的是使用聚多卡醇(polidocanol)，而其它醇也可以在上文所描述的裂解緩沖液中使用。聚多卡醇用于制備核酸的用途已經(jīng)例如記載于ep1932913中。還原劑也可以促成不期望的組分諸如上文提及的rna酶a的變性。具體地，如本領域中公知的還原劑切割對于許多蛋白質的三級結構特別重要的分子間和分子內二硫鍵。在本發(fā)明上下文中優(yōu)選的是還原劑諸如二硫蘇糖醇(dtt)，但是也可以在本發(fā)明的上下文中有利地采用本領域中已知的其它還原劑諸如例如2-巰基乙醇。由上述內容看來，本發(fā)明的一個優(yōu)選方面是上文所描述的方法，其中所述裂解緩沖液包含下列組分：·硫氰酸胍，·檸檬酸鈉，·聚多卡醇，·dtt。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，上文提及的裂解緩沖液組分的濃度如下：·硫氰酸胍：4m·檸檬酸鈉：50mm·聚多卡醇：5％w/v·dtt：2％w/v。上文所描述的裂解緩沖液的ph并不限于特定ph值。然而，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述裂解緩沖液具有酸性ph，更優(yōu)選地5.5-6.5，最優(yōu)選地約5.8的ph。在裂解過程中經(jīng)常遇到的問題是降解感興趣組分的其它酶，例如降解核酸的脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶諸如上文提及的rna酶在裂解規(guī)程過程中與感興趣的組分接觸。這些降解酶也可以存在于細胞外部或在裂解前可能已經(jīng)在不同細胞區(qū)室中空間分隔。當裂解發(fā)生時，感興趣的組分變得暴露于所述降解酶。在此過程期間釋放的其它組分可以例如是屬于對細胞有毒的脂多糖類家族的內毒素，并且可以對意圖用在人或動物療法中的產(chǎn)品引起問題。有多種手段來處理上文提及的問題。當意圖釋放核酸時，通常使用離液劑(如上文所描述)或陰離子、陽離子、兩性離子或非離子型去污劑。使用快速降解先前描述的酶或不期望的蛋白質的蛋白酶也是一種優(yōu)點。然而，這可能產(chǎn)生另一個問題，因為所述物質或酶能在隨后步驟中干擾試劑或組分。在上文提及的這類裂解或樣品制備過程中優(yōu)選使用的酶是如下的酶，其切割蛋白質底物中的酰胺連接，并且分類為蛋白酶，或(互換地)肽酶(參見walsh,1979,enzymaticreactionmechanisms.w.h.freemanandcompany,sanfrancisco，第3章)?，F(xiàn)有技術中使用的蛋白酶包含堿性蛋白酶(wo98/04730)或酸性蛋白酶(us5,386,024)。在現(xiàn)有技術中已經(jīng)在核酸分離中廣泛用于樣品制備的蛋白酶是來自白色念球菌(tritirachiumalbum)的蛋白酶k(參見例如sambrookj.等,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989)，其在中性ph左右是有活性的，并且屬于本領域技術人員稱為枯草桿菌蛋白酶的蛋白酶家族。在上文提及的裂解或樣品制備方法中特別優(yōu)選使用的是酶esperase，即一種在高堿度和于高溫兩者都保留其活性的強力的蛋白酶(ep1201753)。在裂解步驟后的樣品制備步驟中，進一步富集感興趣的組分。如果感興趣的非蛋白質性組分是例如核酸，那么通常在將它們在基于探針的測定法中使用前從復雜的裂解混合物提取它們。有數(shù)種用于核酸純化的方法：序列依賴性的或生物特異性的方法如例如：·親和層析·與固定化的探針雜交不依賴于序列的或物理化學的方法如例如：·用例如酚-氯仿進行的液體-液體萃取·用例如純乙醇進行的沉淀·用濾紙進行的提取·用微團形成劑如鯨蠟基三甲基溴化銨進行的提取·結合固定化的嵌合染料，例如吖啶衍生物·吸附至硅膠或硅藻土(diatomicearth)·在離液序列高的(chaotropic)條件下吸附至磁性玻璃顆粒(mgp)或有機硅烷顆粒。對于純化目的特別感興趣的是將核酸吸附至玻璃表面，盡管其它表面也是有可能的。近年來已經(jīng)提出了許多通過利用核酸對玻璃表面的結合行為用于將其從其天然環(huán)境中分離出來的規(guī)程。如果未修飾的核酸是靶物，那么優(yōu)選將核酸直接結合至硅土表面的材料，因為核酸不必進行修飾，而且甚至可以結合天然核酸，等等。這些方法由多份文件詳細地描述。例如，在vogelsteinb.等,proc.natl.acad.usa76(1979)615-9中，提出了一種用于將來自瓊脂糖凝膠的核酸在存在碘化鈉的情況下結合到磨砂火石玻璃的規(guī)程。在存在過氯酸鈉的情況下在玻璃粉上自細菌純化質粒dna記載于markom.a.等,anal.biochem.121(1982)382-387。在de-a3734442中，描述了在玻璃纖維濾器上分離單鏈m13噬菌體dna，其通過使用乙酸將噬菌體顆粒沉淀，并用高氯酸鹽裂解噬菌體顆粒來進行。清洗結合到玻璃纖維濾器的核酸，然后用含有甲醇的tris/edta緩沖液洗脫。一種用于從λ噬菌體純化dna的類似規(guī)程記載于jakobir.等,anal.biochem.175(1988)196-201。該規(guī)程需要使核酸在離液鹽溶液中選擇性結合玻璃表面以及將核酸與污染物諸如瓊脂糖、蛋白質或細胞殘留物分開。為了將玻璃顆粒與污染物分開，可以將該顆粒離心或者將流體抽過玻璃纖維濾器。然而，這是一個限制步驟，其阻止該規(guī)程用于加工大量樣品。在通過添加鹽和乙醇進行沉淀后使用磁性顆粒來固定化核酸是更有利的，并且記載于例如aldertonr.p.等,s.,anal.biochem.201(1992)166-169和pctgb91/00212中。在此規(guī)程中，將核酸與磁性顆粒一起凝集。通過應用磁場并實施清洗步驟將凝集物與初始溶劑分開。在一個清洗步驟后，將核酸溶解于tris緩沖液中。然而，此規(guī)程具有的缺點在于沉淀對于核酸不是選擇性的。更確切地，也將多種固體和溶解的物質凝集。因此，不可以使用此規(guī)程來除去可能存在的、特定酶促反應的大量的任何抑制劑。磁性多孔玻璃也是商品化的，其在多孔特殊玻璃基質中含有磁性顆粒，并且用含有鏈霉親合素的層覆蓋。如果生物學材料例如蛋白質或核酸在復雜的制備步驟中修飾，從而它們共價結合生物素，那么可以使用此產(chǎn)品來分離它們?？纱呕奶厥馕絼┳C明為對于自動樣品制備是非常有效且合適的。出于此目的，使用亞鐵磁性和鐵磁性以及超順磁性(superparamagnetic)色素。最優(yōu)選的磁性玻璃顆粒和使用它們的方法是那些記載于wo01/37291中的。依照r.boom等(jclinmicrobiol.28(1990),495-503)的方法特別可用于本發(fā)明上下文中的核酸分離?？梢酝ㄟ^改編所述方法中使用的相應流體樣品的體積來進一步改進依照本發(fā)明的方法的靈活性。此實施方案聚焦于不同類型的流體樣品和可能地生物體及其內存在的核酸類型的多樣性。例如，全血樣品中的某些病毒可能比其它樣品需要更多的起始材料(若已知在這些特定情況中通常僅存在低拷貝數(shù))。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述多種不同流體樣品中的至少一種流體樣品與其它流體樣品具有不同的體積?；蛘?另外，還優(yōu)選的是，向所述多種不同流體樣品添加不同體積的裂解緩沖液。在又一個優(yōu)選的實施方案中，當所述多種不同流體樣品中的至少一種流體樣品與其它流體樣品具有不同體積時，向樣品添加裂解緩沖液，使得所有樣品在添加后具有相同體積。在此實施方案中，對不同樣品同時實施自動化方法甚至是更方便的。在此辦法中組合如下的優(yōu)點，即能夠根據(jù)樣品類型來選擇適當?shù)钠鹗俭w積及對于實施分離和任選地，例如擴增和檢測具有相同體積。術語“固體支持材料”包含就核酸固定化而言的、上文提及的任何固體材料，例如磁性玻璃顆粒、玻璃纖維、玻璃纖維濾器、濾紙等，盡管固體支持材料并不限于這些材料。本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述固體支持材料包含核酸結合顆粒和核酸，所述核酸結合顆粒優(yōu)選是一種或多種選自下組的材料：硅土、金屬、金屬氧化物、塑料、聚合物。在本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述固體支持材料是磁性玻璃顆粒?！肮潭ɑ痹诒景l(fā)明的上下文中意指以可逆或不可逆的方式捕捉對象諸如例如核酸。具體地，“在固體支持材料上固定化”意指出于將其與任何周圍介質分開的目的，使一種或多種對象與固體支持材料結合，并且可以例如通過在后來的點時與固體支持材料分開來回收。在此上下文中，“固定化”可以例如包括將核酸吸附至玻璃或固體材料的其它合適的表面，如上文所描述的。此外，可以通過結合捕捉探針來特異性“固定化”核酸，其中核酸通過堿基配對而結合附著于固體支持物的、基本上互補的核酸。在后一種情況中，這類特異性固定化導致靶核酸的優(yōu)勢結合?！巴瑫r”在本發(fā)明的意義中意味著同時且在相同物理條件下實施兩種行為，諸如擴增第一和第二或更多種核酸。在一個實施方案中，在一個容器中實施至少第一和第二靶核酸的同時擴增。在另一個實施方案中，在一個容器中用至少一種核酸而在第二容器中用至少第二種核酸同時且在相同物理條件(特別就溫度和溫育時間而言)下實施同時擴增。“第一靶核酸”和“第二靶核酸”是不同的核酸?！傲黧w樣品”是可以進行靶向核酸的診斷用測定法的任何流體材料，并且優(yōu)選地，自生物學來源衍生。還優(yōu)選地，流體樣品自人衍生，并且是體液。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，流體樣品是人血液、尿液、痰、汗液、拭樣、可移液的糞、或脊髓液。最優(yōu)選地，流體樣品是人血液。術語“反應容器”包含但不限于，管或板諸如微孔、深孔或其它類型多孔板的孔，其中發(fā)生用于分析流體樣品的反應諸如例如逆轉錄或聚合酶鏈式反應。這類容器的外部界限或壁是化學惰性的，使得它們不干擾之內發(fā)生的分析反應。優(yōu)選地，如上文所描述的核酸分離也在多孔板中實施。在此背景中，分析系統(tǒng)中的多孔板允許多種樣品的平行分離和分析或貯存?？梢詫Χ嗫装鍍?yōu)化最大液體攝取，或得到最大熱轉移。用于本發(fā)明上下文中的優(yōu)選的多孔板是經(jīng)過優(yōu)化的，以在自動化分析儀中溫育或分離分析物。優(yōu)選地，多孔板構建并排列為接觸磁性裝置和/或加熱裝置。所述優(yōu)選的多孔板(可互換地，其在本發(fā)明的上下文中稱作“加工板”)，包含：-包含成行排列的、頂部有開口的多個容器的頂部表面。容器包含上部部分、中心部分和底部部分。上部部分與多孔板的頂部表面連接，并且包含兩個較長側和兩個較短側。中心部分具有實質上矩形的橫截面，其具有兩個較長側和兩個較短側；-兩個相向的較短的和兩個相向的較長的側壁，和-基部，其中所述基部包含開口，該開口構建并排列為將多孔板置于與所述磁性裝置和/或加熱裝置的接觸中。在多孔板的一個優(yōu)選的實施方案中，一行內相鄰的容器在所述幾乎矩形形狀的較長側上連接。優(yōu)選地，多孔板包含位于容器的相鄰行間的連續(xù)空間。所述連續(xù)空間構建并排列為容納板形狀的磁性裝置。在一個優(yōu)選的實施方案中，容器的底部部分包含球形底部。在一個更優(yōu)選的實施方案中，容器的底部部分包含位于所述中心部分和所述球形底部之間的圓錐部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述頂部表面包含圓拱(rib)，其中所述圓拱圍繞所述容器的開口。優(yōu)選地，容器的所述上部部分的一個較短側包含凹口(recess)，所述凹口包含從圓拱延伸到該容器內側的彎曲表面。此外，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述容器包含圓形內側形狀。為了固定到加工或溫育站，優(yōu)選地，基部包含含有凹口的邊緣。分析儀站上的閂鎖夾(latchclip)可以銜接所述凹口以將板固定在站上。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述容器包含基本上恒定的壁厚度。在本發(fā)明上下文中優(yōu)選的加工板(101)是1組件板。其頂部表面(110)包含多個容器(103)(圖5、圖6)。每個容器在頂部具有開口(108)，并且在底部端(112)是閉合的。頂部表面(110)包含圓拱(104)，優(yōu)選地，其相對于頂部表面(110)是升高的，并且圍繞容器(103)的開口(108)。這防止可能落到板(101)的頂部表面(110)上的液滴污染容器(103)的內容物。在圖3至8中顯示了優(yōu)選的加工板的視圖。優(yōu)選地，加工板(101)的足跡包含對應于ansisbs足跡形式的基部長度和寬度。更優(yōu)選地，長度為127.76mm+/-0.25mm，而寬度為85.48mm+/-0.25mm。因此，該板(101)具有兩個相向的較短的側壁(109)和兩個相向的較長的側壁(118)。加工板(101)包含用于與輸送裝置(handler)(500，圖12)相互作用的形式鎖定元件(106)?？梢詫⒓庸ぐ?101)在維持正確取向和位置的情況中以高速快速且安全地夾緊、轉運并定位。優(yōu)選地，用于夾緊的形式鎖定元件(106)位于加工板(101)的上部中心部分，優(yōu)選地，上部中心的三分之一內。這具有的優(yōu)點在于加工板(101)的潛在扭曲對形式鎖定元件(106)只具有較小的影響，而且板(101)的操作更強力。優(yōu)選地，加工板(101)包含硬件標識符(102)和(115)。硬件標識符(102)和(115)是加工板(101)獨特的，并且不同于同一系統(tǒng)中使用的其它消耗品的硬件標識符。優(yōu)選地，硬件標識符(102、115)在該消耗品側壁上包含隆起部(ridge)(119)和/或凹口(125)，其中所述隆起部(119)和/或凹口(125)的模式對于特定的消耗品類型，優(yōu)選地加工板(101)是獨特的。此獨特模式在本文中也稱為獨特的“表面幾何學”。硬件標識符(102、115)確保用戶僅可以將加工板(101)以正確的取向加載到分析用儀器的適當堆垛機(stacker)位置中。在加工板(101)的側面，包含導向元件(116)和(117)(圖3、圖4)。它們防止加工板(101)傾斜。導向元件(116、117)允許用戶將具有導向元件(116、117)的加工板(101)作為堆垛(stack)加載到分析用儀器中，然后將其在不使板傾斜的情況中在堆垛機中在該儀器內垂直轉移。容器(103)的中心部分(120)具有幾乎為矩形的橫截面(圖6、圖7)。它們沿著幾乎為矩形形狀的較長側(118)以共用壁(113)分隔(圖3)。由此形成的容器(103)行具有的優(yōu)點在于盡管可用的空間有限，但是它們具有大體積，優(yōu)選地為4ml的體積。另一個優(yōu)點在于由于基本上恒定的壁厚度，生產(chǎn)是非常經(jīng)濟的。進一步的優(yōu)點在于容器(103)彼此加強，并且因此可以獲得形狀的高穩(wěn)定性。連續(xù)空間(121)位于容器(103)行之間(圖6、圖7)。該空間(121)可以容納磁體(202、203)或加熱裝置(128)(圖11)。優(yōu)選地，這些磁體(202、203)和加熱裝置(128)是固體裝置。因此，可以將容器(103)中可容納的液體(215)中包含的磁性顆粒(216)從該液體(215)分離，其通過在使磁體(202、203)接近容器(103)時對容器(103)施加磁場來實現(xiàn)?；蛘撸趯⒓庸ぐ?101)置于加熱裝置(128)上時，可以以升高的、受控的溫度溫育容器(103)的內容物。由于磁體(202、203)或加熱裝置(128)可以是固體，因此可以實現(xiàn)高能量密度。容器(103)的中心部分(120)的幾乎矩形的形狀(圖10)還通過優(yōu)化容器(103)和磁體(202)或加熱裝置(128)之間的接觸表面，并且因此增強能量轉移入容器(103)中來優(yōu)化容器壁(109)和扁平形狀的磁體(202)或加熱裝置(128)之間的接觸。在容器的圓錐底部(111)的區(qū)域中，空間(121)甚至更為明顯，并且可以容納更多磁體(203)。容器的上部區(qū)域中大磁體(202)和圓錐區(qū)域中較小磁體(203)的組合允許較大或小體積液體(215)中磁性顆粒(216)的分離。因此，小磁體(203)使得在洗脫物移液過程中扣留磁性顆粒(216)更簡單。這使得通過減少磁性顆粒(216)沉淀物的死體積來以最小的損失移液洗脫物成為可能。此外，使轉移的洗脫物中磁性顆粒(216)的存在最小化。在容器(103)的上部端，容器(103)的較短側壁(109)之一包含延伸至圓周圓拱(104)的試劑入口通道(105)(圖3、4、7)。將試劑移液至試劑入口通道(105)上，并且從通道(105)排入容器(103)中。因此，防止移液管針或尖端(3、4)和容器中含有的液體之間的接觸。此外，防止源自將液體直接分配入容器(103)中含有的另一種液體(215)中的噴濺，其可能引起移液管針或尖端(3、4)或相鄰容器(103)的污染。將小體積試劑，隨后為最大體積的另一種試劑連續(xù)移液入試劑入口通道(105)上確保將僅以少量添加的試劑完全排入容器(103)中。因此，移液小體積的試劑在不損失要實施的測試的準確度的情況中是可能的。在內側，在容器底部(111、112)，形狀變成圓錐形(111)，并且以球形底部(112)為末端(圖6、圖7)。容器的內側形狀(114)(包括矩形中心部分(120))是圓形的。球形底部(112)、圓形內側形狀(114)、圓錐形部分(111)和容器(103)的精細表面的組合產(chǎn)生有利的流體學，其促進加工板(101)中分析物的有效分離和純化。球形底部(112)允許分離洗脫物的基本上完全使用和死體積的降低，這減少試劑遺留物或樣品交叉污染。加工板(101)的基部(129)上的邊緣包含用于銜接加工站(201)或加熱裝置(128)或分析用儀器(126)上的閂鎖夾(124)的凹口(107)(圖5、圖9)。閂鎖夾(124)與凹口(107)的銜接允許加工板(101)在加工站(201)上的定位和固定。凹口(107)的存在允許閂鎖力幾乎與基部(129)垂直地對加工板(101)起作用。因此，僅可以發(fā)生橫向起作用的小力。這降低應變的發(fā)生以及如此加工板(101)的變形。垂直閂鎖力也可以中和加工板(101)的任何變形，從而導致加工站(201)內球形底部(111)的更精確定位。一般地，加工板(101)和分析儀內加工站(201)或加熱裝置(128)之間的精確界面減少死體積，而且還降低樣品交叉污染的風險?！胺蛛x站”是分析用系統(tǒng)中允許固體支持材料自流體樣品中存在的其它材料分離的一種裝置或組件。這類分離站可以例如包括但不限于離心機、過濾管架、磁體、或其它合適的組件。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，分離站包含一個或多個磁體。優(yōu)選地，使用一個或多個磁體來分離作為固體支持物的磁性顆粒，優(yōu)選地，磁性玻璃顆粒。如果例如流體樣品和固體支持材料在多孔板的孔中組合在一起，那么分離站包含的一個或多個磁體可以例如通過將磁體引入孔中來與流體樣品自身接觸，或者可以使所述一個或多個磁體靠近孔的外壁以吸引磁性顆粒，隨后將它們與周圍液體分開。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離站是包含多孔板的裝置，所述多孔板包含具有多孔板頂部表面處開口和閉合底部的容器。該容器包含上部部分、中心部分和底部部分，其中所述上部部分與多孔板的頂部表面連接，并且優(yōu)選地，包含兩個較長側和兩個較短側。中心部分具有含兩個較長側的實質上矩形的橫截面，其中所述容器成行排列。連續(xù)空間位于兩個相鄰行間以使夾具(fixture)上安放的至少一個磁體與處于至少兩個z位置的側壁選擇性接觸。該裝置進一步包含磁性分離站，該磁性分離站包含至少一個夾具。夾具包含至少一個產(chǎn)生磁場的磁體。存在移動機械，其相對于多孔板的容器至少在第一和第二位置之間垂直移動包含至少一個磁體的所述至少一個夾具。優(yōu)選地，容器的所述至少兩個z位置包含所述容器的側壁和底部部分。優(yōu)選地，所述至少一個磁體的磁場在所述至少一個磁體處于所述第一位置時將磁性顆粒拉到容器與所述至少一個磁體相鄰的內表面。所述磁場的效應在所述至少一個磁體處于所述第二位置時小于在所述至少一個磁體處于所述第一位置時。優(yōu)選地，包含所述至少一個磁體的夾具包含框。容器具有優(yōu)選的特征，如上文在多孔板/加工板的背景中描述的。一種這類優(yōu)選特征是所述容器的至少一部分具有與所述容器的軸成直角的實質上矩形的橫截面。在所述第一位置中，所述至少一個磁體與所述容器的所述部分相鄰。相鄰理解為意指極其接近從而對容器的內容物施加磁場，或者與容器有物理接觸。分離站包含接受多孔板的框和附著多孔板的閂鎖夾。優(yōu)選地，分離站包含兩類磁體。下文進一步描述了此優(yōu)選的實施方案。下文描述了第二個優(yōu)選的實施方案，其包含對包含磁體的框施加壓力，使得磁體相對于多孔板的容器擠壓的彈簧。優(yōu)選地，第一磁體構建并排列為與多孔板的容器相互作用以對所述容器中容納的包含磁性顆粒的大體積液體施加磁場。優(yōu)選地，所述第二磁體構建并排列為與多孔板的容器相互作用以對所述容器中容納的包含磁性顆粒的小體積液體施加磁場。所述第一和第二磁體可以移動到不同的z位置。此外，分離和純化核酸的方法在本發(fā)明的上下文和所述分離站中是有用的。該方法包括使核酸在多孔板的容器中與磁性顆粒結合的步驟。所述容器包含上部開口、中心部分和底部部分。然后，當液體的主要部分位于容器中圓錐部分以具有矩形形狀的中心部分替換的截面之上時，如下將結合的材料與液體中含有的未結合的材料分開，即將磁體從第二位置移動到第一位置，并且在所述第一位置中，對中心部分應用磁場，以及任選地，對所述容器的底部部分另外應用磁場。任選地，可以用清洗溶液清洗磁性顆粒。通過對所述容器的底部部分選擇性應用磁場自所述磁性顆粒分離小體積的液體，其中液體的主要部分位于容器中圓錐部分以具有矩形形狀的中心部分替換的截面之下。用于分離與磁性顆粒結合的核酸的磁性分離站在本發(fā)明的上下文中也是有用的，所述分離站包含第一磁體和第二磁體，所述第一磁體構建并排列為與多孔板的容器相互作用以對所述容器中容納的包含磁性顆粒的大體積液體施加磁場，所述第二種磁體構建并排列為與多孔板的容器相互作用以對所述容器中容納的包含磁性顆粒的小體積液體施加磁場，且其中所述第一和第二磁體可以移動到不同的z位置。在本文中描述了磁性分離站的優(yōu)選實施方案。下文描述了對本發(fā)明有用的分離站(201)的第一個優(yōu)選的實施方案。所述分離站(201)的第一個優(yōu)選的實施方案包含至少兩類磁體(202、203)。第一長型磁體(202)構建并排列為適合于加工板(101)的空間(121)。如此，磁體(202)對容器(103)中的液體(215)施加磁場以扣留容器壁內側的磁性顆粒(216)。當存在大體積液體(215)時，這允許磁性顆粒(216)和任何與其結合的材料與容器(103)內側的液體(215)分離。磁體(202)具有伸長的結構，并且構建并排列為與容器的基本上矩形的中心部分(120)相互作用。因此，當液體(215)的主要部分位于容器(103)中圓錐部分(111)以具有矩形形狀的中心部分(120)替換的截面之上時使用磁體(202)。如圖10中顯示的，磁體(202)的優(yōu)選構造包含夾具(204、204a)，該夾具包含適合于加工板(101)中容器(103)行之間的空間(121)的磁體(202)。磁體(202)的另一種優(yōu)選的實施方案包含排列在夾具(204、204a)上的磁體(202)。優(yōu)選的分離站(201)的磁體(203)較小，并且可以與容器(103)的圓錐部分(111)相互作用。這在圖10中顯示。優(yōu)選地，磁體(203)在基部(205)上排列，所述基部可以移動到加工板(101)的空間(121)中。優(yōu)選地，每個磁體(202、203)構建為與兩個相鄰行中的兩個容器(103)相互作用。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述加工板(101)具有每行8個容器(103)的6行。可以與優(yōu)選的加工板(101)相互作用的分離站(201)具有3個包含磁體(202)的夾具(204、204a)和4個包含磁體(203)的基部(205)。還包括一種如下的實施方案，其中所述分離站具有4個包含磁體(202)的磁性夾具(204、204a)和3個包含磁體(203)的磁性基部(205)。所述磁體(202、203)是可移動的。所述分離站(201)包含移動夾具(204、204a)和基部(205)的機械。所有夾具(204、204a)通過基部(217)相互連接，并且因此協(xié)調移動。所有磁體(203)與一個基部(218)連接，并且因此協(xié)調移動。用于移動磁性板(202)和(203)的機械構建并排列為將兩類磁性板(202、203)移動至總共4個末端位置：在圖10小圖a-c中，所述磁體(203)位于加工板(101)的容器(103)的圓錐部分附近。這是磁體(203)的最高位置，并且是分離位置。在此圖中，所述磁體(202)位于最低位置。當它們在此位置時它們不牽涉分離。在圖10中顯示的優(yōu)選實施方案中，磁體(202)的基部(217)與定位輪(206)連接。該基部(217)包含通過移動元件(209)與連接元件(208)柔性接觸的底部末端(207)。所述移動元件構建并排列為將連接元件(208)沿著軌道(212)從一側移動到另一側。所述移動元件(209)用銷(220)固定到連接元件(208)。所述連接元件(208)通過螺釘(210)固定到定位輪(206)。連接元件(208)也與軸(211)連接。優(yōu)選地，所述連接元件(208)是矩形板。當定位輪(206)繞著軸(211)偏心移動，使得螺釘(210)從高于偏心軸的點移動到低于偏心軸的點時，使移動元件(209)和附著有磁體(202)的基部(204)的底部末端(207)從最高位置移動到最低位置。基部(218)在底部部分(219)上安放，并且在其較低末端用銷(213)與移動元件(214)連接，優(yōu)選地，所述移動元件是輪，其與定位輪(206)相互作用。當定位輪(206)繞軸(211)旋轉時，輪(214)沿著定位輪(206)移動。如果輪(214)位于定位輪(206)中離軸(211)的距離較短的截面上，那么磁體(203)處于其最低位置。如果輪(214)位于定位輪(206)中離軸(211)的距離最大的截面上時，磁體(203)處于其最高位置。因此，在分離站的第一個實施方案的優(yōu)選實施方案中，磁體(203)的位置受定位輪(206)形狀控制。當移動元件(209)沿著軌道(212)的中心、圓形的上部或下部部分(212a)移動時，小型磁體(203)上下移動。當移動元件(209)位于底部末端(207)的側面(212b)并且向上或向下移動時，磁體(202)向上或向下移動。定位輪可以由任何電動機(224)旋轉。在一個優(yōu)選的實施方案中，彈簧(225)附著于分離站的基部(222)和磁體(203)的基部(218)以確保磁體(203)在其向下移動時移動到最低位置中。如本文中使用的，術語“銷”指任何固定元件，包括螺釘或銷。在第二個優(yōu)選的實施方案中，所述分離站(230)包含至少一個夾具(231)，該夾具包含至少一個磁體(232)，優(yōu)選地，與行(123)中的容器(103)數(shù)目相等數(shù)目的磁體。優(yōu)選地，所述分離站(230)包含與上文中描述的多孔板(101)的行(123)數(shù)目相等數(shù)目的夾具(231)。更優(yōu)選地，6個夾具(231)在分離站(230)上安放。至少一個磁體(232)在一個夾具(231)上安放。優(yōu)選地，磁體(232)數(shù)目等于一行(123)中容器(103)的數(shù)目。最優(yōu)選地，8個磁體(232)在一個夾具上(231)安放。優(yōu)選地，在所述夾具(231)上包含一類磁體(232)。更優(yōu)選地，磁體(232)在朝向與磁體相互作用的容器取向的一側安放。夾具(231)在基部(233)上安放。優(yōu)選地，所述安放是柔性的?；?233)包含安放于其上的彈簧(234)。彈簧(234)的數(shù)目是所述基部(233)上安放的每個夾具(231)至少一個彈簧。該基部進一步包含斜面(236)，其限制彈簧及因此包含磁體(232)的夾具(231)的移動。優(yōu)選地，任一個所述彈簧(234)構建并排列為與夾具(231)相互作用。更優(yōu)選地，所述彈簧(234)是軛式彈簧(yokespring)。所述相互作用控制夾具(231)的水平移動。此外，分離站(230)包含框(235)。具有夾具(231)的基部(233)通過移動機械與框(235)連接，如在上文中對第一個實施方案的磁體(232)描述的。優(yōu)選地，所述基部(233)和夾具(231)構建并排列為(以z方向)垂直移動。將上文中描述的多孔板(101)插入在分離站(230)中。垂直移動包含磁體(232)的夾具(231)。如此，將任一個夾具(232)移動到容器(103)的兩行(123)之間的空間(121)中。垂直移動使安放在夾具(231)上的磁體(232)與容器(103)接觸。根據(jù)容器(103)內側的液體(215)體積選擇z位置。對于大體積，磁體(232)在中心位置(120)中接觸容器(103)，在那里容器(103)具有近似矩形形狀。對于小體積液體(215)(其中液體(215)的主要部分位于容器(103)的中心部分(120)下)，優(yōu)選地，磁體(232)接觸容器(103)的圓錐部分(111)。彈簧附著于任一個框(231)的基部(233)(圖9小圖a)、b))。該彈簧使磁體(232)擠壓容器(103)。這確保在磁性分離過程中磁體(232)和容器(103)之間的接觸。優(yōu)選地，磁體(232)在位于入口(105)下面的側壁(109)上接觸容器(103)。這具有的優(yōu)點在于，通過移液添加的液體流過扣留的磁性顆粒，并且確保將顆粒重懸浮，而且相同處理所有容器中的所有樣品。此實施方案特別適合于在所述多孔板(101)的容器(103)中含有不同水平的液體(215)時將如上文中描述的多孔板(101)中包含的液體(215)與磁性顆粒(216)分開。“清洗緩沖液”是設計為除去不期望的組分(尤其在純化規(guī)程中)的流體。這類緩沖液是本領域中公知的。在核酸純化背景中，清洗緩沖液適于清洗固體支持材料以將固定化的核酸與任何不期望的組分分開。所述清洗緩沖液可以例如在如上文所描述的具有酸性ph且沒有乙醇和/或離液劑的一種或多種緩沖溶液中含有乙醇和/或離液劑。清洗溶液或其它溶液經(jīng)常以儲備溶液提供，所述儲備溶液在使用前必須稀釋。依照本發(fā)明的方法中的清洗需要將固體支持材料及其上固定化的核酸與清洗緩沖液進行程度不同的強烈接觸。不同方法有可能實現(xiàn)這點，例如在相應的一個或多個容器中或與相應的一個或多個容器一起搖動清洗緩沖液及固體支持材料。另一種有利的方法是將包含清洗緩沖液和固體支持材料的懸浮液抽吸并分配一次或多次。優(yōu)選地，使用移液管實施此方法，其中優(yōu)選地，所述移液管包含抽吸所述懸浮液并將其再次分配的一次性移液管尖端。這類移液管尖端在棄去和替換前可以使用數(shù)次。優(yōu)選地，對本發(fā)明有用的一次性移液管尖端具有至少10μl，更優(yōu)選地，至少15μl，更優(yōu)選地，至少100μl，更優(yōu)選地，至少500μl，更優(yōu)選地，至少1ml，甚至更優(yōu)選地，約1ml的體積。在本發(fā)明的上下文中使用的移液管也可以是移液針。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中步驟c.中的所述清洗包含抽吸和分配包含固體支持材料的清洗緩沖液。為了易于操作并促進自動化，優(yōu)選的是將上文提及的容器在整體排列中組合，因此可以一起操作它們。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述容器在整體排列中組合。整體排列可以例如是可逆或不可逆地彼此附著或排列在架中的管形瓶或管。優(yōu)選地，所述整體排列是多孔板。更優(yōu)選地，所述多孔板是深孔板。依照本發(fā)明的方法在要制備不同類型的核酸時是特別有用的，因為提供單一工作流和相同試劑消除由于其不同特性而以單獨方式分離不同類型的核酸，如dna和rna的需要。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一靶核酸包含rna，而所述第二靶核酸包含dna。此外，多種不同流體樣品可以包含不同生物體或者自不同生物體衍生。然后，用相同工作流和試劑同時產(chǎn)生相應的核酸也是有利的。例如，本發(fā)明允許細菌、dna病毒和rna病毒核酸的這類同時制備，盡管它們有不同的結構和特性。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一靶核酸和第二靶核酸來自不同生物體。本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一和/或第二核酸是非病毒性核酸。還有，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一和/或第二靶核酸是細菌核酸。如本文中使用的，“生物體”意指任何活的單細胞或多細胞生命形態(tài)。在本發(fā)明的上下文中，病毒是一種生物體。本發(fā)明在不同核酸要來自多種不同類型的流體樣品時也是有用的。如此，可以在相同物理條件下在平行同時提取中分離不同核酸，然后，可以例如在不同容器中進一步分析性加工。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一核酸存在于第一流體樣品中，而所述第二核酸存在于第二流體樣品中。此類實施方案在所述不同核酸彼此不接觸并且可以分開加工時是特別有用的。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第二靶核酸不存在于第一流體樣品中。然而，不同核酸也可以存在于相同樣品內，但是不必必須將它們都在分離后進一步加工。本發(fā)明在這些情況中也是有用的。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第二核酸也存在于第一流體樣品中。在下游加工的情況中(特別在使用診斷技術諸如核酸擴增方法時)，經(jīng)常期望或甚至需要包括一種或多種對照核酸。這樣，可以在將對照添加至純化的核酸時控制分析反應，或者也可以在核酸提取前或期間添加對照時監(jiān)測樣品制備。包括兩類對照也是常見且優(yōu)選的。在此方面，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中在任何步驟對流體樣品和/或純化的核酸添加對照核酸。對于將核酸結合至固體支持材料，以及裂解細胞和病毒(若可應用的話)，證明了于高至50℃的溫度溫育是有利的。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中步驟a.于高至50℃的溫度，優(yōu)選地，35℃-45℃的溫度，更優(yōu)選地，于40℃的溫度實施。對于分離的核酸的下游加工，例如將它們進行擴增前將它們與固體支持材料分開可以是有利的。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述方法在步驟c.后進一步包括下列步驟：d.用洗脫緩沖液將核酸自固體支持材料洗脫。在本發(fā)明的上下文中“洗脫緩沖液”是適合于將核酸與固體支持物分開的液體。這類液體可以是例如蒸餾水或水性鹽溶液，諸如例如tris緩沖液如trishcl、或hepes、或熟練技術人員已知的其它合適的緩沖液。優(yōu)選地，這類洗脫緩沖液的ph值是堿性或中性的。所述洗脫緩沖液可以進一步含有組分諸如例如螯合劑如edta，其通過使降解酶失活來穩(wěn)定化分離的核酸。優(yōu)選地，于升高的溫度實施洗脫，使得本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案是上文所描述的方法，其中于70℃-90℃的溫度，更優(yōu)選地，于80℃的溫度實施步驟d.。如上文提及的，經(jīng)常期望分析通過上文所描述的方法分離的核酸。為此，增加用于分析的起始材料的量可以是有利的。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述方法在步驟c.后或步驟d.后進一步包括下列步驟：e.將純化的核酸和任選地所述固體支持材料轉移到多個反應容器，f.擴增靶核酸。在此背景中，特別有利的是，采用允許在相同物理條件下并使用相同試劑在兩個或更多個反應容器中同時擴增和檢測多種不同核酸的擴增和檢測方法。這類技術與上文公開的快速且有效的樣品制備的組合對于提供例如整合自動化解決辦法(其中對含有不同核酸的多種不同類型的樣品實施相同工作流)可以是非常有利的?？梢云叫屑庸み@些樣品以同時分離它們含有的不同核酸，然后，也可以以同時方式實施對所述分離的不同核酸的分析。這類辦法的組合顯著降低這類實驗的復雜性和獲得結果的時間，這具有相當大的優(yōu)點，尤其對于臨床背景中的診斷實驗室而言。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中步驟f.包括下列步驟：i.在至少兩個反應容器中使純化的核酸與包含具有逆轉錄酶活性的聚合酶的一種或多種擴增試劑接觸，其中至少第一反應容器至少包含所述第一靶核酸，而至少第二反應容器至少包含所述第二靶核酸，且其中所述第二靶核酸不存在于所述第一反應容器中；ii.在所述反應容器中將所述純化的核酸與所述一種或多種擴增試劑在一定的條件下一起溫育一段時間，該條件和時間段適合于通過所述具有逆轉錄酶活性的聚合酶發(fā)生rna轉錄；iii.在所述反應容器中將所述純化的核酸和所述一種或多種擴增試劑在一定的條件下一起溫育一段時間，該條件和時間段足以發(fā)生指示所述第一和第二靶核酸的存在或缺乏的擴增反應，其中在步驟i.至iii.中用于轉錄和擴增的條件至少對于第一和第二靶核酸是相同的。對于擴增規(guī)程，在現(xiàn)有技術中的一項挑戰(zhàn)是，在單個反應容器中實施的多重測定法中的不同靶核酸數(shù)目受限于合適標記物的數(shù)目。例如在實時pcr測定法中，熒光染料光譜的潛在重疊對于測定法性能(假陽性結果的風險、較低的精確性，等等)具有很大的影響。因此，相應的熒光團必須經(jīng)過仔細選擇，并且在光譜上良好地分開，從而確保診斷測試的期望性能。典型地，不同可用熒光團的數(shù)目對應于pcr儀熒光通道的單數(shù)位數(shù)目。相比之下，在上文所描述的方法中，在至少兩個不同的反應容器中發(fā)生至少第一和第二靶核酸的擴增，從而允許較高數(shù)目的不同靶核酸的同時擴增，因為不同反應容器中的信號可以彼此獨立地檢出。如下的實施方案仍然在本發(fā)明的范圍內，其中在多個反應容器的一個或多個中實施多重反應，從而成倍增加可以同時且在相同條件下擴增的靶物數(shù)目。在本發(fā)明的上下文中，“擴增試劑”是使核酸能夠擴增的化學或生物化學成分。這類試劑包含但不限于核酸聚合酶、緩沖液、單核苷酸諸如三磷酸核苷、寡核苷酸例如如寡核苷酸引物、鹽及其相應的溶液、檢測探針、染料，等等。如本領域中已知的，“核苷”是堿基-糖組合。核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿基。兩類最常見的這類雜環(huán)堿基是嘌呤和嘧啶?！昂塑账帷笔沁M一步包含與核苷的糖部分共價連接的磷酸根基團的核苷。對于那些包含呋喃戊糖基糖的核苷，磷酸根基團可以與糖的2’-、3’-或5’-羥基模塊連接。核苷酸是“寡核苷酸”(其可以更一般地稱為“寡聚化合物”)，或“多核苷酸”(更一般稱為“多聚化合物”)的單體單元。前述物質的另一種一般表述是脫氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。依照本發(fā)明，“寡聚化合物”是由“單體單元”組成的化合物，所述“單體單元”可以是單獨的核苷酸或單獨的非天然化合物(見下文)，更特別地是經(jīng)修飾的核苷酸(或核苷酸類似物)或非核苷酸化合物，或其組合?！肮押塑账帷焙汀敖?jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)是寡聚化合物的亞組。在本發(fā)明的背景中，術語“寡核苷酸”指自多個作為其單體單元的核苷酸形成的組分。磷酸根基團通常稱為形成寡核苷酸的核苷間主鏈。rna和dna的正常連接或主鏈是3’至5’磷酸二酯連接。可以合成對本發(fā)明有用的寡核苷酸和經(jīng)修飾的寡核苷酸(見下文)，如主要在本領域中描述的且本領域中熟練人員已知的。用于制備特定序列的寡聚化合物的方法是本領域中已知的，并且包括例如合適序列的克隆和限制以及直接化學合成?；瘜W合成方法可以包括例如由narangs.a.等,methodsinenzymology68(1979)90-98描述的磷酸三酯方法、由browne.l.等,methodsinenzymology68(1979)109-151披露的磷酸二酯方法、在beaucage等,tetrahedronletters22(1981)1859中披露的亞磷酰胺方法、在garegg等,chem.scr.25(1985)280-282中披露的h-膦酸鹽方法以及在us4,458,066中披露的固體支持物方法。在依照本發(fā)明的方法中，寡核苷酸可以經(jīng)過化學修飾，即引物和/或探針包含經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸化合物。因而，探針或引物是經(jīng)修飾的寡核苷酸?！敖?jīng)修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)與天然核苷酸相差一些修飾，但是仍然由堿基、呋喃戊糖基糖、磷酸根部分、堿基樣、呋喃戊糖基糖樣和磷酸根樣部分或其組合組成。例如，可以將標記物附著于核苷酸的堿基部分，由此獲得經(jīng)修飾的核苷酸。核苷酸中的天然堿基也可以用例如7-脫氮嘌呤替換，由此也獲得經(jīng)修飾的核苷酸?！敖?jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)，屬于另一特定亞組的寡聚化合物，擁有一種或多種核苷酸和一種或多種經(jīng)修飾的核苷酸作為單體單元。因此，術語“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)指以與寡核苷酸基本上相似的方式發(fā)揮功能的結構，并且在本發(fā)明的背景中可以互換使用。從合成觀點來看，可以例如通過對磷酸根主鏈、核糖單元或核苷酸堿基的適當修飾通過化學修飾寡核苷酸來生成經(jīng)修飾的寡核苷酸(或寡核苷酸類似物)(uhlmann和peyman,chemicalreviews90(1990)543；vermas.和ecksteinf.,annu.rev.biochem.67(1998)99-134)。代表性修飾包括用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯核苷間連接替換磷酸二酯核苷間連接；用脫氮或氮雜嘌呤和嘧啶替換天然的嘌呤和嘧啶堿基，在第5位或第6位具有取代基基團的嘧啶堿基；在第2位、第6位或第8位或第7位(如7-脫氮嘌呤)具有改變的取代基基團的嘌呤堿基；攜帶烴基、烯基、炔基或芳基模塊，例如低級烴基基團諸如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，或芳基基團如苯基、芐基、萘基的堿基；在例如其2’位置具有取代基基團的糖；或碳環(huán)或無環(huán)糖類似物。與本發(fā)明的精神一致的其它修飾是本領域的技術人員已知的。這類經(jīng)修飾的寡核苷酸(或寡核苷酸類似物)最好描述為與天然寡核苷酸在功能上可互換，但在結構上不同。更為詳細的，例示性修飾披露于vermas.和ecksteinf.,annu.rev.biochem.67(1998)99-134或wo02/12263中。另外，可以做出如下的修飾，其中核苷單元經(jīng)由取代核苷間磷酸酯或糖磷酸酯連接的基團連接。這類連接包括那些披露于vermas.和ecksteinf.,annu.rev.biochem.67(1998)99-134中的。當利用磷酸酯以外的連接來連接核苷單元時，這類結構也描述為“寡核苷”。“核酸”以及“靶核酸”是如本領域熟練技術人員已知的核苷酸的多聚化合物?！鞍泻怂帷痹诒疚闹杏糜谥笜悠分袘摲治?，即應該測定樣品中其存在、不存在和/或量的核酸。術語“引物”在本文中如本領域熟練技術人員已知的那樣使用，指能夠通過模板依賴性dna聚合酶引發(fā)dna合成的寡聚化合物，主要指寡核苷酸，但也指經(jīng)修飾的寡核苷酸，即例如引物的3’端提供游離的3’-oh基團，可以通過建立3’至5’磷酸二酯連接的模板依賴性dna聚合酶對所述游離的3’-oh基團附著其它核苷酸，其中使用三磷酸脫氧核苷且其中釋放焦磷酸。“探針”也指天然的或經(jīng)修飾的寡核苷酸。如本領域中已知的，探針滿足檢測分析物或擴增物的目的。在依照本發(fā)明的方法的情況中，可以使用探針來檢測靶核酸的擴增物。出于此目的，探針通常攜帶標記物?！皹擞浳铩?，經(jīng)常稱為“報告基團”，一般是使與其結合的核酸，特別是寡核苷酸或經(jīng)修飾的寡核苷酸，以及任何核酸與樣品的剩余部分可區(qū)別的基團(具有附著的標記物的核酸也可以稱作經(jīng)標記的核酸結合化合物、經(jīng)標記的探針或僅探針)。依照本發(fā)明的優(yōu)選的標記物是熒光標記物，其是例如熒光染料諸如熒光素染料、羅丹明染料、花菁染料和香豆素染料。依照本發(fā)明的優(yōu)選的熒光染料是fam、hex、ja270、cal635、香豆素343、quasar705、cyan500、cy5.5、lc-紅640、lc-紅705。在本發(fā)明的上下文中，任何引物和/或探針都可以是經(jīng)過化學修飾的，即引物和/或探針包含經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸化合物。因而，探針或引物是經(jīng)修飾的寡核苷酸。核酸擴增的優(yōu)選方法是聚合酶鏈式反應(pcr)，其披露于美國專利no.4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188，等等。pcr通常采用兩種或更多種結合選擇的核酸模板(例如dna或rna)的寡核苷酸引物。對核酸分析有用的引物包括能夠在靶核酸的核酸序列內充當核酸合成的起始點的寡核苷酸。可以通過常規(guī)方法從限制性消化物純化引物，或者其可以合成生成。優(yōu)選地，引物是單鏈以在擴增中實現(xiàn)最大效率，但是引物可以是雙鏈。首先，將雙鏈引物變性，即處理以將鏈分開。將雙鏈核酸變性的一種方法通過加熱進行?！盁岱€(wěn)定性聚合酶”是熱穩(wěn)定的酶聚合酶，即其是催化形成與模板互補的引物延伸產(chǎn)物，并且在受到升高的溫度處理達實現(xiàn)雙鏈模板核酸變性必需的時間時沒有不可逆地變性的酶。一般地，合成在每條引物的3’端起始，并且沿著模板鏈以5’到3’方向進行。熱穩(wěn)定性聚合酶已經(jīng)例如自黃色棲熱菌(thermusflavus)、紅色棲熱菌(t.rubber)、嗜熱棲熱菌(t.thermophilus)、水生棲熱菌(t.aquaticus)、乳棲熱菌(t.lacteus)、紅色棲熱菌(t.rubens)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(bacillusstearothermophilus)和熾熱甲烷嗜熱菌(methanothermusfervidus)分離。不過，非熱穩(wěn)定性聚合酶也可以在pcr測定法中采用，只要該酶得到補充。如果模板核酸是雙鏈的，那么有必要在可以使用其作為pcr中的模板前將兩條鏈分開。可以通過任何合適的變性方法，包括物理、化學或酶手段來實現(xiàn)鏈分開。一種分開核酸鏈的方法牽涉加熱核酸，直至其變性占優(yōu)勢(例如，大于50％、60％、70％、80％、90％或95％變性)。使模板核酸變性必需的加熱條件會取決于例如緩沖鹽濃度和變性的核酸的長度和核苷酸組成，但是范圍通常為約90℃至約105℃達某個時間，該時間取決于反應特征諸如溫度和核酸長度。變性通常實施約5秒至9分鐘。為了不使相應的聚合酶如例如z05dna聚合酶暴露于這類高溫太長及如此有損失功能性酶的風險，優(yōu)選使用較短的變性步驟。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，變性步驟長至30秒，進一步優(yōu)選地，長至20秒，進一步優(yōu)選地，長至10秒，進一步優(yōu)選地，長至5秒，最優(yōu)選地，約5秒。如果通過加熱來使雙鏈模板核酸變性，那么允許反應混合物冷卻至如下的溫度，該溫度促進每條引物在靶核酸上與其靶序列退火。優(yōu)選地，用于退火的溫度是約35℃至約70℃，進一步優(yōu)選地，約45℃至約65℃；進一步優(yōu)選地，約50℃至約60℃，進一步優(yōu)選地，約55℃至約58℃。退火時間可以是約10秒至約1分鐘(例如約20秒至約50秒；約30秒至約40秒)。在此背景中，可以有利的是使用不同的退火溫度來增加相應測定法的包容性(inclusivity)。簡言之，這意味著于相對較低的退火溫度，引物也可以結合具有單一錯配的靶物，因此也可以擴增特定序列的變體。如果例如某種生物體具有已知或未知的也應該檢出的遺傳變體，那么這可以是期望的。在另一方面，相對較高的退火溫度具有提供較高特異性的優(yōu)點，因為朝向更高的溫度，引物結合不完全匹配的靶序列的可能性不斷降低。為了受益于這兩種現(xiàn)象，在本發(fā)明的一些實施方案中，優(yōu)選的是，上文所描述的方法包括于不同溫度，優(yōu)選地，首先于較低溫度，然后于較高溫度退火。如果例如第一溫育于55℃發(fā)生約5個循環(huán)，那么可以(預)擴增不完全匹配的靶序列。這接著可以是例如于58℃約45個循環(huán)，從而提供貫穿實驗的主要部分的較高特異性。這樣，在特異性保持相對較高的情況中不遺漏潛在重要的遺傳變體。然后，將反應混合物調節(jié)至促進或優(yōu)化聚合酶活性的溫度，即足以自退火引物發(fā)生延伸以生成與要分析的核酸互補的產(chǎn)物的溫度。溫度應該足以從與核酸模板退火的每條引物合成延伸產(chǎn)物，但是不應高得以致于延伸產(chǎn)物從其互補模板變性(例如，一般地，用于延伸的溫度范圍為約40℃至約80℃；例如約50℃至約70℃；約60℃)。延伸時間可以是約10秒至約5分鐘，優(yōu)選地，約15秒至2分鐘，進一步優(yōu)選地，約20秒至約1分鐘，進一步優(yōu)選地，約25秒至約35秒。新合成的鏈形成雙鏈分子，其可以在反應的隨后步驟中使用?？梢愿鶕?jù)需要經(jīng)常重復鏈分開、退火、和延伸步驟以產(chǎn)生期望量的與靶核酸對應的擴增產(chǎn)物。反應中的限制因素是反應中存在的引物、熱穩(wěn)定性酶、和三磷酸核苷的量。優(yōu)選地，將循環(huán)步驟(即變性、退火、和延伸)至少重復一次。為了在檢測中使用，循環(huán)步驟數(shù)目會取決于例如樣品的性質。如果樣品是核酸的復雜混合物，那么將需要更多的循環(huán)步驟來擴增足以檢出的靶序列。一般地，將循環(huán)步驟至少重復約20次，但是可以重復多達40、60或甚至100次。在本發(fā)明的范圍內，可以實施如下的pcr，其中退火和延伸步驟在同一步驟中(一步pcr)或者如上文所描述的，在分開的步驟中(兩步pcr)實施。將退火和延伸一起及如此在相同物理和化學條件下，用合適的酶諸如例如z05dna聚合酶實施具有的優(yōu)點在于節(jié)省每個循環(huán)中用于額外步驟的時間，并且還消除對退火和延伸之間額外的溫度調節(jié)的需要。因此，一步pcr降低相應測定法的總體復雜性。一般地，總體擴增的時間較短是優(yōu)選的(因為縮短獲得結果時間)，而且導致可能更早的診斷。在本發(fā)明的上下文中要使用的其它優(yōu)選的核酸擴增方法包括連接酶鏈式反應(lcr；wud.y.和wallacer.b.,genomics4(1989)560-69；及baranyf.,proc.natl.acad.sci.usa88(1991)189-193)；聚合酶連接酶鏈式反應(baranyf.,pcrmethodsandapplic.1(1991)5-16)；缺口-lcr(wo90/01069)；修復鏈式反應(repairchainreaction)(ep0439182a2)、3sr(kwohd.y.等,proc.natl.acad.sci.usa86(1989)1173-1177；guatellij.c.等,proc.natl.acad.sci.usa87(1990)1874-1878；wo92/08808)、以及nasba(us5,130,238)。此外，有鏈置換擴增(sda)、轉錄介導的擴增(tma)和qb擴增(關于綜述，參見例如whelena.c.和persingd.h.,annu.rev.microbiol.50(1996)349-373；abramsonr.d.和myerst.w.,curropinbiotechnol4(1993)41-47)?！熬哂心孓D錄酶活性的聚合酶”是能夠基于rna模板合成dna的核酸聚合酶。它也能夠在rna已經(jīng)逆轉錄成單鏈cdna后形成雙鏈dna。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，具有逆轉錄酶活性的聚合酶是熱穩(wěn)定的。在一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的方法包括將含有rna模板的樣品與寡核苷酸引物和優(yōu)選地熱穩(wěn)定性dna聚合酶在存在至少所有4種天然的或經(jīng)修飾的三磷酸脫氧核糖核苷的情況中在合適的緩沖液中一起溫育，所述寡核苷酸引物與所述rna模板充分互補以與后者雜交，所述合適的緩沖液包含金屬離子緩沖液，在一個優(yōu)選的實施方案中，其緩沖ph和金屬離子濃度兩者。于某個溫度實施此溫育，所述溫度足以使所述引物與所述rna模板雜交，并且所述dna聚合酶催化所述三磷酸脫氧核糖核苷的聚合，以形成與所述rna模板序列互補的cdna序列。如在本文中使用的，術語“cdna”指使用核糖核酸鏈(rna)作為模板合成的互補dna分子。rna可以是例如mrna、trna、rrna、或另一種形式的rna，諸如病毒rna。cdna可以是單鏈的、雙鏈的或者可以與互補rna分子氫鍵鍵合，如在rna/cdna雜合物中的。適合于與rna模板退火的引物也可以適合于通過pcr擴增。對于pcr，與逆轉錄cdna鏈互補的第二條引物為延伸產(chǎn)物的合成提供起始位點。在通過dna聚合酶來擴增rna分子中，第一延伸反應是使用rna模板的逆轉錄，并且生成dna鏈。使用dna模板的第二延伸反應生成雙鏈dna分子。因此，通過dna聚合酶從rna模板合成互補dna鏈為擴增提供起始材料。熱穩(wěn)定性dna聚合酶可以在偶聯(lián)的單酶逆轉錄/擴增反應中使用。術語“同質的”在此背景中指用于rna靶物的逆轉錄和擴增的兩步驟單一添加反應。同質的意指在逆轉錄(rt)步驟后，不需要在擴增步驟前打開反應容器或以其它方式調節(jié)反應組分。在非同質性rt/pcr反應中，在逆轉錄后且在擴增前，例如調節(jié)、添加、或稀釋一種或多種反應組分諸如擴增試劑，為此不得不打開反應容器，或者至少不得不操作其內容物。雖然本發(fā)明的范圍包括同質性和非同質性實施方案兩者，但是優(yōu)選rt/pcr的同質形式。逆轉錄是rt/pcr中的一個重要的步驟。例如，本領域中已知的是，rna模板顯示形成二級結構的趨勢，所述二級結構可以阻礙引物結合和/或相應逆轉錄酶對cdna鏈的延伸。因此，rt反應的相對較高的溫度就轉錄效率而言是有利的。在另一方面，提高溫育溫度也意味著更高的特異性，即rt引物不會與同預期的一種或多種序列顯示錯配的序列退火。尤其在多種不同靶rna的情況中，可能期望也轉錄，并且隨后擴增并檢測具有單一錯配的序列，例如在流體樣品中可能存在生物體的未知的或不常見的亞株或亞種的情況中。為了受益于上文所描述的兩種優(yōu)點，即減少二級結構和具有錯配的模板的逆轉錄，本發(fā)明的一個方面是于超過一種不同溫度實施rt溫育。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中在步驟ii.中，于30℃至75℃，優(yōu)選地45℃至70℃，進一步優(yōu)選地55℃至65℃的不同溫度實施具有逆轉錄酶活性的聚合酶的溫育。作為逆轉錄的又一個重要方面，較長的rt步驟可以損傷可存在于流體樣品中的dna模板。如果流體樣品含有rna和dna種類兩者，如此，有利的是將rt步驟的持續(xù)時間保持得盡可能短，但是同時確保合成的cdna量足以用于隨后的擴增和任選的擴增物檢測。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中在步驟ii.中，時間段是長至30分鐘、20分鐘、15分鐘、12.5分鐘、10分鐘、5分鐘、或1分鐘。本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中具有逆轉錄酶活性且包含突變的聚合酶選自下組：a.cs5dna聚合酶b.cs6dna聚合酶c.海棲熱袍菌(thermotogamaritime)dna聚合酶d.水生棲熱菌dna聚合酶e.嗜熱棲熱菌dna聚合酶f.黃色棲熱菌dna聚合酶g.絲狀棲熱菌(thermusfiliformis)dna聚合酶h.棲熱菌屬物種sps17dna聚合酶i.棲熱菌屬物種z05dna聚合酶j.那不勒斯棲熱袍菌(thermotoganeapolitana)dna聚合酶k.非洲棲熱腔菌(termosiphoafricanus)dna聚合酶l.thermuscaldophilusdna聚合酶。特別適合于這些要求的是在聚合酶域中攜帶突變的酶，所述突變就較快的延伸速率而言增強其逆轉錄效率。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中具有逆轉錄酶活性的聚合酶是相對于相應的野生型聚合酶包含突變的聚合酶，所述突變賦予改善的核酸延伸速率和/或改善的逆轉錄酶活性。在一個更優(yōu)選的實施方案中，在上文所描述的方法中，具有逆轉錄酶活性的聚合酶是相對于相應的野生型聚合酶包含突變的聚合酶，所述突變賦予改善的逆轉錄酶活性。攜帶使其特別可用于本發(fā)明背景的點突變的聚合酶披露于wo2008/046612中。具體地，要在本發(fā)明背景中使用的優(yōu)選的聚合酶是在聚合酶域中至少包含下述基序的突變的dna聚合酶：t-g-r-l-s-s-xb7-xb8-p-n-l-q-n；其中xb7是選自s或t的氨基酸，且其中xb8是選自g、t、r、k或l的氨基酸，其中該聚合酶包含3’-5’外切核酸酶活性，并且相對于野生型dna聚合酶具有改善的核酸延伸速率和/或改善的逆轉錄效率，其中在所述野生型dna聚合酶中，xb8是選自d、e或n的氨基酸。一個特別優(yōu)選的例子是來自棲熱菌屬物種z05的熱穩(wěn)定性dna聚合酶突變體(記載于例如us5,455,170)，如與相應的野生型酶z05相比，所述變異在聚合酶域中包含突變。對依照本發(fā)明的方法特別優(yōu)選的是突變體z05dna聚合酶，其中第580位氨基酸選自下組：g、t、r、k和l。對于使用熱穩(wěn)定性聚合酶的逆轉錄，mn2+作為二價陽離子是優(yōu)選的，并且通常以鹽形式，例如氯化錳(mncl2)、乙酸錳(mn(oac)2)、或硫酸錳(mnso4)包括在內。如果例如在含有50mmtricine緩沖液的反應中包含mncl2，那么mncl2一般以0.5-7.0mm的濃度存在；當利用各200mmdgtp、datp、dutp、和dctp時優(yōu)選0.8-1.4mm；且2.5-3.5mmmncl2是最優(yōu)選的。此外，使用mg2+作為二價陽離子用于逆轉錄在本發(fā)明的背景中也是優(yōu)選的。由于在保留dna靶核酸的情況中將rna靶核酸逆轉錄成cdna在本發(fā)明的范圍內，因此可以使用cdna和dna兩者進行隨后的擴增，依照本發(fā)明的方法特別可用于同時擴增自具有rna基因組的生物體或具有dna基因組的生物體兩者衍生的靶核酸。此優(yōu)點相當大地增加可以在相同物理條件下分析的一批不同生物體，特別是病原體。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中至少兩種靶核酸包含rna和dna。特別由于適當?shù)淖钸m溫度，酶如tth聚合酶或優(yōu)選地上文提及的突變體z05dna聚合酶適合于實施隨后擴增靶核酸的步驟。對逆轉錄和擴增兩者采用同一種酶促成易于實施該方法，并且促進了自動化，因為不必在rt和擴增步驟之間操作流體樣品。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，在上文所描述的方法中，在步驟ii.和步驟iii中使用相同的具有逆轉錄酶活性的聚合酶。優(yōu)選地，所述酶是上文描述的突變體z05dna聚合酶。為了不使本發(fā)明上下文中使用的反應混合物的聚合酶或其它組分暴露于升高的溫度達長于必要的時間，在一個優(yōu)選的實施方案中，高于90℃的步驟長多至20秒，優(yōu)選地多至15秒，更優(yōu)選地多至10秒，更優(yōu)選地多至5秒，且最優(yōu)選地5秒。這也縮短獲得結果時間，并且縮短測定法的總體需要時間。在這類同質性設置中，可以具有相當大的優(yōu)點的是在啟動rt和擴增前將反應容器密封，由此降低污染的風險?？梢岳缛缦聦崿F(xiàn)密封，即應用優(yōu)選為透明的箔、蓋，或者通過對反應容器添加油，并在流體頂部形成親脂相作為密封層。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文描述的方法，其在步驟i.和步驟ii.之間進一步包括將至少兩個反應容器密封的步驟。擴增步驟的靶物可以是rna/dna雜合分子。靶物可以是單鏈或雙鏈核酸。雖然最廣泛使用的pcr規(guī)程使用雙鏈靶物，但是這并不是必須的。在單鏈dna靶物的第一輪擴增循環(huán)后，反應混合物含有雙鏈dna分子，其由單鏈靶物和新合成的互補鏈構成。類似地，在rna/cdna靶物的第一輪擴增循環(huán)后，反應混合物含有雙鏈cdna分子。在這點時，進行連續(xù)擴增循環(huán)，如上文所描述的。由于核酸擴增(特別但不僅僅是在pcr的情況中)在作為循環(huán)反應實施時是非常有效的，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中步驟iii.中的擴增反應由多個循環(huán)步驟組成。合適的核酸檢測方法是本領域技術人員已知的，并且記載于標準教科書如sambrookj.等,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989及ausubelf.等:currentprotocolsinmolecularbiology1987,j.wileyandsons,ny。在實施核酸檢測步驟前也可以有進一步的純化步驟，如例如沉淀步驟。檢測方法可以包括但不限于結合或插入特定的染料如溴化乙啶，其插入雙鏈dna中，此后改變其熒光。也可以任選地在限制性消化后通過電泳方法分離純化的核酸，此后將其顯現(xiàn)。還有基于探針的測定法，其采用寡核苷酸與特定序列的雜交和隨后對雜交物的檢測。優(yōu)選的是在擴增反應期間或之后檢測擴增的靶核酸以評估分析結果。特別對于實時檢測，使用核酸探針是有利的。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中循環(huán)步驟包括擴增步驟和雜交步驟，所述雜交步驟包括使擴增的核酸與探針雜交?？梢杂欣氖菍崟r監(jiān)測擴增反應，即在擴增自身期間檢測靶核酸和/或其擴增物。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中用供體熒光模塊和相應的接受熒光模塊標記探針。優(yōu)選地，上文所列的方法基于供體熒光模塊和接受熒光模塊之間的熒光共振能量轉移(fret)。代表性的供體熒光模塊是熒光素，而代表性的相應接受熒光模塊包括lc-紅640、lc-紅705、cy5、和cy5.5。通常，檢測包括以供體熒光模塊吸收的波長激發(fā)樣品，并且顯現(xiàn)和/或測量由相應的接受熒光模塊發(fā)射的波長。在依照本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，檢測繼之以量化fret。優(yōu)選地，在每個循環(huán)步驟后實施檢測。最優(yōu)選地，實時實施檢測。通過使用商品化實時pcr儀(例如lightcyclertm或)，pcr擴增和擴增產(chǎn)物的檢測可以以顯著縮短的循環(huán)時間在單個封閉的小杯中組合。由于檢測與擴增同時發(fā)生，因此實時pcr方法消除對操作擴增產(chǎn)物的需要，并且降低擴增產(chǎn)物間交叉污染的風險。實時pcr大大地縮短周轉時間，并且是臨床實驗室中常規(guī)pcr技術的一種有吸引力的備選。下列專利申請描述了如在lightcyclertm技術中使用的實時pcr：wo97/46707、wo97/46714和wo97/46712。lightcyclertm儀是一種與利用高質量光學鏡的微體積熒光計組合的快速熱循環(huán)儀。此快速熱循環(huán)技術使用薄玻璃小杯作為反應容器。反應室的加熱和冷卻通過交替加熱的和周圍的空氣來控制。由于空氣的質量低以及小杯的表面積與體積的比率高，可以在熱室內實現(xiàn)非常快速的溫度交換速率。技術利用用兩種熒光模塊標記的單鏈雜交探針。當?shù)谝粺晒饽K用合適波長的光激發(fā)時，吸收的能量依照fret的原理轉移到第二熒光模塊。一般地，第二熒光模塊是猝滅劑分子。以此形式使用的典型熒光染料是例如fam、hex、cy5、ja270、cyan和cy5.5，等等。在pcr反應的退火步驟期間中，經(jīng)標記的雜交探針結合靶核酸(即擴增產(chǎn)物)，并且在隨后的延伸階段期間，受到taq或如熟練技術人員已知的另一種合適的聚合酶，諸如優(yōu)選的突變體z05聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。結果，激發(fā)的熒光模塊和猝滅劑模塊變成彼此空間分開。因此，在沒有猝滅劑的情況中激發(fā)第一熒光模塊后，可以檢出來自第一熒光模塊的熒光發(fā)射。在上文描述的兩種檢測形式中，發(fā)射信號的強度可以與初始靶核酸分子數(shù)目相關聯(lián)。作為fret的一種備選，可以使用雙鏈dna結合染料諸如熒光dna結合染料(例如sybrgreen或(molecularprobes))來檢測擴增產(chǎn)物。在與雙鏈核酸相互作用后，這類熒光dna結合染料在用合適波長的光激發(fā)后發(fā)射出熒光信號。也可以使用雙鏈dna結合染料諸如核酸嵌入染料。當使用雙鏈dna結合染料時，通常實施解鏈曲線分析以確認擴增產(chǎn)物的存在。使用本發(fā)明的實時pcr方法，也可以使用與fret結合的分子信標來檢測擴增產(chǎn)物的存在。分子信標技術使用用第一熒光模塊和第二熒光模塊標記的雜交探針。第二熒光部分一般是猝滅劑，并且熒光標記物通常位于探針的每個末端。分子信標技術使用具有允許二級結構形成(例如發(fā)夾)的序列的探針寡核苷酸。由于探針內二級結構形成，兩種熒光模塊在探針在溶液中時為空間接近。在與擴增產(chǎn)物雜交后，探針的二級結構受到破壞，并且熒光模塊變得彼此分開，使得在用合適波長的光激發(fā)后，可以檢出第一熒光模塊的發(fā)射。因此，利用fret的上文描述的方法在依照本發(fā)明的優(yōu)選方法中，其中所述探針包含允許二級結構形成的核酸序列，其中所述二級結構形成導致所述第一和第二熒光模塊之間的空間接近。僅可以在熒光模塊直接局部接近時，且在供體熒光模塊的發(fā)射光譜與接受熒光模塊的吸收光譜重疊時發(fā)生有效的fret。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述供體和接受熒光模塊在所述探針上在彼此的不超過5個核苷酸內。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，所述接受熒光模塊是猝滅劑。如上文描述的，在taqman形式中，在pcr反應的退火步驟期間中，經(jīng)標記的雜交探針結合靶核酸(即擴增產(chǎn)物)，并且在隨后的延伸階段期間，受到taq或如熟練技術人員已知的另一種合適的聚合酶，諸如優(yōu)選的突變體z05聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，在依照本發(fā)明的方法中，擴增采用具有5’至3’外切核酸酶活性的酶聚合酶。進一步有利的是注意選擇由上文所描述的方法產(chǎn)生的擴增子的長度。一般地，相對較短的擴增子提高擴增反應的效率。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文描述的方法，其中擴增片段包含多至450個堿基，優(yōu)選地多至300個堿基，進一步優(yōu)選地多至200個堿基，且進一步優(yōu)選地多至150個堿基。依照本發(fā)明，使用對照核酸可以進一步具有優(yōu)點。本領域已知的是定性和定量對照兩者特別在診斷環(huán)境中具有相當大的意義。在此背景中，充當“定量標準核酸”的對照核酸傾向是參照，并且作為參照使用以量化靶核酸，即測定靶核酸的量。出于此目的，一種或多種定量標準核酸與靶核酸一起經(jīng)歷所有可能的樣品制備步驟。此外，貫穿整個方法在相同反應混合物內加工定量標準核酸。它必須在存在或沒有靶核酸的這兩種情況中都直接或間接地生成可檢測的信號。出于此目的，在每種測試中必須仔細優(yōu)化定量標準核酸的濃度，以便不干擾靈敏度，而且例如在非常高的靶物濃度也生成可檢測的信號。就相應測定法的檢測限(lod，見下文)而言，優(yōu)選地，“定量標準核酸”的濃度范圍是20-5000倍lod，更優(yōu)選地20-1000倍lod，最優(yōu)選地20-5000倍lod。反應混合物中定量標準核酸的終濃度取決于實現(xiàn)的定量測量范圍。定量標準核酸可以是例如dna、rna或pna、裝甲(armored)dna或rna及其經(jīng)修飾形式?！皺z測限”或“l(fā)od”意指樣品中可檢測的最低核酸量或濃度。低“l(fā)od”對應于高靈敏度，反之亦然?！發(fā)od”通常依靠單位“cp/ml”(特別是在核酸是病毒核酸時)，或者以iu/ml表示?！癱p/ml”意指“每毫升的拷貝”，其中“拷貝”是相應核酸的拷貝。iu/ml代表“國際單位/ml”，指who標準。一種用于計算lod的廣泛使用的方法是“probit(概率單位)分析”，其是一種分析刺激物(劑量)和可數(shù)性(quantal)(全有或全無)響應之間關系的方法。在典型的可數(shù)性響應實驗中，對動物組給予不同劑量的藥物。記錄每個劑量水平的百分比瀕死。然后，可以使用probit分析來分析這些數(shù)據(jù)。probit模型假定百分比響應與對數(shù)劑量的關系呈累積正態(tài)分布。也就是說，可以使用對數(shù)劑量作為變量來從累積法線(cumulativenormal)中讀出百分比瀕死。使用正態(tài)分布而不是其它概率分布，影響在可能的劑量的高和低末端處的預測響應率，但是接近中間具有很少的影響。probit分析可以以獨特的“命中率”應用。如本領域中已知的，“命中率”通常以百分比[％]表示，并且指示在特定濃度的分析物時陽性結果的百分比。因此例如，lod可以以95％命中率測定，這意味著對95％有效結果呈陽性的背景計算lod。在一個優(yōu)選的實施方案中，上文所描述的方法提供1-100cp/ml或0.5-50iu/ml，更優(yōu)選地1-75cp/ml或0.5-30iu/ml，更優(yōu)選地1-25cp/ml或1-20iu/ml的lod。就來自某些病毒的可能的靶核酸的一些例子而言，優(yōu)選地，依照本發(fā)明的方法提供下列l(wèi)od：·hiv：多至60cp/ml，更優(yōu)選地多至50cp/ml，更優(yōu)選地多至40cp/ml，更優(yōu)選地多至30cp/ml，更優(yōu)選地多至20cp/ml，更優(yōu)選地多至15cp/ml·hbv：多至10iu/ml，更優(yōu)選地多至7.5iu/ml，更優(yōu)選地多至5iu/ml·hcv：多至10iu/ml，更優(yōu)選地多至7.5iu/ml，更優(yōu)選地多至5iu/ml·wnvi：多至20cp/ml，更優(yōu)選地多至15cp/ml，更優(yōu)選地多至10cp/ml·wnvii：多至20cp/ml，更優(yōu)選地多至15cp/ml，更優(yōu)選地多至10cp/ml，更優(yōu)選地多至5cp/ml·jev：多至100cp/ml，更優(yōu)選地多至75cp/ml，更優(yōu)選地多至50cp/ml，更優(yōu)選地多至30cp/ml·slev：多至100cp/ml，更優(yōu)選地多至75cp/ml，更優(yōu)選地多至50cp/ml，更優(yōu)選地多至25cp/ml，更優(yōu)選地多至10cp/ml。在下文中描述了如何基于定量標準核酸在taqman形式中實施定量結果計算的例子：從來自整個pcr運行的、經(jīng)儀器校正的熒光值的輸入數(shù)據(jù)計算滴度。含有靶核酸和充當定量標準核酸的對照核酸的一組樣品在使用規(guī)定溫度概況的熱循環(huán)儀上經(jīng)歷pcr。在pcr概況期間的選定溫度和時間，通過過濾光照明樣品，并且對每份樣品針對靶核酸和定量標準核酸收集過濾熒光數(shù)據(jù)。在完成pcr運行后，處理熒光讀數(shù)以產(chǎn)生定量標準核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)和靶核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)。以相同方式處理每組染料濃度數(shù)據(jù)。在數(shù)次似真性檢查后，對定量標準核酸和靶核酸計算肘值(elbowvalue)(ct)。肘值定義為靶核酸或定量標準核酸的熒光與預定閾值(熒光濃度)相交的點。滴度測定基于如下的假定，即靶核酸和定量標準核酸以相同的效率擴增，且在計算的肘值，擴增并檢測相等量的靶核酸和定量標準核酸擴增子拷貝數(shù)。因此，(ctqs–ct靶物)對對數(shù)(靶物濃度/qs濃度)呈線性，其中“qs”代表內部定量標準核酸。然后，可以例如通過使用如下述等式中的多項式校正式計算滴度t：t’＝10(a(ctqs–ct靶物)2+b(ctqs–ct靶物)+c)已知多項式常數(shù)和定量標準核酸的濃度，因此該等式中唯一的變量是差(ctqs–ct靶物)。在僅檢測流體樣品中靶核酸的存在或缺乏外，測定所述核酸的量也經(jīng)常是重要的。舉例而言，病毒性疾病的階段和嚴重性可以基于病毒載量評估。此外，任何療法的監(jiān)測需要關于個體中存在的病原體量的信息以估計療法的成功與否?？紤]上文提及的內容，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其進一步包括在步驟iii.后測定靶核酸的量的步驟。此外，在本發(fā)明的意義中，一種或多種對照核酸可以充當“定性內部對照核酸”。生物學樣品中核酸的定性檢測對于例如識別個體感染是至關重要的。由此，用于檢測微生物性感染的測定法的一個重要的要求是避免假陰性或假陽性結果，因為這類結果幾乎會不可避免地導致就相應患者的治療而言的嚴重后果。因此，特別是在基于pcr的方法中，向檢測混合物添加定性內部對照核酸。所述對照對于確定測試結果的有效性是特別重要的：至少在就相應的靶核酸而言陰性結果的情況中，定性內部對照反應在特定背景內必須表現(xiàn)為反應性的，即必須檢測出定性內部對照，否則認為該測試自身是無效的。然而，在定性設置中，在陽性結果的情況中沒有必要必須檢出所述定性內部對照。對于定性測試，特別重要的是，保證靈敏度，并且因此對其嚴格控制。因此，定性內部對照的濃度必須相對較低，從而即使在例如略微抑制的情況中，沒有檢測出定性內部對照，并且因此該測試是無效的。必須注意使其適應相應的測定法及其靈敏度。優(yōu)選地，定性內部核酸，即第二對照核酸的濃度范圍會包含每個反應1個拷貝至每個反應1000個拷貝的范圍。就相應測定法的檢測限(lod)而言，優(yōu)選地，其濃度在測定法的lod和lod的25倍數(shù)值之間，更優(yōu)選地在lod和10倍lod之間。更優(yōu)選地，其在2倍和10倍lod之間。甚至更優(yōu)選地，其在5倍和10倍lod之間。最優(yōu)選地，其為5倍或10倍lod。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述內部對照核酸的擴增產(chǎn)物的存在即使在缺乏一種或多種所述靶核酸的擴增產(chǎn)物的情況中指示反應混合物中發(fā)生擴增。本發(fā)明特別可用于開發(fā)對多種參數(shù)和/或核酸類型在對所述不同參數(shù)和/或核酸類型使用相同內部對照核酸序列的情況中進行的同時測定法。因此，它促成在多種水平上降低相應實驗的總體復雜性：例如，僅必須設計一種內部對照核酸序列，并且添加至相應的擴增混合物，如此節(jié)省用于設計和合成或購買多種對照核酸序列的時間和成本?？梢詫⒁环N或多種測定法流線化(streamline)，并且減少操作錯誤。另外，在相同條件下同時實施的一個測定法或平行測定法中采用的不同對照核酸序列越多，可發(fā)生的相應條件的調節(jié)越復雜。此外，憑借適合于多種核酸的單一對照，可以將所述對照從單一來源分配入例如含有所述不同靶核酸的不同容器中。在本發(fā)明的范圍內，單一對照核酸序列也可以充當定性和定量對照。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選方面是一種用于分離和同時擴增可以存在于一種或多種流體樣品的至少第一和第二靶核酸的方法，所述方法包括下列自動化步驟：a.向每種所述流體樣品添加內部對照核酸b.在一個或多個容器中將固體支持材料和所述一種或多種流體樣品于一定條件下組合在一起達一段時間，所述條件和時間段足以允許包含所述靶核酸和內部對照核酸的核酸在所述固體支持材料上固定化c.在分離站中將所述固體支持材料自存在于所述流體樣品中的其它物質分離d.在所述分離站中純化所述核酸，并將所述固體支持材料用清洗緩沖液清洗一次或多次e.在至少兩個反應容器中使所述純化的靶核酸和所述純化的內部對照核酸與一種或多種擴增試劑接觸，所述擴增試劑包含針對每種所述靶核酸和所述內部對照核酸的至少一組獨特引物，其中至少第一反應容器至少包含所述第一靶核酸，而至少第二反應容器至少包含所述第二靶核酸，且其中所述第二靶核酸不存在于第一反應容器中f.在所述反應容器中將所述純化的靶核酸和所述純化的內部對照核酸與所述一種或多種擴增試劑在一定的條件下一起溫育達到一段時間，所述條件和時間段足以發(fā)生指示所述靶核酸存在或缺乏的擴增反應，g.檢測并測量由所述靶核酸的擴增產(chǎn)物生成并與所述靶核酸濃度成比例的信號，以及檢測并測量由所述內部對照核酸生成的信號，其中步驟d.至g.中用于擴增和檢測的條件對于所述至少第一和第二純化的靶核酸和所述內部對照核酸是等同的，且其中所述內部對照核酸的序列對所述至少第一和第二純化的靶核酸是等同的。作為上文所描述的方法的進一步的優(yōu)點，在可能的后續(xù)實驗中對特定生物學樣品測試其它核酸不需要牽涉添加不同內部對照核酸的另一個樣品制備規(guī)程，因為可以使用本發(fā)明中使用的對照來檢驗不同核酸的擴增。因此，一旦已經(jīng)添加內部對照核酸，可以在相同條件下在相同樣品中測試其它參數(shù)。內部對照核酸可以是競爭性、非競爭性或部分競爭性的。競爭性內部對照核酸攜帶與靶物基本相同的引物結合位點，并且由此與靶物競爭相同引物。雖然此原理允許對相應靶核酸的良好模仿(由于其類似結構)，但是它可以降低就一種或多種靶核酸而言的擴增效率，并且因此導致測定法不太靈敏。非競爭性內部對照核酸具有不同于靶物的引物結合位點，并且如此結合不同引物。這類設置的優(yōu)點包含如下的事實，即反應混合物中不同核酸的單一擴增事件可以在沒有任何競爭效應的情況中彼此獨立發(fā)生，等等。因此，對該測定法的檢測限沒有發(fā)生不利影響(如可以是在競爭性設置中的情況)。最后，在使用部分競爭性設置的擴增中，相應的對照核酸和至少一種靶核酸競爭相同引物，而至少一種其它靶核酸結合不同引物。如下的事實使所述方法變得相當靈活，即上文所描述的方法牽涉針對每種所述靶核酸和所述內部對照核酸的一組獨特引物。在此非競爭性設置中，沒有必要將靶物特異性結合位點引入對照核酸中(如在競爭性設置的情況中)，并且避免如上文提及的競爭性設置的缺點。在非競爭性設置中，內部對照核酸具有不同于任何靶序列的序列，從而不競爭它們的引物和/或探針。優(yōu)選地，內部對照核酸的序列不同于流體樣品中的其它核酸序列。例如，如果流體樣品自人衍生，那么優(yōu)選地，內部對照核酸沒有也內源性存在于人內的序列。如此，序列差異應該至少足夠顯著，從而不容許引物和/或探針在嚴格條件下對相應的一種或多種內源核酸的結合，并且如此，使得設置變?yōu)楦偁幮缘?。為了避免這類干擾，優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的內部對照核酸序列自與流體樣品起源不同的來源衍生。優(yōu)選地，其自天然存在的基因組，優(yōu)選地植物基因組，進一步優(yōu)選地葡萄基因組衍生。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，自天然存在的基因組衍生的核酸是混雜的。如本領域中已知的，“混雜”意味著在序列中以某種程度引入堿基突變。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的內部對照核酸的序列相對于衍生其的天然存在的基因是實質性改變的。在本發(fā)明的上下文中，“序列”是核酸的一級結構，即組成相應核酸的單個核堿基的特定排列。應當理解的是，術語“序列”并非指特定類型的核酸諸如rna或dna，而是適用于這兩者以及其它類型的核酸諸如例如pna或其它。在核堿基彼此對應的情況中，特別是在尿嘧啶(存在于rna中)和胸腺嘧啶(存在于dna中)的情況中，可以認為這些堿基在rna和dna序列之間是等同的，如相關領域中公知的。臨床相關核酸經(jīng)常是dna，其可以自例如dna病毒如例如乙肝病毒(hbv)、巨細胞病毒(cmv)等，或細菌如例如沙眼衣原體(ct)、淋病奈瑟氏球菌(ng)等衍生。在這類情況中，可以有利的是，使用由dna組成的內部對照核酸，以反映靶核酸特性。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述內部對照核酸是dna。在另一方面，臨床診斷學相關的眾多核酸是核糖核酸，如例如來自rna病毒諸如例如人免疫缺陷病毒(hiv)、丙肝病毒(hcv)、西尼羅病毒(wnv)、人乳頭狀瘤病毒(hpv)、日本腦炎病毒(jev)、圣路易斯腦炎病毒(slev)等的核酸?？梢詫⒈景l(fā)明容易地應用于這類核酸。在此情況中，可以有利的是使用由rna組成的內部對照核酸，以反映靶核酸特性。如果要在上文所描述的方法中分析rna和dna兩者，那么優(yōu)選的是內部對照核酸是rna，因為優(yōu)選地，內部對照核酸模擬牽涉多種靶物的測定法中最靈敏的靶物，并且rna靶物通常必須更緊密地控制。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述內部對照核酸是rna。由于rna比dna更易降解(由于諸如堿性ph、核糖核酸酶等影響所致)，優(yōu)選地，由rna構成的內部對照核酸以裝甲顆粒提供。裝甲顆粒諸如特別是裝甲rna記載于例如ep910643中。簡言之，至少部分將rna在病毒外殼蛋白中包囊，所述rna可以用化學法或者優(yōu)選地，例如由細菌諸如例如大腸桿菌(e.coli)異源生成。后者賦予rna對外部影響，特別是核糖核酸酶的抗性。必須理解的是，內部對照dna也可以以裝甲顆粒提供。裝甲rna和dna兩者在本發(fā)明上下文中可用作內部對照核酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，在大腸桿菌中用ms2外殼蛋白裝甲rna對照核酸。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，使用λ噬菌體gt11裝甲dna對照核酸。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述內部對照核酸是裝甲核酸。上文所描述的測定法的結果可以是摻雜的，并且例如包括假陽性(在與來自與流體樣品不同的來源的核酸交叉污染的情況中)。特別地，前者實驗的擴增物可以促成這類不期望的效果。一種用于使核酸擴增的交叉污染的效應最小化的具體方法記載于美國專利號5,035,996中。該方法牽涉將非常規(guī)的核苷酸堿基諸如dutp引入擴增產(chǎn)物中，并將遺留產(chǎn)物暴露于酶和/或物理化學處理以使產(chǎn)物dna不能充當后續(xù)擴增的模板。用于這類處理的酶是本領域中已知的。例如，尿嘧啶dna糖基化酶(也稱為尿嘧啶-n-糖基化酶或ung)從含有所述堿基的pcr產(chǎn)物中除去尿嘧啶殘基。酶處理導致對污染性遺留pcr產(chǎn)物的降解，并且用來使擴增反應“絕育”。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其在步驟i.和步驟ii.之間進一步包括下列步驟·在一定條件下用酶處理流體樣品，其中酶促降解來自自其它樣品擴增交叉污染性核酸的產(chǎn)物；·將所述酶失活。優(yōu)選地，所述酶是尿嘧啶-n-糖基化酶。在上文所描述的方法中，優(yōu)選的是所有步驟都是自動化的?！白詣踊币馕吨椒ǖ牟襟E適合于用儀器或機器實施，所述儀器或機器能夠在很少或沒有人為外部控制或影響的情況中運行。僅可能必須手動完成該方法的制備步驟，例如必須將貯存容器充滿并放好位置，樣品的選擇必須人為實施以及本領域技術人員已知的其它步驟，例如控制計算機的操作。儀器或機器可以例如自動添加液體，混合樣品或于特定溫度實施溫育步驟。典型地，這類機器或儀器是由計算機控制的機器人，該計算機實施規(guī)定單一步驟和命令的程序。本發(fā)明的另一個方面是用于分離和同時擴增可以存在于流體樣品中的至少兩種靶核酸的分析系統(tǒng)(440)，所述分析系統(tǒng)包含下列模塊：·包含固體支持材料的分離站(230)，所述分離站構建并排列為分離并純化流體樣品中包含的靶核酸·包含至少兩個反應容器的擴增站(405)，所述反應容器包含擴增試劑、在至少第一反應容器中的至少第一純化的靶核酸和在至少第二反應容器中的至少第二純化的核酸(其中所述第二核酸不存在于所述第一反應容器中)，以及具有逆轉錄酶活性的聚合酶，所述聚合酶相對于相應的野生型聚合酶進一步包含如下的突變，該突變賦予改善的核酸延伸速率和/或改善的逆轉錄酶活性?！胺治鱿到y(tǒng)”是以分析給定的樣品為最終目的，彼此相互作用的組件諸如儀器的排列。本發(fā)明的分析系統(tǒng)(440，圖11)是包含用于分離和/或純化分析物的模塊(401)的系統(tǒng)(440)。此外，系統(tǒng)(440)另外包含用于分析所述分析物以獲得可檢測信號的模塊(403)?？梢栽谙嗤K(401、402、403)中或者備選地在分開模塊中檢測可檢測信號。如本文中使用的，術語“模塊”指分析儀(400)內的任何空間限定位置。兩個模塊(401、403)可以以壁分開，或者可以處于開放關系。任一個模塊(401、402、403)可以自主控制，或者模塊(401、402、403)的控制可以與其它模塊共享。優(yōu)選地，中央控制所有模塊。模塊(401、402、403)間的轉移可以是手動的，但是優(yōu)選是自動的。因此，本發(fā)明涵蓋自動化分析儀(400)的許多不同實施方案?！胺蛛x站”在上文有描述?！皵U增站”包含用于溫育至少兩個反應容器的內容物的溫度受控型恒溫箱。其進一步包含多個反應容器如管或板，其中發(fā)生用于樣品分析的反應諸如pcr。這類容器的外部界限或壁是化學惰性的，使得其不干擾之內發(fā)生的擴增反應。為了易于操作并促進自動化，優(yōu)選的是，將至少兩個反應容器在整體排列中組合，因此可以對它們一起操作。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是上文描述的分析系統(tǒng)，其中所述至少兩個反應容器在整體排列中組合。整體排列可以是例如可逆或不可逆地彼此附著或在架中排列的管形瓶或管。優(yōu)選地，所述整體排列是多孔板。優(yōu)選地，所述多孔板在固定站(holdingstation)中容納。在一個更優(yōu)選的實施方案中，一個輸送裝置將多孔容器從固定站運輸?shù)綒怄i(air-lock)(460)，而第二輸送裝置將所述多孔板從所述氣鎖運輸?shù)剿鰯U增站，其中這兩個輸送裝置通過形式鎖定相互作用與所述多孔板相互作用。在一個優(yōu)選的實施方案中，分析系統(tǒng)是全自動化的。在一個實施方案中，在系統(tǒng)的各站間運輸整體排列中組合的至少兩個反應容器。在第二個實施方案中，將純化的靶核酸從所述分離站轉移到所述擴增站。優(yōu)選地，用包含附著有移液管尖端的移液管的移液器轉移包含純化的核酸的液體。在第三個實施方案中，將純化的核酸從所述分離站轉移到固定站中容納的整體排列中的反應容器。優(yōu)選地，然后，將整體排列中的所述反應容器從所述固定站轉移到所述擴增站。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)進一步包含移液單元。所述移液單元包含至少一個移液管，優(yōu)選地多個移液管。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述多個移液管在一個或多個整體排列中組合，優(yōu)選地，在所述整體排列內可以個別操作移液管。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中使用的移液管是包含移液管尖端的移液管，如上文描述的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述移液管是移液針?；蛘撸梢詫⒂糜诜蛛x站中樣品制備并含有包含純化的靶核酸的流體的反應容器或反應容器排列從分離站轉移到擴增站。為此目的，優(yōu)選地，依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)進一步包含轉移單元，優(yōu)選地，所述轉移單元包含機器人裝置，優(yōu)選地，所述裝置包含輸送裝置。出于上文在依照本發(fā)明的方法的背景中提出的原因，以下是本發(fā)明進一步優(yōu)選的方面：·上文描述的分析系統(tǒng)(440)，其中至少一個反應容器包含rna靶核酸和dna靶核酸?！ど衔拿枋龅姆治鱿到y(tǒng)(440)，其中至少一個反應容器包含rna靶核酸，而至少一個另一反應容器包含dna靶核酸。優(yōu)選地，上文描述的分析系統(tǒng)(440)進一步包含一個或多個選自下組的元件：·用于檢測由分析物引起的信號的檢測模塊(403)·密封器(410)·用于試劑和/或一次性用品的貯存模塊(1008)?！び糜诳刂葡到y(tǒng)組件的控制單元(1006)。“檢測模塊”(403)可以例如是用于檢測擴增規(guī)程結果或效果的光學檢測單元。光學檢測單元可以包含光源，例如氙氣燈，用于引導和過濾光的光學鏡諸如鏡、透鏡、光學濾光片、纖維光學鏡，一個或多個參照通道，或ccd照相機或不同的照相機?！懊芊馄鳌?410)構建并排列為密封與依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)結合使用的任何容器。這類密封器可以例如用合適的蓋密封管，或用箔或其它合適的密封材料密封多孔板。“貯存模塊”(1008)貯存對于引起對分析流體樣品重要的化學或生物學反應必需的試劑。其還可以包含對本發(fā)明的方法有用的其它組分，例如一次性用品諸如移液管尖端或在分離站和/或擴增站內要用作反應容器的容器。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)進一步包含用于控制系統(tǒng)組件的控制單元。這類“控制單元”(1006)可以包含用于確保所述分析系統(tǒng)的不同組件正確且以正確的時機工作并相互作用(例如以協(xié)調方式移動并操作組件諸如移液管)的軟件?？刂茊卧€可以包含運行實時操作系統(tǒng)(rtos)(其是意圖用于實時應用的多任務操作系統(tǒng))的處理器。換言之，該系統(tǒng)處理器能夠管理實時約束，即從事件到系統(tǒng)應答的操作最后期限(與系統(tǒng)加載無關)。其以實時控制系統(tǒng)內的不同單元依照給定的指令正確運行并應答。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于處理分析物的分析系統(tǒng)(440)，其包含a.第一位置，該第一位置包含以線性排列且包含流體樣品(1010)的第一接受器(receptacle)(1001)、包含以nxm排列且用于容納流體樣品(1011)的接受器(103)的加工板(101)、包含線性排列的至少兩個移液單元(702)的第一移液裝置(700)(其中所述移液單元(702)與移液管尖端(3、4)偶聯(lián))、以及包含以ax(nxm)排列的移液管尖端(3、4)的尖端架(70)；b.第二位置，該第二位置包含用于所述加工板(101)的固定器(201、128)、用于多孔板的固定器(330)、用于所述尖端架(70)的固定器(470)和第二移液裝置(35)，所述第二移液裝置(35)包含以nxm排列且與移液尖端(3、4)偶聯(lián)的移液單元(702)(圖12)。如本文中使用的，術語“固定器”指任何能夠接受架或加工板的排列。本發(fā)明的分析系統(tǒng)(440)的優(yōu)點如上文對本發(fā)明的方法所描述的。優(yōu)選地，第一移液裝置(700)的所述移液單元(702)的位置是可變的。所述第一移液裝置(700)的優(yōu)選實施方案在下文中進行描述。在一個實施方案中，所述尖端架(70)包含以ax(nxm)排列的移液管尖端(3、4)。優(yōu)選地，尖端架(70)中包含第一類(4)和第二類(3)移液管尖端。在此實施方案中，第一類移液管尖端(4)以nxm排列形式排列，而第二類移液管尖端(3)以nxm排列形式排列。在此背景中，“n”指行數(shù)，而m指列數(shù)，其中優(yōu)選地，n是6，且優(yōu)選地，m是8。更優(yōu)選地，第一類移液管尖端(4)與第二類移液管尖端(3)具有不同體積，最優(yōu)選地，第一類移液管尖端(4)的體積超過500ul，而第二類移液管尖端(3)的體積小于500ul。在此實施方案中，a＝2。然而，本發(fā)明中還包括具有超過兩類移液管尖端，并且因此a>2的本發(fā)明實施方案。在一個方面，本發(fā)明的分析系統(tǒng)(440)包含用于向所述加工板(101)各個位置分配樣品類型和各個測試的控制單元(1006)。優(yōu)選地，所述位置是分開的室(401、402)。在本發(fā)明的一個方面，所述系統(tǒng)另外包含轉移系統(tǒng)(480)，其用于在所述第一(402)和第二(401)位置之間轉移所述加工板(101)和所述架(70)。所述轉移系統(tǒng)(480)的優(yōu)選實施方案是傳送帶，或更優(yōu)選地，一個或多個輸送裝置。此外，優(yōu)選地，所述第二移液裝置(35)的所述移液管單元與在第一位置(402)中使用的移液管尖端(3、4)銜接。另外，本發(fā)明的系統(tǒng)(440)的一個優(yōu)選實施方案包含第三站(403)，所述第三站包含溫度受控型溫育箱，其用于將所述分析物與獲得可檢測信號必需的試劑一起溫育。此系統(tǒng)的進一步優(yōu)選的實施方案在下文中描述。用第一處理器(1004)和第二處理器(1005)對nxm排列實現(xiàn)樣品和測試定位的更加優(yōu)化控制，所述第一處理器(1004)包含在所述第一位置(402)中且所述控制單元(1006)對其轉移指令，該指令關于將樣品類型和各個測試分配到加工板(101)的nxm排列的容器(103)中的特定位置，所述第二處理器(1005)包含在所述第二位置(401)中且所述控制單元(1006)對其轉移指令，該指令關于將樣品類型和各個測試分配到加工板的nxm排列的容器(103)中的特定位置。優(yōu)選地，另外，所述系統(tǒng)包含位于所述第一位置中的第一處理器，和位于所述第二位置中的第二處理器。更優(yōu)選地，所述第一處理器(1004)控制所述第一移液裝置(700)，而所述第二處理器(1005)控制所述第二移液裝置(35)。依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)的所有其它優(yōu)選實施方案和實施方案的具體描述是那些對依照本發(fā)明的方法提述的。附圖簡述圖1：如本發(fā)明的一個實施方案中使用的樣品制備工作流的示意圖。朝下的箭表示向上文提及的深孔板的每個相應孔添加組分或試劑，朝上的箭表示其相應的除去。這些動作在步驟2、3、4、21和22中手動實施，在步驟10、14、16、18和24中通過裝置的加工頭(processhead)實施，以及在步驟5、6、7、11、15和19中通過裝置的試劑頭(reagenthead)實施。必須理解的是，可以在本發(fā)明的精神內靈活調節(jié)使用的體積，優(yōu)選地，至少約多至公開值的30％。具體地，在步驟2的情況中，優(yōu)選地，樣品體積是可變的，從而考慮到不同類型的流體樣品，其可以需要或多或少的起始材料來獲得正確的結果，如技術人員已知的。優(yōu)選地，范圍是約100ul至約850ul。更優(yōu)選地，其是約100ul、約500ul或約850ul。優(yōu)選地，在步驟3中用稀釋劑將相應容器中的體積調節(jié)至相同總體積。優(yōu)選地，如在圖1中顯示的方案中，總體積合計多至約850ul。圖2a至2g：如實施例1中描述的，在lightcycler480(rochediagnosticsgmbh,mannheim,de)上實施擴增自hiv、hbv和ct衍生的靶核酸的增長曲線。y軸上標示的“信號”是標準化的熒光信號。x軸顯示相應pcr循環(huán)的數(shù)目。與相應的內部對照核酸的增長曲線一起顯示hiv和hbv的增長曲線。相應的靶核酸曲線以直線表示，對照核酸曲線以點線表示。圖2a：定性hiv測定法，其在用于檢測靶探針的通道中測量。圖2b：定性hiv測定法，其在用于檢測對照探針的通道中測量。圖2c：定量hiv測定法，其在用于檢測靶探針的通道中測量。圖2d：定量hiv測定法，其在用于檢測對照探針的通道中測量。圖2e：定量hbv測定法，其在用于檢測靶探針的通道中測量。圖2f：定量hbv測定法，其在用于檢測對照探針的通道中測量。圖2g：ct測定法，其在用于檢測靶探針的通道中測量。圖3：加工板的透視圖。圖4：從對角看，加工板的透視圖。圖5：加工板的俯視圖。圖6：沿加工板較長側的橫截面視圖。圖7：橫截面視圖的局部視圖。圖8：加工板較長側的透視圖。圖9：a)至d)顯示磁性分離站的第二個實施方案的不同視圖。圖10：(a)至(c)顯示容納加工板的磁性分離站的第一個實施方案的視圖，第一類磁體在最高的z位置中，而第二類磁體在最低的z位置中。圖11：包含不同站、模塊或室的分析儀的示意圖。圖12：顯示本發(fā)明的分析系統(tǒng)。圖13：依照實施例2中的數(shù)據(jù)，edta血漿中定量hbv測定法的線性。圖14：依照實施例2中的數(shù)據(jù)，血清中定量hbv測定法的線性。圖15：依照實施例2中的數(shù)據(jù)，edta血漿中定量hcv測定法的線性。圖16：依照實施例2中的數(shù)據(jù)，血清中定量hcv測定法的線性。圖17：依照實施例2中的數(shù)據(jù)，edta血漿中定量hiv測定法的線性。實施例以下實施例描述了可以運行本發(fā)明的實施方案。本領域技術人員清楚的是，這些實施例并非限制性的，并且可以在不背離本發(fā)明的精神的情況中修改。實施例1：本實施例描述了一種用于分離和同時擴增至少第一和第二靶核酸的方法，其使用單一通用內部對照核酸。簡言之，在描述的實施方案中，對一組數(shù)種不同靶物同時且在相同條件下實施實時pcr，所述靶物包含細菌(沙眼衣原體，ct)以及dna病毒(hbv)和rna病毒(hiv)。所有樣品分別在相同實驗內，即在同一深孔板(用于樣品制備)或多孔板(用于擴增和檢測)上加工并分析。制備下列樣品，隨后分析：試劑制造商：hiv-1m二級標準品，50’000cp/mlrochehbv二級標準品，400iu/mlrochect(dnaposctlpchl-1)roche熟練技術人員可獲得合適的標準品或其它類型的靶物。依照相應制造商的用法說明書使用下表中列出的儀器：對于樣品制備，使用下列試劑作為稀釋劑：試劑制造商：preservcytthinprepk3edta血漿，pcr陰性roche預先制備下列稀釋物，并貯存過夜(血漿稀釋物于-60至-90℃，preservcyt稀釋物于2-8℃)：將每份相應的樣品(500ul)和每份相應的標本稀釋劑(350ul)手動移液入深孔板中，其中將每種樣品添加至三個不同的孔，用于一式三份分析。對每個含有hiv或hbv樣品的孔，手動添加50ul內部對照核酸。對于定性hiv測定法，添加充當定性對照的rna(100個裝甲顆粒/樣品)。對于定量hiv測定法，添加充當定量標準品的rna(500個裝甲顆粒/樣品)。對于定量hbv測定法，添加充當定量標準品的dna(1e4個拷貝/樣品)。所述對照核酸的序列在所有情況中是相同的，并且選自seqidno45-48的組。將相應的對照核酸在下列緩沖液中貯存：ic/iqs–貯存緩沖液濃度或phtris(mm)10edta(mm)0.1疊氮化鈉(w/v,％)0.05多聚rarna(mg/l)20ph8遵循依照圖1中描述的方案的工作流并使用下列試劑在hamiltonstar(hamilton,bonaduz,ch)上實施樣品制備：在最終步驟后，hamiltonstar裝置的加工頭將含有擴增試劑的相應主混合物(mastermix)(mmx)添加至每孔，將含有分離的核酸的流體與mmx混合，并將每種所得的混合物轉移到實施擴增的深孔板的相應孔。使用下列主混合物(各由兩種試劑r1和r2組成)：對于hiv：對于hbv：對于ct：r1試劑濃度/50μl-pcr水(pcr級)mn(ac)2(在0.002％(v/v)冰醋酸中ph6.5)2.7mmnan30.0135％(w/v)r2試劑濃度/50μl-pcrnan3/ri，用10mmtris(ph7)緩沖[％]0.0315％乙酸鉀112.4mm甘油[％]3.5％tricine61mm氫氧化鉀28.4mmdgtp525umdatp525umdctp525umdutp1.05mmseqidno39750nmseqidno40600nmseqidno41116nm適體ntq-46a175nm尿嘧啶-n-糖基化酶5u/反應z05-d聚合酶31u/反應對于擴增和檢測，將微孔板用自動化板密封器(見上文)密封，并將板轉移到lightcycler480(見上文)。使用下列pcr概況：熱循環(huán)概況檢測形式(手動)濾光器組合積分時間(秒)435-4701495-5250.5540-5800.5610-6450.5680-7001預pcr程序包含起始變性和于55、60和65℃溫育以逆轉錄rna模板。于三個溫度溫育組合如下的有利效果，即于較低的溫度，也轉錄略有錯配的靶序列(諸如生物體的遺傳變體)，而于較高的溫度，抑制rna二級結構的形成，如此導致更有效的轉錄。將pcr循環(huán)分成兩次測量，其中兩次測量都應用一步設置(組合退火和延伸)。于55℃的前5個循環(huán)通過預擴增略有錯配的靶序列允許升高的包容性，而第二次測量的45個循環(huán)通過使用58℃的退火/延伸溫度提供升高的特異性。對上文提及的微孔板上包含的所有樣品使用此概況，在所有樣品中都實現(xiàn)了擴增和檢測，如圖2a至2g中描繪的。這顯示也成功實施了擴增前的樣品制備。為了清楚，在圖2a至2g中分開描繪了定性和定量hiv內部對照以及定量hbv內部對照的結果?？梢钥吹降氖?，在所有情況中也成功擴增了對照。通過與充當定量標準的內部對照核酸比較來計算定量設置中hiv和hbv靶物的定量。實施例2：在別的實驗中，但在相同條件下對多種不同靶核酸實施上文中描述的通用擴增方法。如在實施例1下描述的，實施相應核酸的分離。相應的通用內部對照核酸選自seqidno45-49，并且是裝甲rna(對于rna靶物)和λ包裝的dna(對于dna靶物)。對于定性rna測定法，每份樣品添加300個顆粒，對于定量rna測定法，每份樣品添加3000個顆粒，而對于所有dna測定法，每份樣品添加500個顆粒。對所有靶物使用下列pcr概況：名稱循環(huán)預pcr1第一次測量5第二次測量45冷卻1詳細地，實施以下實驗：1.對hbv、hcv和hiv的定性多重分析a.主混合物r1：50ul-pcr中的濃度(um)mn(ac)2*4h2o(用乙酸調節(jié)為ph6.1)3’300nan3/ri，用10mmtris(ph7)緩沖0.018ph：6.41r2：試劑50ul-pcr中的濃度(um)dmso(％)5.4nan3/ri，用10mmtris(ph7)緩沖0.027koac(ph7.0)120’000甘油(％)3tween20(％)0.015tricineph8.060’000ntq21-46a–適體0.2222尿嘧啶-n-糖基化酶(u/ul)0.2dgtp400.0datp400.0dctp400.0dutp800.0zo5-d聚合酶(u/ul)*0.9選自seqidno1-35的引物/探針0.125-0.3seqidno360.100seqidno370.100seqidno380.150選自seqidno60-76的引物/探針0.050-0.250seqidno420.200seqidno430.200seqidno440.100分析靈敏度/lod對于每種檢測的病毒(hiv-1m組、hiv-1o組、hiv-2、hbv和hcv)，對于edta-血漿，于處于預期lod及其左右的數(shù)個濃度/水平。以每個濃度至少20個有效重復，每個病毒和濃度測試一個組。通過probit分析測定lod(參見表1-5)。hiv表1：來自單個組的hiv-1m組命中率和probitlod將hiv-1m組的who標準的滴度轉化為iu/ml。因此，hiv-1m組lod(以iu/ml計)是通過probit分析(95％命中率)得到的lod：6.77iu/ml通過probit分析得到的lod的95％置信區(qū)間：4.75-15.4iu/ml表2：來自單個組的hiv-1o組命中率和probitlod將hiv-1o組的一級標準品的滴度再分配給cberhiv-1o組的組；計算因子是0.586。因此，hiv-1o組lod是通過probit分析(95％命中率)得到的lod：8.8cp/ml通過probit分析得到的lod的95％置信區(qū)間：6.4-18.5cp/ml表3：來自單個組的hiv-2命中率和probitlod將hiv-2的一級標準品的滴度再分配給cberhiv-2組；計算因子是26.7。因此，hiv-2lod是通過probit分析(95％命中率)得到的lod：34.44cp/ml通過probit分析得到的lod的95％置信區(qū)間：21.89-83.04cp/mlhbv表4：來自單個組的hbv命中率和probitlodhcv表5：來自單個組的hcv命中率和probitlod2.對wnv的定性分析主混合物r1：試劑50ul-pcr中的濃度(um)mn(ac)2*4h2o(用乙酸調節(jié)為ph6.1)3’300nan3/ri，用10mmtris(ph7)緩沖0.018ph：6.41r2：分析靈敏度/lod對于病毒(wnv、slev和jev)，以稀釋系列制備獨立組，包括處于預期lod及其左右的數(shù)種濃度/水平的相應標準品。以每個濃度至少20個有效重復，每個病毒和濃度測試一個組。通過probit分析測定lod。表6：來自單個組的wnv命中率和probitlod表7：來自單個組的slev命中率和probitlod表8：來自單個組的jev命中率和probitlod3.對hbv的定量分析主混合物r1：試劑50ul-pcr中的終濃度(um)mn(ac)2*4h2o(用乙酸調節(jié)為ph6.1)3’300nan3/ri，用10mmtris(ph7)緩沖0.018ph：6.41r2：試劑50ul-pcr中的終濃度(um)甘油(％,w/v)3％tricine60mmdmso(％,v/v)5.4％koac120mmtween20(v/v)0.015％適體ntq21-46a0.222μmzo5d聚合酶0.9u/μl(45u/rxn)尿嘧啶-n-糖基化酶0.2u/μl(10u/rxn)疊氮化鈉(w/v)0.027％dctp400μmdgtp400μmdatp400μmdutp800μmseqidno361.2μmseqidno371.2μmseqidno500.6μmseqidno510.6μmseqidno380.1μmseqidno52m分析靈敏度/lod用hbv二級標準品(代表基因型a)制備四個稀釋組，即在hbv陰性血清中兩個(對于200μl和500μl的樣品輸入體積)，以及在hbv陰性edta-血漿中兩個(對于200μl和500μl的樣品輸入體積)。每組包括處于預期lod及其左右的7個濃度水平。以每個濃度水平≥21個重復，每個基質測試一個組。至少20個重復需要是有效的。通過于95％命中率的probit分析以及通過≥95％命中率分析測定lod。表9：對edta血漿中200μl輸入體積的lod分析。**測試額外的重復以使觀察到的95％置信區(qū)間變窄。表10：對edta血漿中500μl輸入體積的lod分析表11：對血清中200μl輸入體積的lod分析表12：對血清中500μl輸入體積的lod分析匯總的lod：edta-血漿：對于edta血漿，于95％命中率的probit分析產(chǎn)生8.2iu/ml(對于200μl樣品輸入體積)和2.3iu/ml(對于500μl樣品輸入體積)的lod。這些濃度的95％置信區(qū)間范圍是4.8-26.0iu/ml(對于200μl樣品輸入體積)和1.6-4.2iu/ml(對于500μl樣品輸入體積)。血清：對于血清，于95％命中率的probit分析產(chǎn)生9.02iu/ml(對于200μl樣品輸入體積)和4.1iu/ml(對于500μl樣品輸入體積)的lod。這些濃度的95％置信區(qū)間范圍是6.2-19.0iu/ml(對于200μl樣品輸入體積)和2.4-10.0iu/ml(對于500μl樣品輸入體積)。線性通過使用hbv基因型a(由rmdresearchpleasanton提供，線性化質粒，phbv-pc_adw2)制備一個edta血漿組和一個血清組。以12個濃度水平分析每組以測定測定法的預期動力學范圍(4-2e+09iu/ml)。所有濃度水平/組成員(pm)都以21個重復測試。用500μl樣品輸入體積完成此研究。如下選擇濃度水平：一個水平低于預期的定量下限(lloq)，一個處于預期的lloq，一個高于預期的lloq，數(shù)個濃度處于中間水平，處于預期的定量上限(uloq)，而一個高于預期的uloq：pm12-2.0e+09iu/ml-高于預期的uloqpm11-1.0e+09iu/ml-處于預期的uloqpm10-1.0e+08iu/ml-低于預期的uloqpm9-1.0e+07iu/ml-中間濃度水平pm8-1.0e+06iu/ml-中間濃度水平pm7-1.0e+05iu/ml-中間濃度水平pm6-1.0e+04iu/ml-中間濃度水平pm5-1.0e+03iu/ml-中間濃度水平pm6a-2.0e+02iu/ml-中間濃度水平(將pm6稀釋到2.0e+02iu/ml，用于血清組的滴度分配)pm4-1.0e+02iu/ml-中間濃度水平(也用于血漿組的滴度分配)pm3-5.0e+01iu/ml-高于預期的lloqpm2-1.0e+01iu/ml-處于預期的lloqpm1-4.0e+00iu/ml-低于預期的lloq對于線性組的每份有效樣品，將觀察到的hbvdna滴度轉化為log10滴度，并且對每個濃度水平計算均值log10滴度。表13：edta血漿中的線性在圖13中顯示了此結果的圖形。表14：血清中的線性在圖14中顯示了此結果的圖形。匯總的線性：線性范圍(其定義為均值log10觀察到的滴度的log10偏差在log10名義滴度±0.3內的濃度范圍)測定為：對于edta-血漿為3.5e+00iu/ml–1.7e+09iu/ml，而對于血清為3.3e+00iu/ml–1.7e+09iu/ml。發(fā)現(xiàn)定量下限為：對于edta-血漿和血清為4.0e+00iu/ml。4.對hcv的定量分析主混合物r1：試劑50ul-pcr中的終濃度(um)mn(ac)2*4h2o(用乙酸調節(jié)為ph6.1)3’300nan3/ri，用10mmtris(ph7)緩沖0.018ph：6.41r2：試劑50ul-pcr(um)中的終濃度甘油(％,w/v)3％tricine60mmdmso(％,v/v)5.4％koac120mm吐溫20(v/v)0.015％ntq21-46a0.222μmzo5d0.9u/μl(45u/rxn)ung0.2u/μl(10u/rxn)疊氮化鈉(w/v)0.027dctp400μmdgtp400μmdatp400μmdutp800μm選自seqidno60-76的引物/探針0.1μmseqidno420.3μmseqidno430.3μmseqidno44μm分析靈敏度/lod使用200μl和500μl的樣品輸入體積，在hcv陰性edta血漿和血清中用rochehcv二級標準品制備稀釋組。以21個重復測試每個濃度水平。至少≥20個重復必須是有效的。通過于95％命中率的probit分析及通過≥95％命中率分析測定lod。表15：在edta血漿的200μl樣品加工輸入體積情況中的命中率和probit表16：在edta血漿的500μl樣品加工輸入體積情況中的命中率和probit表17：在血清的200μl樣品加工輸入體積情況中的命中率和probit表18：在血清的500μl樣品加工輸入體積情況中的命中率和probit匯總的lod：1.對于edta血漿，于95％命中率的probit分析產(chǎn)生17.4iu/ml(對于200μl樣品加工輸入體積)和9.0iu/ml(對于500μl樣品加工輸入體積)的lod。這些濃度的95％置信區(qū)間是12.1-34.3iu/ml(對于200μl樣品加工輸入體積)和5.5-25.4iu/ml(對于500μl樣品加工輸入體積)。2.對于血清，于95％命中率的probit分析值是20.2iu/ml(對于200μl樣品加工輸入體積)和8.2iu/ml(對于500μl樣品加工輸入體積)。這些濃度的95％置信區(qū)間是14.0-39.3iu/ml(對于200μl樣品加工輸入體積)和5.8-15.0iu/ml(對于500μl樣品加工輸入體積)。線性分析起源于hcvwho標準品的hcvarna的edta-血漿組的制備物和血清組的制備物。通過連續(xù)稀釋制備線性組，并在10個不同濃度分析。用500μl樣品加工輸入體積完成該研究。如下選擇濃度：一個水平低于預期的量化下限(lloq)，一個處于lloq，一個高于lloq，數(shù)個濃度處于中間水平，處于預期的量化上限(uloq)，而一個處于或高于uloq。對于所有濃度，測試21個重復。pm1-2.0e+08iu/ml-高于預期的uloqpm2-1.0e+08iu/ml-處于預期的uloqpm3-1.0e+07iu/ml-低于預期的uloqpm4-1.0e+06iu/ml-中間濃度水平pm5-1.0e+05iu/ml-中間濃度水平pm6-1.0e+04iu/ml-用于滴度分配的中間濃度水平pm7-1.0e+03iu/ml-中間濃度水平pm8-1.0e+02iu/ml-高于預期的lloqpm9-1.0e+01iu/ml-處于預期的lloqpm10-8.0e+00iu/ml-低于預期的lloq表19：edta血漿中的線性在圖15中顯示了此結果的圖形。表20：血清中的線性在圖16中顯示了此結果的圖形。匯總的線性：線性范圍(其定義為均值log10觀察到的滴度的log10偏差在log10名義滴度±0.3內的濃度范圍)測定為：對于edta-血漿為4.87e+00iu/ml–1.22e+08iu/ml，而對于血清為3.90e+00iu/ml–9.92e+07iu/ml。5.對hiv的定量分析主混合物r1：試劑50ul-pcr中的終濃度(um)mn(ac)2*4h2o(用乙酸調節(jié)為ph6.1)3’300nan3/ri，用10mmtris(ph7)緩沖0.018ph：6.41r2：分析靈敏度/lod對于200μl和500μl樣品輸入體積，在hiv-1陰性edta血漿中用hiv-1m二級標準品制備稀釋組。以21個重復測試每個濃度水平。至少≥20個重復必須是有效的。通過于95％命中率的probit分析及通過≥95％命中率分析測定lod。表21：對edta-血漿中200μl輸入體積的lod分析表22：對500μl輸入體積的lod分析匯總的lod：1.于95％命中率的probit分析產(chǎn)生41.8cp/ml(對于200μl輸入體積)和18.9cp/ml(對于500μl輸入體積)的lod。2.這些濃度的95％置信區(qū)間是30.9-74.9cp/ml(對于200μl輸入體積)和14.9-29.4cp/ml(對于500μl輸入體積)。線性在線性/動力學范圍/準確度研究中使用的樣品由hiv-1細胞培養(yǎng)物上清液材料hiv-1m組b亞型的稀釋組組成。通過連續(xù)稀釋制備線性組。在10個濃度水平分析此組。如下選擇濃度：一個水平低于預期的定量下限(lloq)，一個處于lloq，一個高于lloq，數(shù)個濃度處于中間水平，處于預期的定量上限(uloq)，而一個高于uloq。對于所有濃度，測試21個重復。用500μl輸入體積完成該線性研究：pm1-2.0e+07cp/ml-高于預期的uloqpm2-1.0e+07cp/ml-處于預期的uloqpm3-1.0e+06cp/ml-低于預期的uloqpm4-1.0e+05cp/ml-中間濃度水平pm5-3.0e+04cp/ml-用于滴度分配的中間濃度水平pm6-1.0e+04cp/ml-中間濃度水平pm7-1.0e+03cp/ml-中間濃度水平pm8-1.0e+02cp/ml-中間濃度水平pm9-5.0e+01cp/ml-高于預期的lloqpm10-2.0e+01cp/ml-處于預期的lloqpm11-1.5e+01cp/ml-低于預期的lloq表23：edta血漿中的線性在圖17中顯示了此結果的圖形。匯總的線性線性范圍(其定義為均值log10觀察到的滴度的log10偏差在log10名義滴度±0.3內的濃度范圍)測定為1.5e+01cp/ml–2.0e+07cp/ml。序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司(f.hoffmann-larocheag)<120>通用樣品制備<130>26551ep1<160>76<170>patentinversion3.5<210>1<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>1agtggggggacatcaagcagccatgcaaa<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>2agtggggggacatcaagcagccatgcaaat30<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>3gctttcagcccagaagtaatacc23<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>4ggacacatcaagcagccatgcaaat25<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>5agagaaccaaggggaagtga20<210>6<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>6ataatccacctatcccagtaggagaaat28<210>7<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>7agtggggggacaccaggcagcaatgcaaa29<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>8catagcaggaactactagta20<210>9<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>9ggtactagtagttcctgctatgtcacttcc30<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>10ctatgtcacttccccttggttctct25<210>11<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>11ggtactagtagttcctgctatatcacttcc30<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>12tccttgtcttatgtccagaa20<210>13<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>13tttggtccttgtcttatgtccagaatgc28<210>14<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>14tactagtagttcctgctatgtcacttcc28<210>15<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>15tgtgttatgatggtgtttaaatc23<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>16actctaaagggttcctttgg20<210>17<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>17tctgcagcttcctcattgatggtatcttttaac33<210>18<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>18tcagcattatcagaaggagccaccccaca29<210>19<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>19tctgcagcttcctcattgaggtatcttttaac32<210>20<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>20atcctgggattaaataaaatagtaagaatgtatagccctac41<210>21<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>21accatcaatgagggaagctgcagaatggg29<210>22<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>22tgactctggtaactagagatccctca26<210>23<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>23tgttcaaccctggtatctagagatccctca30<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>24ggctaactagggacccactg20<210>25<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>25actagggaacccactgct18<210>26<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>26tcagcaagccgagtcctgcgtcgaga26<210>27<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>27ccgctaagccgagccctttgcgtcgga27<210>28<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>28ggtctgagggatctcta17<210>29<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>29ctgctagagattttccacactgac24<210>30<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>30ggctccacgcttgcttgcttaaa23<210>31<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>31ggctccacgcttgcttgc18<210>32<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>32ttcccaaagcaagaagggtcctaacagacca31<210>33<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>33tctctagcagtggcgcccgaacagggac28<210>34<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>34accagagtcacacaacagacgggcacacactact34<210>35<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>35tcctagtcgccgcctggtcattcggtgttca31<210>36<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>36catgcaactttttcacctctgccta25<210>37<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>37aactccacagtagctccaaattcttta27<210>38<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>38ccaagctgtgccttgggtggctttggggcatgg33<210>39<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>39gggattcctgtaacaacaagtca23<210>40<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>40tcttccccagaacaataagaacac24<210>41<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>41ggcttgcagagttctatagtgctatg26<210>42<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>42ttgatagcaatcggctatcgactaa25<210>43<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>43gcttcgatactcagtcatctcggtataa28<210>44<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>44tctctcgccatctcctaccgcattggc27<210>45<211>269<212>dna<213>人工序列<220><223>體內對照核酸(internalcontrolnucleicacid)<400>45aattcaagcttagatctagctttgcctgcttgatagcaatcggctatcgactaatgactg60tcctggcggtctctcgccatctcctaccgcattggctcataggtaagctcgctgtcaccc120agtacggaggtgccagtagattattagagacagtcgccaatcgatcgttataccgagatg180actgagtatcgaagctacattgtagccgcacataggaccacccatcttcatgttgaaaca240tgaggattacccatgtggatccaagcttg269<210>46<211>235<212>dna<213>人工序列<220><223>體內對照核酸(internalcontrolnucleicacid)<400>46gggctgcaggtcgactctagattctaagaatttgatgggctttttctactaattactatt60agtatattgccatctttaacacttagaccgaagtgtgctgaagttccagtggccggccca120gacctgggaagttgcaaggacttaaacgaatgcaagcgatcatatcttgaaaaattataa180ccagaggatcgatgaaaaaaatttcttagagctttggatccccgggcgagctccc235<210>47<211>350<212>dna<213>人工序列<220><223>體內對照核酸(internalcontrolnucleicacid)<400>47cgactctagatgaagggagccttagaacggggctgcgctagctggcatcaaagtccgtca60gagctcaaccctccaacgaggattcctgaatactcgaaagtcagtgtgcagttactaaca120acagctgctcgacctcggggtctcgaacaatccatacctgctatcgctgccttcagacat180acggatgggctaggaggcaagagctacctgtctcaacgaactatcggagtgggacccgat240gaagctgtcagcgccacttccggcggtaaggctttaaaacgcgcccgccggttatcacgc300gcggggagcacagcgcggactgacgtgctgggaagcaccggttaaggatc350<210>48<211>470<212>dna<213>人工序列<220><223>體內對照核酸(internalcontrolnucleicacid)<400>48cgactctagaaactgggtagtaactgcgggggcgaatgatgcaggcttcagaaattaaac60tcaatagtatccggtgtctcaatctttttcgggccaggcggcggtggacgacagacaatt120ttacgattttggttccggtcacaaccgcgccatacatgtcaagaatgaagtgggcgaacg180ctagaaaactgacgccagcaattaagtgagtcggggcgtggtgactcccacgtaaaaagc240ccctaccccgcaccgttacgaagtatcaaaacgggacgcgcacgaaccgacgattggtac300tgtataagcggcccgacgaactcaaaatcccaagtgaatctatgaaatctacatcgcgtt360tataatctacggggtgtaaacggatgagaattggccaaacggaggcacacacgcgtgcaa420tgcgccgaccctgagaaaagtatcatgtgcgtcggccacaggatccccgg470<210>49<211>350<212>dna<213>人工序列<220><223>體內對照核酸(internalcontrolnucleicacid)<400>49cgactctagatgaagggagccttagaacggggctgcgctagctggcatcaaagtccgtca60gagctcaaccctccaacgaggattcctgaatactcgaaagtcagtgtgcagttactaaca120acagctgctcgacctcggggtctcgaacaatccatacctgctatcgctgccttcagacat180acggatgggctaggaggcaagagctacctgtctcaacgaactatcggagtgggacccgat240gaagctgtcagcgccacttccggcggtaaggctttaaaacgcgcccgccggttatcacgc300gcggggagcacagcgcggactgacgtgctgggaagcaccggttaaggatc350<210>50<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物/探針<400>50acaaccgcgccatacatgtcaagaa25<210>51<211>24<212>dna<213>人工序列<220><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