可編碼ArtRD蛋白基因及其蛋白和應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及可編碼ArtRD蛋白基因及其蛋白和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)泛指長度大于200nt，不能翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)的一類轉(zhuǎn)錄本。與編碼蛋白質(zhì)的mRNA相比，lncRNA種類更多，組織表達(dá)特異性更強(qiáng)，表達(dá)豐度較低，物種間的保守性也較差。lncRNA雖不能翻譯合成蛋白質(zhì)，但仍具有強(qiáng)大的基因調(diào)控能力，能夠通過對編碼蛋白質(zhì)的RNA的調(diào)控，參與到生物發(fā)育、疾病發(fā)生等諸多環(huán)節(jié)當(dāng)中。事實(shí)上，lncRNA與能夠編碼蛋白質(zhì)的mRNA具有眾多相似之處：他們的轉(zhuǎn)錄均依賴于RNA聚合酶II，且都需要經(jīng)歷剪接、加帽、加尾等轉(zhuǎn)錄后修飾，部分lncRNA也能夠與細(xì)胞核糖體結(jié)合，這些特征都提示部分lncRNA可能具有潛在編碼蛋白質(zhì)的能力。由于目前l(fā)ncRNA的發(fā)現(xiàn)多依賴于高通量測序(RNA-seq)，而其注釋主要依靠生物信息學(xué)工具，正因如此，許多隱藏在lncRNA序列中的較短的開放閱讀框(open reading frame,ORF)被忽視掉了。前期已有部分研究，報(bào)道了在線蟲和果蠅等低等生物中發(fā)現(xiàn)從lncRNA中合成的短肽，而在哺乳動物中，也相繼發(fā)現(xiàn)了三種從注釋為lncRNA的轉(zhuǎn)錄本中編碼出的短肽，參與骨骼肌收縮及損傷后修復(fù)等重要生物學(xué)功能。然而，以上報(bào)道均是在研究lncRNA時偶然的發(fā)現(xiàn)，并沒有形成一套固定的研究方法，相信還會有更多的潛藏在lncRNA中的具有重要功能的蛋白質(zhì)被發(fā)掘。

分布在血管壁中層的血管平滑肌細(xì)胞，與血管功能關(guān)系密切，生理狀態(tài)下血管平滑肌細(xì)胞的增殖能力和分泌活性都很低；然而在受到胞外不良因素刺激后，平滑肌細(xì)胞會發(fā)生去分化，失去成熟平滑肌細(xì)胞的功能和分化標(biāo)志，而增殖和遷移能力顯著增強(qiáng)。血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換是動脈粥樣硬化、高血壓的血管重構(gòu)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，尋找到調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的因素，有助于更好地理解心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為尋找新的治療策略提供線索，這也是多年來全球科學(xué)家共同努力攻克的命題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于(1)提供一種可編碼ArtRD蛋白基因；(2)基因序列如SEQ ID NO：4所編碼的ArtRD蛋白；(3)由ArtRD蛋白制備出抗體；(4)ArtRD蛋白作為靶點(diǎn)在生物學(xué)上檢測、標(biāo)志物中或在平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化試劑中的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種可編碼ArtRD蛋白基因，其所述基因序列如SEQ ID NO：4所示。

由基因序列SEQ ID NO：4編碼的ArtRD蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

包含ArtRD蛋白的融合蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

包含ArtRD蛋白的融合蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

一種重組蛋白載體，由空載體和插入該空載體的ArtRD蛋白基因組成。

進(jìn)一步，空載體為PGEX-4t-1或pcDNA3.1(+)。

由基因序列SEQ ID NO：4編碼的ArtRD蛋白作為抗原制備得到的抗體。

進(jìn)一步，所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。

檢測ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的試劑在制備檢測高血壓試劑盒中的應(yīng)用。

檢測ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的試劑在制備檢測血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化試劑盒中的應(yīng)用。

ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的抑制劑在制備降低血管平滑肌增殖遷移試劑中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述抑制劑為含有干擾序列如SEQ ID NO：14所示的shRNA慢病毒載體。

本發(fā)明的有益效果在于：從lncRNA中研究出可編碼為ArtRD蛋白的基因，并克隆出的一種血管組織表達(dá)特異性的ArtRD蛋白，識別其生物學(xué)功能，ArtRD蛋白能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，參與高血壓及血管重塑等病理過程的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明SEQ ID NO：4所示可編碼ArtRD蛋白基因，及其可表達(dá)的ArtRD蛋白對進(jìn)一步研究血管平滑肌細(xì)胞病理生理功能、血管重構(gòu)相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展提供基礎(chǔ)。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明：

圖1為ArtRD原核表達(dá)SDS-PAGE鑒定；

圖2為ArtRD原核表達(dá)純化蛋白SDS-PAGE鑒定

圖3為ArtRD純化后特異性抗體SDS-PAGE鑒定；

圖4為ArtRD在大鼠不同組織中的表達(dá)情況；

圖5為FLAG-ArtRD過表達(dá)于HEK293a細(xì)胞，IP及WB檢測；

圖6為慢病毒shRNA干擾ArtRD表達(dá)后，VSMC分化標(biāo)記蛋白改變情況；

圖7為FLAG-ArtRD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VSMC后，VSMC分化標(biāo)記蛋白改變情況；

圖8為FLAG-ArtRD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VSMC后，ArtRD與FLAG表達(dá)及共定位情況。

其中：圖1泳道M：蛋白分子量標(biāo)志

泳道1：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；

泳道2：0.5mM IPTG誘導(dǎo)后；

泳道3：37℃0.5mM IPTG誘導(dǎo)后上清液；

泳道4：37℃0.5mM IPTG誘導(dǎo)后沉淀；

圖2：泳道M：蛋白分子量標(biāo)志；

泳道1：未經(jīng)GST親和層析柱純化蛋白溶液；

泳道2：GST親和層析柱通過蛋白溶液；

泳道3：GST親和層析柱洗脫液。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

部分材料如下：

1.載體和感受態(tài)細(xì)胞：

PGEX-4t-1質(zhì)粒(鐘鼎生物保存)，pcDNA3.1(+)質(zhì)粒(Invitrogen)，TOP10菌株(鐘鼎生物保存)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN)。

2.分子生物學(xué)試劑與培養(yǎng)基：

限制性內(nèi)切酶及T4連接酶(NEB)，PCR相關(guān)試劑(TAKARA)，WB所用抗體均購自Abcam公司，WB SDS-PAGE配置試劑盒購自碧云天公司，RASAL2-AS1shRNA由漢恒生物合成，anti-FLAG M2beads購自Sigma公司，DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司。

3.細(xì)胞：

大鼠VSMC A10細(xì)胞系、HEK293a細(xì)胞系均由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院心血管病實(shí)驗(yàn)室保種。

4.實(shí)驗(yàn)動物：

新西蘭白兔(雄性，2-2.5kg)購自南京模式動物研究所。

實(shí)施例一、ArtRD的發(fā)現(xiàn)

通過長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)芯片檢測，比較了自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)與正常血壓大鼠(WKY)主動脈組織中差異性表達(dá)的lncRNA。在差異性表達(dá)的lncRNA中，關(guān)注到了一條在Refseq數(shù)據(jù)庫中注釋為lncRNA的轉(zhuǎn)錄本NR_027983，由于其位于RASAL2基因反義鏈上，將其命名為lncRNA RASAL2-AS1(RASAL2antisense1)，如序列SEQ ID NO：1所示。lncRNA RASAL2-AS1在高血壓大鼠的主動脈組織中高表達(dá)，并且特異性分布于血管組織中，在人的轉(zhuǎn)錄本NR_027982human RASAL2-AS1(如序列SEQ ID NO：2所示)和小鼠轉(zhuǎn)錄本NR_027984mouse RASAL2-AS(如序列SEQ ID NO：3所示)的基因組中具有同源序列，上述序列在數(shù)據(jù)庫中均注釋為lncRNA。

數(shù)據(jù)庫對于lncRNA的注釋基于生物信息學(xué)分析，但并未通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其實(shí)際能否編碼。使用NCBI ORF Finder在線工具分析lncRNA RASAL2-AS1的編碼潛能時，意外地發(fā)現(xiàn)其外顯子中包含了一段長為354bp的開放閱讀框(ORF)，提示其可能編碼蛋白質(zhì)，如序列表SEQ ID NO：4所示。

實(shí)施例二、ArtRD表達(dá)載體的制備與原核表達(dá)：

(1)ArtRD原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)檢測：

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因ArtRD，引物序列如下：

F：CCGGAATTCATGGGAAAGGCGCTTCCCTTTCT，如SEQ ID NO：10所示；

R：GATGCGGCCGCCTAGGTCTGATCTTGGACAG，如SEQ ID NO：11所示。

1)雙酶切連接至PGEX-4t-1載體的EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)之間以獲得重組質(zhì)粒PGEX-4t-1-ArtRD，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入TOP10克隆菌株，挑取陽性克隆子測序，選取測序完全正確的單克隆，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ArtRD基因序列見序列SEQ ID NO：6。

2)通過重組質(zhì)粒PGEX-4t-1-ArtRD表達(dá)出的蛋白含有GST-tag，蛋白大小理論分子量為39.63kDa，氨基酸序列見SEQ ID NO：7。

3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒1μl加入100μl感受態(tài)細(xì)菌中，置冰上20min，42℃熱激90sec，迅速置冰中5min，加入600μl LB培養(yǎng)液，37℃，220rpm振搖1h，離心后全部涂布于含50μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

4)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)pGEX-4T-1-ArtRD載體融合蛋白的表達(dá)：挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于含50μg/ml AMP的3ml LB培養(yǎng)液的試管中，37℃220rpm振搖過夜，次日按體積比1:100接種于50μg/ml AMP的30ml LB培養(yǎng)液中，37℃220rpm振搖至菌體OD600為0.6-0.8(約2h)；取出1ml培養(yǎng)物，10000g室溫離心2min，棄上清，用100μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5mM，37℃220rpm振搖4h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；取出1ml培養(yǎng)物，10000g室溫離心2min，棄上清，用100μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。剩余培養(yǎng)物4000g，離心10min，棄上清，用PBS重懸菌體沉淀；重懸液進(jìn)行超聲波破碎后，分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸。進(jìn)行12％SDS-PAGE檢測分析，目標(biāo)蛋白主要存在于沉淀中，考馬斯亮藍(lán)染色顯帶，結(jié)果見附圖1所示。

5)包涵體蛋白的變復(fù)性：將菌體沉淀重懸于20ml lysis buffer(20mM Tris-HCl contain 1mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail,pH 8.0)，超聲破碎(功率400W，工作4sec，間歇8sec，共20min)；將超聲破碎的細(xì)胞裂解液4℃10000g離心20min，收集沉淀；使用包涵體洗滌液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗滌包涵體3次；用溶解緩沖液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素pH8.0)溶解包涵體，4度放置過夜；18～25℃，15000rpm離心15min；將上述溶液滴加20mM Tris-HCl 100mM NaCl pH8.0緩沖液中，逐步成倍梯度稀釋緩慢攪拌，將蛋白溶液裝入透析袋于20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.0溶液中透析過夜。

6)融合蛋白的GST柱親和純化及結(jié)果分析：利用低壓層析系統(tǒng)，包涵體復(fù)性溶液以0.5ml/min流速上樣至GST Binding-Buffer預(yù)平衡的GST親和層析柱；用GST Binding-Buffer以0.5ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達(dá)基線；用GST Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，50m MGSH，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0進(jìn)行透析過夜；進(jìn)行12％SDS-PAGE分析，結(jié)果見附圖2所示。

(2)ArtRD真核表達(dá)載體構(gòu)建：

1)采用基于逆轉(zhuǎn)錄PCR方法合成FLAG-ArtRD基因序列：使用TAKARA RNAiso試劑從大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞提取總RNA，使用TAKARA一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA文庫。設(shè)計(jì)FLAG-ArtRD擴(kuò)增特異性引物，引入EcoR I及Xba I雙酶切位點(diǎn)，上游引物：5’-CCGGAATTCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAAAGGCGCTTCCCTTTCTTC-3’(引入FLAG-tag，及EcoR I酶切位點(diǎn))如序列SEQ ID NO：12所示；下游引物：5’-CGTCTAGACTAGGTCTGATCTTGGACAGCTGGTGCACCGGT-3’(引入Xba I酶切位點(diǎn))，如序列SEQ ID NO：13所示。使用TAKARA PrimeSTAR Max Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PcDNA3.1(+)-FLAG-ArtRD插入片斷序列如序列SEQ ID NO：8所示；翻譯編碼的FLAG-ArtRD融合蛋白序列如SEQ ID NO：9所示。

2)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit切膠回收，限制性內(nèi)切酶雙酶切后，使用QIA quick PCR Purification Kit進(jìn)行DNA純化，再將純化后的目的DNA片段使用NEB Quick Ligation Kit連接入真核表達(dá)pcDNA3.1(+)載體，再轉(zhuǎn)化DH5-α感受態(tài)細(xì)胞，鋪LB平板37°過夜。

3)挑取單克隆，搖菌培養(yǎng)，測序，質(zhì)粒鑒定無誤后保存并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例三、ArtRD特異性抗體的制備

1免疫動物：以實(shí)施案例一種原核表達(dá)出的ArtRD蛋白進(jìn)行BCA蛋白濃度測定后，免疫2只新西蘭白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400ug/次，2-3周免疫一次，免疫4次。采血檢測，通過間接ELISA方法確定抗血清針對ArtRD蛋白的效價(jià)，待效價(jià)大于1:50,000進(jìn)行最終采血制備抗血清，并準(zhǔn)備純化。

2抗血清(抗體)效價(jià)檢測：

1)抗血清間接ELISA效價(jià)檢測：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)好包被板，并在板條上做上標(biāo)記；包被：用PBS包被液將ArtRD蛋白、GST蛋白抗原稀釋成需要的濃度，混勻后加入板條中，每孔100ul，4℃冰箱過夜。包被抗原：ArtRD蛋白、GST蛋白包被濃度：5ug/ml,100ul/孔包被緩沖液：磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)；封閉：包被好后，棄去包被液，洗板3次，每孔加入200ul封閉液，37℃恒溫箱1h。取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，洗板1次；一抗反應(yīng)：抗血清按1/500，3倍稀釋，每孔100ul，37℃恒溫箱1h；二抗反應(yīng)：取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，洗板3次，向每孔中加入100ul稀釋好的酶標(biāo)二抗，酶標(biāo)二抗：羊抗兔-HRP，1/5000。37℃恒溫箱1小時。顯色取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，洗板4次，每孔先加入100ul TMB顯色液，根據(jù)顏色的深淺決定顯色時間，一般37℃，15min。終止反應(yīng)每孔加入100ul 1M HCL溶液，終止反應(yīng)。即刻在酶標(biāo)儀上450nm讀數(shù)，將OD值大于設(shè)定的陰性對照OD值的2.1倍的孔對應(yīng)的稀釋度，定為該樣品的效價(jià)。

2)抗體效價(jià)檢測結(jié)果：

包被抗原：ArtRD蛋白、GST蛋白

包被濃度：5ug/ml，100ul/孔

包被緩沖液：磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)

二抗：羊抗兔-HRP，1/5000

抗血清效價(jià)大于121K。

3抗體純化：

將ArtRD蛋白與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱，將兔子抗血清與PBS等量混合后緩慢上樣，待抗體結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，即得到所需純化抗體，立即在PBS中進(jìn)行4℃透析過夜，再進(jìn)行純度，濃度和效價(jià)測定。然后將GST蛋白與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱，用上步所得洗脫液(即所需純化抗體)緩慢上樣，收集流出液，即最終得到的純化ArtRD抗體，再進(jìn)行相關(guān)純度、濃度和效價(jià)測定。

4抗體鑒定：

1)通過ELISA檢測上步中經(jīng)過GST蛋白與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱最終得到的純化ArtRD抗體的效價(jià)，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒對所得抗體進(jìn)行濃度測定；通過SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色觀察純化抗體的純度。最終得到純化抗體效價(jià)大于512K。

2)抗體濃度鑒定：0.2mg/ml緩沖液：磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)

3)抗體純度鑒定：純化后抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。電泳條帶見附圖3。

上述ArtRD原核表達(dá)及特異性抗體合成委托南京鐘鼎生物有限公司實(shí)施。

實(shí)施例四、ArtRD表達(dá)水平的鑒定。

在獲得ArtRD特異性抗體后，能夠使用該抗體進(jìn)行自然狀態(tài)下ArtRD蛋白的檢測。使用Thermo Fisher T-PER組織蛋白提取試劑提取了大鼠多種組織的蛋白，并通過蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(WB)檢測該段蛋白質(zhì)天然表達(dá)情況及組織分布情況，結(jié)果見附圖4。依據(jù)WB結(jié)果可知，ArtRD分子量為12.9kDa，且特異性分布于血管組織，據(jù)此，將其命名為Arteridin，縮寫為ArtRD。

在檢測了自然狀態(tài)下ArtRD表達(dá)水平后，使用上述構(gòu)建的FLAG-ArtRD過表達(dá)質(zhì)粒，利用QIAGEN Attractene轉(zhuǎn)染試劑將過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293a工具細(xì)胞中，經(jīng)過48小時表達(dá)，提取蛋白質(zhì)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。提取出的蛋白質(zhì)一部分直接使用ArtRD特異性抗體進(jìn)行WB檢測；另一部分使用Sigma anti-FLAG M2beads進(jìn)行免疫沉淀(IP)，再將IP后的蛋白使用ArtRD特異性抗體進(jìn)行WB檢測，結(jié)果見附圖5。結(jié)果表明，F(xiàn)LAG-ArtRD過表達(dá)載體成功表達(dá)于HEK293a細(xì)胞。

同時，將FLAG-ArtRD過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞，經(jīng)過48小時表達(dá)，將細(xì)胞固定，再分別使用小鼠來源的抗FLAG抗體及抗ArtRD特異性抗體進(jìn)行免疫熒光染色，二抗使用不同顏色熒光標(biāo)記。經(jīng)過共聚焦顯微鏡觀察，可見FLAG蛋白與ArtRD蛋白共定位，成功過表達(dá)于大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞中，結(jié)果見附圖8。

以上實(shí)驗(yàn)證明ArtRD在自然狀態(tài)下特異性表達(dá)于血管組織，F(xiàn)LAG-ArtRD過表達(dá)質(zhì)粒能夠成功克隆ArtRD，使之過表達(dá)于哺乳細(xì)胞中。

實(shí)施例五、ArtRD蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能

針對lncRNA RASAL2-AS1序列設(shè)計(jì)了多條探針(委托廣州銳博生物有限公司)，使用RNA熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，發(fā)現(xiàn)lncRNA RASAL2-AS1特異性分布于血管組織中層，即血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)層。同時使用ArtRD特異性抗體，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)ArtRD蛋白特異性分布于血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中，提示其功能在于調(diào)控VSMC功能。

使用Q-PCR，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相較于正常血壓大鼠(WKY)，lncRNA RASAL2-AS1在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)胸主動脈組織中顯著高表達(dá)，其表達(dá)的差異性出現(xiàn)于高血壓穩(wěn)定后，提示其功能在于加重高血壓后的血管重構(gòu)。因血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換是動脈粥樣硬化、高血壓的血管重構(gòu)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，所以表明ArtRD蛋白對于VSMC表型轉(zhuǎn)換中的作用。首先，使用RASAL2-AS1shRNA慢病毒，shRNA序列：GTGGCAAGACCAAGATAATGT，如SEQ ID NO：14所示，敲降了VSMC中RASAL2-AS1，VSMC分化標(biāo)記蛋白(α-SMA，Calpinin)表達(dá)量顯著上升，參見附圖6，另外，VSMC的增殖遷移能力也顯著下降；同時，使用FLAG-ArtRD過表達(dá)質(zhì)粒在VSMC中過表達(dá)ArtRD，附圖7表示VSMC分化標(biāo)記蛋白表達(dá)量顯著上升。

綜上，表明ArtRD促進(jìn)了VSMC由收縮型向分泌型表型轉(zhuǎn)換，加重血管重構(gòu)，能夠成為潛在的檢測、治療靶點(diǎn)。

最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院

<120> 可編碼ArtRD蛋白基因及其蛋白和應(yīng)用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 890

<212> DNA

<213> 大鼠(Rattus norvegicus)

<223> NR_027983 rat RASAL2-AS1

<400> 1

gaggaggaac tgccgccgaa gacagcaaaa atcgggcacc gaaatactca tcgggccagg 60

cccgcctact ttcctaagac tgtccggctc ggaccgcctc tcggtgcggg atcttcgagc 120

tgctggtgga agctgagacg gtgtggggag gcggagagaa aagggggtgc gggaaattta 180

aaaagatggg aaaggcgctt ccctttcttc ttagcccctt ccctgttgat ttctggacca 240

atgcttcttt cttgaacgaa gagcatgaag acgctgcttt atctaacagt caccttggag 300

gaaacgccat cgttcttcca gaagggagat ctggcccccg gtcttggatt ctgagatcag 360

tgcgagatcc cggctctgcg ccctgtccgc cctggaactg gatttatcat cagtttagaa 420

tagcatggct acgatgtgtg gtgtggatgg atggacgagc cccgcaagtg caaacaggac 480

agtccaggtt acctgacaaa gcagccaccg gtgcaccagc tgtccaagat cagacctagg 540

tcaatcactg acatggctaa aagcaccaag aaggtctgga tcattgtgct gcctcactcc 600

aaaaaatggt gacaaaaatt aaaatcaacc agcacgccag gatcctctgt ggcaagacca 660

agataatgtg ggccactgtc atctggcact gtggttcctt catgacaaca atggctggtg 720

ggtcctgggt ttactacacc acttctgctg tcagtcaaac tagccatcag gagactgaag 780

gaaatgaaag accatagaag tgctactgtc tgagcagccc tggcctccag taaatgagtc 840

attcctatga caaaattata ataaaaagtg ttggttgagt aacccttctg 890

<210> 2

<211> 2329

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<223> NR_027982 human RASAL2-AS1

<400> 2

gcctgaggag gggtaggggg cggtggcccc gggttctagc ccgcctgtcc tcggccccca 60

cttctggaat gagcctgccc gccccctgac tctcaggcca cagctccggc cacagctctg 120

gctcctgctc cgcggcggat cccacaaacc cggcagccac ggcggtggcg gtggcggtgg 180

cggtggcggt ggcggcggcg gcggcggcgg cagcggcagg cggcatccca gggtgatagg 240

ctgaagcaat cgagggccga gagcccggcc gcgtgtgcac tcgagtaacg aagccgggga 300

gggactgcgc cgcaggcagg aaaagtcgga caccgaatta ttcatccggc ctgtcccgcc 360

tactttccaa gtaccctccc agggatagcc gggtattgag cggtccgggt ctctgctgct 420

caaaagatcg aagaagctgc tttatcttac agtcacccaa gggggagcgc cttcttcctt 480

cccagagtgg agtggcagtg ggtccgggat tctgggatat gcacagggtc tgcgccctgc 540

gccctgtccg cgctgaagct gaacttgtca ttggtttgca acagcatggt gaagaagtgt 600

ggtgtggatg gacggacggg cctctcaggc acatgaaata ctcaaagccc agtattaacc 660

aaacatgttt ctctgttttg tctttgatct ttgtgcagtg tgttggcttt tttcctttaa 720

tgatgtcact tgtattttat ttttggttta tttgtagact gtctccctcc ttggccatgg 780

ctttactttt atgtccaccc aaggagagtt tcaccagttt aggtttaaga aattactgac 840

aagttaacaa taataatttc aaaattgaac agtaataact taaaccgtgc cttggacata 900

gtagatctcc aacagttttt cttgaatgtg gctacctaat gtggaacaag atttttcata 960

attacatgtt gctattttta ataccttttg ggaggttctt tagtcccccc cgccctttct 1020

ccctacgttg cacaaagaga ctggtctaca aggggtcctg ttagttttct ggttttgtgg 1080

ggtcctggaa tattgtttgg gcttattgag agttaacaag gatgtatttt gtgagtttct 1140

ccaaagtctt atttagagta atagtatttc aaagcaagaa gtgttttaga gagaacatca 1200

ttctgcctct tgtttaacag gtgaggaaac tgaggaaaaa ccagcttacc tggctaatca 1260

accacaagta cagatagttc cacaatgact caatggatat tacttcaact ttgttccctc 1320

aagaaacttt tgtgattaag cttgttgatt tgtggcttga tggtttacag gaatggtcat 1380

ttttaatatc taggaccctg cttgcttgct tgcttgcttg cttactagac tggctgcata 1440

gtcagtcttc cacgtgtaaa caacagtgtg tgctttagtg gataagagat gttgagtgct 1500

gagatttcaa ggctcagcac tgagtagacc tagagcattt ttatttatac taaattaatg 1560

ccatggtaac ataagttaga cagcaagtga atatggcatc aaatgtacaa agttgagtat 1620

ctctttacta gtcaatgtat aaggaattta tttacccaag caattatctt aaaaacagca 1680

ttacaagtgg tatgcgaaac atttccagaa tttatttcca catctgctct ttcagtggca 1740

tcatccattc ctgagctcaa gaaaaggcct ctgccaaccg ccagtaatcc tgctttttta 1800

gtaatcctac tatttttttt ttaactttaa gttctgggat acatgtgcag aacatgcagg 1860

tttgttacat aggtatacat gtgcctatgt atacctatgt aacatggtgg ttacagtaaa 1920

catggtggtt tactgcatct atcaacccgt catctaggtt ttaagccctg cattcattag 1980

atatttgtcc taatgctctc cctccccttt cccccacgcc ccgacaggcc ccagtatgtg 2040

atattaccct ccctgtgtcc atgtgttctc atcgttcaac tcccacttat aagtgagaat 2100

atgcagagtt tggttttctg ttgtgttact ttgcttagaa tgatggctcc cagcttcatc 2160

catgtccctg caaatgacat gaactcattc ttttttatgg ctgcatagta ttccatggtg 2220

tatatgtgcc acattgtctt tatccagtct atcatcgatg gcatttgggt tggttccaag 2280

tctttgctat tgtaaatagc actgcaataa acatacatgt gcatgtgtc 2329

<210> 3

<211> 1194

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<223> NR_027984 mouse RASAL2-AS1

<400> 3

cggctcccgc cgccgtcgcc tcgggggctc aaagcgccgg ctccctcagc ctgaggggcg 60

cgccccggcc cagcttctgt ccgcctggcg tcggcttgct cccgcggaac gcgcaggccg 120

gcccgctaac tctcaggccg ccgctccggc cgctgcttgg gctcctccgg ctcgcgctcc 180

tctgagaaac ccacaagccc ggcagccgcg gcgctggcgg cggcggcagg cggcatccca 240

gggtgatagg ccgaagcaat cgagtgccga gctcacggcc gcgtgtgcaa tccagtaacc 300

gagcggagga ggaactgccg ccgaagacag caaaaatcgg gcaccgaaat actcagcggg 360

ccaggcccgc ctactttcct aagactatcc tgctccgacc gcctctcggt gcggggatcc 420

tcgagctgct ggtggaagca gagacggtgt tggggaggcg gagagaaaac ggggtgcggg 480

aaatttaaaa agatgggaaa ggcgcttccc ttttatctta gcccctatcc tgttgatttc 540

tggaccaatg cttctttctc ggacgaagaa catgaagacg ctgctttatc taacagtcac 600

ctcggaagaa acgccatggt tcctccacaa gggagatctg gccccgcgtc ttggatcctg 660

agatctgtgc gagatcccgg ctttgcgccc tgtccgccct ggagctggat ttatcatcag 720

tttagaatag catggctacg atgtgtggtg cggatggatg gacgagcccc gcaagtgcag 780

acaggacagt ccacatcacc tgccaaagca gccagcaatg caacagctct ccaagatcag 840

gcctaggtgg atcactgacc tggctaaaag taccaagaag gcctggatca ttgtggtgcc 900

tctctccaga aaatggtgac aaaaattgaa atcaaccagc acatcaggat cctctgtggc 960

aagaccaaga taataatggg ggacactgtc atctggcact gtggttcctt cacgacaaca 1020

gtggctggtg ggtcctagat ttacaacatc acttctgctg tcacagtcaa accggccatc 1080

aggagactga aggaaattaa agaccagtag aagtgctact gtttgagcag ccctggcctg 1140

caataaatga gttcattcct atgaaaggtt gtaataaagt gttggttgag taac 1194

<210> 4

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ArtRD DNA序列

<400> 4

atgggaaagg cgcttccctt tcttcttagc cccttccctg ttgatttctg gaccaatgct 60

tctttcttga acgaagagca tgaagacgct gctttatcta acagtcacct tggaggaaac 120

gccatcgttc ttccagaagg gagatctggc ccccggtctt ggattctgag atcagtgcga 180

gatcccggct ctgcgccctg tccgccctgg aactggattt atcatcagtt tagaatagca 240

tggctacgat gtgtggtgtg gatggatgga cgagccccgc aagtgcaaac aggacagtcc 300

aggttacctg acaaagcagc caccggtgca ccagctgtcc aagatcagac ctag 354

<210> 5

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> ArtRD 氨基酸序列

<400> 5

Met Gly Lys Ala Leu Pro Phe Leu Leu Ser Pro Phe Pro Val Asp Phe

1 5 10 15

Trp Thr Asn Ala Ser Phe Leu Asn Glu Glu His Glu Asp Ala Ala Leu

20 25 30

Ser Asn Ser His Leu Gly Gly Asn Ala Ile Val Leu Pro Glu Gly Arg

35 40 45

Ser Gly Pro Arg Ser Trp Ile Leu Arg Ser Val Arg Asp Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Pro Cys Pro Pro Trp Asn Trp Ile Tyr His Gln Phe Arg Ile Ala

65 70 75 80

Trp Leu Arg Cys Val Val Trp Met Asp Gly Arg Ala Pro Gln Val Gln

85 90 95

Thr Gly Gln Ser Arg Leu Pro Asp Lys Ala Ala Thr Gly Ala Pro Ala

100 105 110

Val Gln Asp Gln Thr

115

<210> 6

<211> 721

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pGEX-4T-1- ArtRD插入片段序列

<400> 6

tgattttctt agcaagctac ctgaaatgct gaaaatgttc gaagatcgtt tatgtcataa 60

aacatattta aatggtgatc atgtaaccca tcctgacttc atgttgtatg acgctcttga 120

tgttgtttta tacatggacc caatgtgcct ggatgcgttc ccaaaattag tttgttttaa 180

aaaacgtatt gaagctatcc cacaaattga taagtacttg aaatccagca agtatatagc 240

atggcctttg cagggctggc aagccacgtt tggtggtggc gaccatcctc caaaatcgga 300

tctggttccg cgtggatccc cggaattcat gggaaaggcg cttccctttc ttcttagccc 360

cttccctgtt gatttctgga ccaatgcttc tttcttgaac gaagagcatg aagacgctgc 420

tttatctaac agtcaccttg gaggaaacgc catcgttctt ccagaaggga gatctggccc 480

ccggtcttgg attctgagat cagtgcgaga tcccggctct gcgccctgtc cgccctggaa 540

ctggatttat catcagttta gaatagcatg gctacgatgt gtggtgtgga tggatggacg 600

agccccgcaa gtgcaaacag gacagtccag gttacctgac aaagcagcca ccggtgcacc 660

agctgtccaa gatcagacct aggcggccgc atcgtgactg actgacgatc tgcctcgcgc 720

g 721

<210> 7

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> GST-ArtRD氨基酸序列

<400> 7

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

210 215 220

Gly Ser Pro Glu Phe Met Gly Lys Ala Leu Pro Phe Leu Leu Ser Pro

225 230 235 240

Phe Pro Val Asp Phe Trp Thr Asn Ala Ser Phe Leu Asn Glu Glu His

245 250 255

Glu Asp Ala Ala Leu Ser Asn Ser His Leu Gly Gly Asn Ala Ile Val

260 265 270

Leu Pro Glu Gly Arg Ser Gly Pro Arg Ser Trp Ile Leu Arg Ser Val

275 280 285

Arg Asp Pro Gly Ser Ala Pro Cys Pro Pro Trp Asn Trp Ile Tyr His

290 295 300

Gln Phe Arg Ile Ala Trp Leu Arg Cys Val Val Trp Met Asp Gly Arg

305 310 315 320

Ala Pro Gln Val Gln Thr Gly Gln Ser Arg Leu Pro Asp Lys Ala Ala

325 330 335

Thr Gly Ala Pro Ala Val Gln Asp Gln Thr

340 345

<210> 8

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pcDNA3.1(+)-FLAG-ArtRD 插入片斷序列

<400> 8

atggattaca aggatgacga cgataaggga aaggcgcttc cctttcttct tagccccttc 60

cctgttgatt tctggaccaa tgcttctttc ttgaacgaag agcatgaaga cgctgcttta 120

tctaacagtc accttggagg aaacgccatc gttcttccag aagggagatc tggcccccgg 180

tcttggattc tgagatcagt gcgagatccc ggctctgcgc cctgtccgcc ctggaactgg 240

atttatcatc agtttagaat agcatggcta cgatgtgtgg tgtggatgga tggacgagcc 300

ccgcaagtgc aaacaggaca gtccaggtta cctgacaaag cagccaccgg tgcaccagct 360

gtccaagatc agacctag 378

<210> 9

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> FLAG-ArtRD氨基酸序列

<400> 9

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Lys Ala Leu Pro Phe Leu

1 5 10 15

Leu Ser Pro Phe Pro Val Asp Phe Trp Thr Asn Ala Ser Phe Leu Asn

20 25 30

Glu Glu His Glu Asp Ala Ala Leu Ser Asn Ser His Leu Gly Gly Asn

35 40 45

Ala Ile Val Leu Pro Glu Gly Arg Ser Gly Pro Arg Ser Trp Ile Leu

50 55 60

Arg Ser Val Arg Asp Pro Gly Ser Ala Pro Cys Pro Pro Trp Asn Trp

65 70 75 80

Ile Tyr His Gln Phe Arg Ile Ala Trp Leu Arg Cys Val Val Trp Met

85 90 95

Asp Gly Arg Ala Pro Gln Val Gln Thr Gly Gln Ser Arg Leu Pro Asp

100 105 110

Lys Ala Ala Thr Gly Ala Pro Ala Val Gln Asp Gln Thr

115 120 125

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ArtRD原核表達(dá)合成基因 ArtRD上游引物序列 F

<400> 10

ccggaattca tgggaaaggc gcttcccttt ct 32

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ArtRD原核表達(dá)合成基因 ArtRD上游引物序列 R

<400> 11

gatgcggccg cctaggtctg atcttggaca g 31

<210> 12

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ArtRD原核表達(dá)合成基因 ArtRD上游引物序列 F

<400> 12

ccggaattca tggattacaa ggatgacgac gataagggaa aggcgcttcc ctttcttc 58

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ArtRD原核表達(dá)合成基因 ArtRD上游引物序列 R

<400> 13

cgtctagact aggtctgatc ttggacagct ggtgcaccgg t 41

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtggcaagac caagataatg t 21