一種花粉特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種從玉米中分離到的花粉特異性啟動(dòng)子序列及其應(yīng)用。從玉米基因組dna中克隆得到的上述花粉特異性啟動(dòng)子，并與不同的同源、異源基因連接構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主植物，使轉(zhuǎn)基因植株花粉特異表達(dá)其下游基因的方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)基因植物研究與開發(fā)的過程中發(fā)現(xiàn)，外源基因表達(dá)的時(shí)間，空間和表達(dá)量，往往是造成無法得到理想的轉(zhuǎn)基因植物和有效的研究基因作用機(jī)理的重要因素。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是植物基因表達(dá)調(diào)控的最重要的調(diào)控方式。啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性和特性直接決定了基因表達(dá)的時(shí)空特性以及表達(dá)量的多少。因此，對(duì)植物啟動(dòng)子的克隆和功能分析非常重要。

雜種優(yōu)勢(shì)作為一種提高作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)，提高作物抗蟲、抗病、抗逆的手段已被廣泛的應(yīng)用，并取得令人矚目的成就，以植物雄性不育為基礎(chǔ)的雜種優(yōu)勢(shì)利用已成為許多作物的育種目標(biāo)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮巨大的作用。但自然出現(xiàn)的雄性不育類型很少存在著周期長(zhǎng)，不育基因來源單一等問題，而且恢復(fù)系的培育和后代的篩選上也存在著一定的不足。而利用基因工程創(chuàng)造雄性不育的策略為雜種優(yōu)勢(shì)的利用克服了上述缺陷。主要利用花粉或花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在花粉中特異表達(dá)，獲得雄性不育植株。例如：mariani等利用煙草花藥絨氈層特異啟動(dòng)子ta29將核糖核酸基因?qū)霟煵?，結(jié)果核糖核酸酶特異表達(dá)能夠選擇性地破壞與花粉發(fā)育相關(guān)的一些器官或組織，阻斷花粉發(fā)育進(jìn)程，導(dǎo)致植物雄性不育[marianic,beuckeleermd,truettnerj,leemansjandrobertbg..inductionofmalesterilityinplantsbyachimaericribonucleasegene.nature1990.347:737-741]。paul等利用擬南芥花藥絨氈層特異性啟動(dòng)子a9特異表達(dá)核糖核酸酶基因同樣獲得了雄性不育煙草植株[paulw,hodger,smartts,draper,jandscoottr.theisolationandcharacterizationofthetapetum-specificarabidopsisthalianaa9gene.plantmol.biol.1992.19:611-622]。hird等將與抗病性相關(guān)的β-1,3葡聚糖酶基因分別與擬南芥花粉發(fā)育早期啟動(dòng)子a9,a3融合，轉(zhuǎn)化矮牽牛后獲得不同程度的雄性不育植株[hird,d.l.,worrall,w.,hodge,r.,smartt,s.,paul,w.,scott,r..theanther-specificproteinencodedbythebrassicanapusandarabidopsisthalianaa6genedisplayssimilaritytobeta1,3-glucanases.plantj.1993.4:1023-1033]。

目前對(duì)花粉特異基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控還知之甚少，花粉特異啟動(dòng)子的獲得有助于深入理解花粉發(fā)育。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一在于提供一種花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子序列，其來自于玉米基因組dna，在植物花粉中特異表達(dá)。

本發(fā)明的另一目的是提供一種驅(qū)動(dòng)同、異源基因在花粉中高效特異表達(dá)的新方法。

本發(fā)明通過利用花粉特異的cdna片段，篩選玉米基因組文庫(kù)，得到的核苷酸序列，稱之為pzm908，長(zhǎng)度為2126bp，為雙鏈核酸類型，其序列如seqidno.1所示。生物信息學(xué)分析pzm908序列，發(fā)現(xiàn)其具備花粉特異表達(dá)的相關(guān)順式元件。本發(fā)明提供了一種花粉特異性啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子的核苷酸序列包含如seqidno.1所示的核苷酸序列或其特異性片段。

本發(fā)明同時(shí)提供了含有上述啟動(dòng)子的生物材料。

優(yōu)選地，所述生物材料包含表達(dá)載體、細(xì)胞、細(xì)胞系、表達(dá)盒或工程菌。

本發(fā)明構(gòu)建了含有pzm908啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)外源基因的植物表達(dá)載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，表達(dá)盒是由pzm908啟動(dòng)子和gus(β-葡糖醛酸酶基因)報(bào)告基因及來自胭脂堿合成酶(nos)基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域構(gòu)成，選擇標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶ii(nptii)，所述的表達(dá)載體優(yōu)選的是重組質(zhì)粒pzm908::gus。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，將含有所述pzm908啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，獲得了gus基因在花粉中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的植物宿主細(xì)胞為植物花粉細(xì)胞。

本發(fā)明所述的花粉特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)基因在植物花粉中表達(dá)的方法，包括下述步驟：

(1)將含有上述核苷酸序列的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，

(2)使所述的植物細(xì)胞生長(zhǎng)成能夠結(jié)種子的成熟植物。

本發(fā)明同時(shí)提供了上述啟動(dòng)子或上述生物材料在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述啟動(dòng)子或上述生物材料在制備雄性不育的植物中的應(yīng)用。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述植物為煙草。

本發(fā)明還提供了上述啟動(dòng)子或上述生物材料在驅(qū)動(dòng)同、異源基因在植物花粉中高效特異表達(dá)的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述啟動(dòng)子或上述生物材料在植物種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

本發(fā)明中所述的其他外源基因是指任何一段核酸序列，并具有編碼某種蛋白質(zhì)功能，該序列與花粉特異性啟動(dòng)子正常情況不相結(jié)合。此核酸序列包括不同于啟動(dòng)子植物種類的異源核酸序列，以及從相同于啟動(dòng)子植物種類得到的同源核酸序列，但這些序列與野生型(非轉(zhuǎn)基因)植物的啟動(dòng)子無關(guān)。

本發(fā)明中所述的表達(dá)載體是指現(xiàn)有技術(shù)中已知的、能夠在植物中進(jìn)行表達(dá)的任何一種載體，如pbi121等。

本發(fā)明中所述的轉(zhuǎn)化技術(shù)是指已知的、能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)胫参锛?xì)胞或植物組織的任何一種植物轉(zhuǎn)化方法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等。

本發(fā)明中所述的宿主細(xì)胞或宿主組織及后代細(xì)胞是指所有植物細(xì)胞或植物組織或由這些細(xì)胞或組織發(fā)育成熟的整株植株(包括種子)。

術(shù)語(yǔ)“花粉特異性啟動(dòng)子”是指在啟動(dòng)子控制下表達(dá)的基因在有或沒有基本表達(dá)的植物花粉中優(yōu)先表達(dá)。

本發(fā)明找到了玉米花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子序列，并對(duì)這一啟動(dòng)子的花粉特異活性進(jìn)行了功能驗(yàn)證。將所述的啟動(dòng)子序列連接異源或同源基因后，轉(zhuǎn)化到植物中可使異源或同源基因在植物花粉中特異表達(dá)，避免了目的基因在其他部位持續(xù)表達(dá)所帶的不利影響。本發(fā)明提供了一種利用所述核苷酸序列驅(qū)動(dòng)目的基因在植物花粉中特異表達(dá)的新方法，在植物的遺傳改良，雄性不育的創(chuàng)造和轉(zhuǎn)基因生物安全性研究方面具有重大的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：由pzm908驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體構(gòu)建過程。

圖2：煙草的再生過程；

其中，a:抗性篩選及分化；b:抗性芽誘導(dǎo)生根；c:移栽在盆中的抗性植株；d:開花期的轉(zhuǎn)基因煙草

圖3：轉(zhuǎn)基因煙草分子檢測(cè)；

其中，1：pzm908::gus質(zhì)粒；5：marker(genstar)；6：wt；2-4和7-18：轉(zhuǎn)基因煙草。

圖4：pzm908及其不同截短片段::gus轉(zhuǎn)基因煙草不同組織的gus染色；

其中，a，pzm908各截短片段::gus轉(zhuǎn)基因煙草成熟花粉的gus染色結(jié)果；

b，pzm908各截短片段::gus轉(zhuǎn)基因6葉期煙草幼苗的gus染色結(jié)果；

c，pzm908各截短片段::gus轉(zhuǎn)基因煙草(6葉期幼苗)根的gus染色結(jié)果；

d，pzm908各截短片段::gus轉(zhuǎn)基因煙草未成熟種子的gus染色結(jié)果；

e，pzm908各截短片段::gus轉(zhuǎn)基因煙草花藥的gus染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實(shí)施例1玉米花粉特異性啟動(dòng)子序列pzm908的克隆

以從玉米成熟花粉cdna文庫(kù)中分離得到了花粉特異性表達(dá)的cdna克隆(682bp片段)，zm401(lietal.,2001)，為探針篩選玉米基因組文庫(kù)(cat.#fl1032d,lot#5443,clontech,paloalto,ca,usa)得到了zm908基因的基因組克隆pgzm908。

實(shí)施例2花粉特異性啟動(dòng)子序列pzm908的分離

設(shè)計(jì)并合成如下兩條引物，為以后分離和構(gòu)建的需要，在兩個(gè)引物的5’端分別加入了限制性內(nèi)切酶sphi位點(diǎn)和限制性內(nèi)切酶bamhi位點(diǎn)：

引物15'cgcgcatgcggtgtgcgtaatgactcga3'sphi

引物25'cgcggatccgaaacatatgaatagtac3'bamhi

以質(zhì)粒dnapgzm908為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：

擴(kuò)增條件：95℃10min；95℃1min、58℃1min、72℃2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min，擴(kuò)增得到2126bp的dna片段(seqidno.1)。用dna膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收，把回收片段亞克隆到測(cè)序載體pm19-t中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用cacl2法處理的大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素(終濃度100μg/ml)的lb固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜；挑取平板上生長(zhǎng)的白色菌落，接入含氨芐青霉素(終濃度100μg/ml)的lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，離心收集菌體按堿裂解法[sambroook,etal.,1989,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork,p19-21]提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶sphi和bamhi雙酶切和pcr擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性克隆，測(cè)序分析正確后，將陽(yáng)性克隆命名為p19t-pzm908。

實(shí)施例3植物表達(dá)載體pzm908::gus的構(gòu)建

用堿裂解法提取質(zhì)粒p19t-pzm908，經(jīng)過sphi酶切，klenow補(bǔ)平，再用bamhi酶切，得到pzm908啟動(dòng)子片段，與經(jīng)過hindⅲ酶切，klenow補(bǔ)平，再用bamhi酶切的植物表達(dá)載體pbi121的大片段相連(圖1)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用cacl2法處理的大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素(終濃度100μg/ml)的lb固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜；挑取平板上生長(zhǎng)的白色菌落，接入含卡那霉素(終濃度100μg/ml)的lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，離心收集菌體按堿裂解法提取質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果顯示載體pzm908::gus構(gòu)建正確。

實(shí)施例4植物表達(dá)載體pzm908不同截短片段::gus的構(gòu)建

設(shè)計(jì)并合成下表引物作為pcr反應(yīng)中的上游引物，5’端分別加入了限制性內(nèi)切酶sphi位點(diǎn)，為以后分離和構(gòu)建的需要，pcr下游引物選用實(shí)施例2中的引物2：

構(gòu)建pzm908不同截短片段::gus植物表達(dá)載體的上游引物

以質(zhì)粒p19t-pzm908為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)擴(kuò)增到各截短片段，用dna膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收，把回收片段亞克隆到測(cè)序載體pm19-t中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用cacl2法處理的大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素(終濃度100μg/ml)的lb固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜；挑取平板上生長(zhǎng)的白色菌落，接入含氨芐青霉素(終濃度100μg/ml)的lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，離心收集菌體按堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶sphi和bamhi雙酶切和pcr擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性克隆，測(cè)序分析正確后，將陽(yáng)性克隆分別命名為p19t-p1670、p19t-p1126、p19t-p789、p19t-p586、p19t-p244、p19t-p184和p19t-p126。

用堿裂解法提取各質(zhì)粒，經(jīng)過sphi酶切，klenow補(bǔ)平，再用bamhi酶切，得到各截短啟動(dòng)子片段，與經(jīng)過hindⅲ酶切，klenow補(bǔ)平，再用bamhi酶切的植物表達(dá)載體pbi121的大片段相連(圖1)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用cacl2法處理的大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素(終濃度100μg/ml)的lb固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜；挑取平板上生長(zhǎng)的白色菌落，接入含卡那霉素(終濃度100μg/ml)的lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，離心收集菌體按堿裂解法提取質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果顯示各載體p1670::gus、p1126::gus、p789::gus、p586::gus、p244::gus、p184::gus和p126::gus構(gòu)建正確。

實(shí)施例5pzm908::gus表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草

利用凍融法將重組的植物表達(dá)載體pzm908::gus轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌lba4404，轉(zhuǎn)化方法參照hofen等[hofenr，willmitzerl，storageofcompetentcellsforagrobacteriumtransformation.nucleicacidsresearch,1988.16,9877]。

煙草的轉(zhuǎn)化參照horsch等[horschrb,fryje,hoffmann.asimpleandgeneralmethodfortransferringgenesintoplants.science,1985.227:1229-1231]。轉(zhuǎn)化受體為煙草(nicotianatabacumcvsamsun)。將過夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌lba4404(含有pzm908::gus)菌液，按照1:100比例轉(zhuǎn)接至yeb液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至od600值約0.6-0.8左右；收集菌體后，用滲入緩沖液懸浮菌體，稀釋到od600值約為0.6左右，先將無菌的煙草葉盤與轉(zhuǎn)入pzm908::gus質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共同孵育。十分鐘后，將葉盤轉(zhuǎn)移到ms基本培養(yǎng)基黑暗條件下共培養(yǎng)3d。然后將葉片轉(zhuǎn)移至ms分化培養(yǎng)基(3mg·l^-16-ba，0.2mg·l^-1naa，100mg·l^-1kan，500mg·l^-1cb)培養(yǎng)(光周期16h/8h)，約四周后將抗性再生苗從外植體上切下，轉(zhuǎn)到ms生根培養(yǎng)基(100mg·l^-1kan,500mg·l^-1cb)誘導(dǎo)生根(光周期16h/8h)，約兩周后即可生出細(xì)嫩的抗性根。將生根良好的再生植株轉(zhuǎn)移到溫室中，經(jīng)練苗后移栽到小花盆中(營(yíng)養(yǎng)土:跖石＝1:1)(圖2)。

實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè)

pcr檢測(cè)：使用植物基因組dna少量提取方法提取再生煙草植株葉片dna，利用gus內(nèi)部引物(gus-f:5’ctgcgacgctcacaccgatacc3’)和nos引物(nos-r:5'tcgcaagaccggcaacagga3')進(jìn)行pcr擴(kuò)增。結(jié)果表明，攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因煙草可以擴(kuò)增出與轉(zhuǎn)化質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致的目的條帶，而未轉(zhuǎn)化植株則沒有相應(yīng)大小的產(chǎn)物(圖3)。

實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因煙草的gus活性的組織化學(xué)檢測(cè)

gus基因活性的組織化學(xué)染色分析方法依據(jù)bradford等人[bradfordhm.arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding[j].analbiochem.,1976,72:248-254.]。將收集轉(zhuǎn)基因煙草的不同組織材料與含底物x-gluc(x-gluc染液組成:1.0mg/μlx-gluc；50mmol/l磷酸緩沖液，ph7.0；10mmol/ledta，ph8.0；0.05mmol/l鐵氰化鉀；0.05mmol/l亞鐵氰化鉀；甲醇,終濃度20％；0.1％tritonx-100)的染色反應(yīng)液于37℃保溫6-8h，進(jìn)行組織化學(xué)染色觀察,葉片等綠色組織用95％乙醇脫色后觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pzm908::gus轉(zhuǎn)基因煙草的幼根、幼苗、種子和花藥均未有藍(lán)色出現(xiàn)(圖4b-4e)，僅有轉(zhuǎn)基因煙草的成熟花粉有藍(lán)色出現(xiàn)(圖4a)結(jié)果表明pzm908啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因特異地在花粉中表達(dá)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

sequencelisting

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種花粉特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用

<130>khp161119401.3

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2126

<212>dna

<213>玉米

<400>1

ggtgtgcgtaatgactcgataagttcagttatctgtatctccattatatcgcccaagagc60

gctagacccatcacgcagacattacacataatcggagtagagaatgagtggaaaggatta120

caataatataatttacattcatataaaaatatagaaagagtagttattacataaccgggt180

gtttgagtgcggaacttattattacattaccgggaggcaaaacaccctccccaaataagt240

tttagtgttcttcctcctgcttgggaaccaccttggaacagaaacaacataactccgccg300

tttcatcacctacaacaacatgggatcgaaaaccctgagtacggagtatacttttgcaag360

tcttacccgtcaaaggaaaaagacactcaaggatatgctgccttttgggattcaaggtaa420

agcttatcaagattcaaagactctatttgccgaaaagcttactaagattggatcattaaa480

aatccctttttattatcaggttaaatagttacctgtatctagatttctttctatcctaga540

tcaagcacttggcctatactagccgtcttttatcaatccttcagttaacttgattggtac600

gtgtaagtcagtgaccaagtcttcatgtccgagaagtaatggcgatccgaatcgattaat660

acccagctggggatctcgaaccacgcgacatatgtagcacttaacccttgcatatgtcaa720

tcgccaccgggtttctcaagaccagaatgggttcacgccaaccgagagcgcagatgcacc780

gccgtctagcctcttgccacgaagggtacacgctactctcgccatctctccactcccatt840

gcgtggtgggctttctggtattggtccgactgaggcaaagcttacccatgacgaggcatg900

tggccagttaaaaggtcctcgatcatcaagcctacatcggttcggtccttaagcgactca960

gacggagacactacaccgagactcctttctcgtgcaagtcaaccgcccgatctcgtcttt1020

attacttaaaaccccaaagcttggtacctggcagaggtactctttccagatgttgaaccc1080

atcatggccctgatgaattcaccatcacaagtcttttctttgtaaaaattcccatcccat1140

atgaagcatcaccttttgtttaaaaacaaaacattctatgttctaaagcaaggctaagca1200

tcagaaaactttaagtaaatcaggtaacaaggaatggtaatcagttttccaaggaaggga1260

atgcaccaattgtttaacacgcaactcctatcacctaatgcatcaaacaaggtgataaag1320

tttctaaaacaacaaggaaaaggggtaacgcaccggagcttgccttgtgttgcaggaggt1380

tcagggtccactccgtagatgttgaagtagaagtcgttctcggttggaggatttttagct1440

tgagtgactacctccccttctgcctcagtttcttcctcgtgttctatacaagacaatata1500

tgtacatgaatgcttatgtgaagtaatgaatatgcagttacacaatagaaacatactagg1560

ttgtatcttaaatacaactttccttcacggtacaaactaatcactagggtttcctaagtt1620

ggtattctattagtgttaagtaacttaacccttggaggctagttattgggtttgtgacca1680

aacagagaccaaatcatttcaaacctcacccaggatcttcaatcatcatactaagttcac1740

ccaaaaagttttaccatttttggagctactaaattatttctaaaattctaaaaggcttgg1800

tttgagcacctttaaaggctacataattctaggtttgggatcaaaatctttgaactattt1860

ttattaaatactatgtgattttagaagtctagcaaaattggtcccatgattttaccaatt1920

ttctactattttctataaatttcctgagctgacagtaaaaagaaaaagaaaaaatgatga1980

atagtgttgggccaattctggcccaagtcggcccgcaggcaggataacacgcacgcgtgc2040

ttgcgctcgcgctggagaacttgcacagaggcccctagccttttaaataactggtaaaga2100

atccctaagtactattcatatgtttc2126

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cgcgcatgcggtgtgcgtaatgactcga28

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cgcggatccgaaacatatgaatagtac27

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgcgcatgcgcttactaagattggatc27

<210>5

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cgcgcatgcaaccgcccgatctcgtc26

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cgcgcatgcaaaaggggtaacgcac25

<210>7

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cgcgcatgccacaatagaaacatact26

<210>8

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cgcgcatgcagaagtctagcaaaattg27

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cgcgcatgccctgagctgacagtaa25

<210>10

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

cgcgcatgcgcccaagtcggcccgca26

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

ctgcgacgctcacaccgatacc22

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

tcgcaagaccggcaacagga20