一種燕麥花葉病毒的RT?PCR檢測方法、引物和試劑盒與流程

本發(fā)明涉及生物物種分子診斷領域，具體地說，涉及一種燕麥花葉病毒的rt-pcr檢測方法、引物和試劑盒。
背景技術：
：燕麥花葉病毒(oatmosaicvirus，omv)為馬鈴薯y病毒科(potyviridae)，大麥黃花葉病毒屬(bymovirus)，為線狀，常彎曲，無包膜，具有明顯的形態(tài)長度，長約600～750nm，寬12～14nm。omv主要侵染燕麥屬植物，引起秋季播種的燕麥發(fā)病，可以引起39～60％的減產(chǎn)。omv的傳播主要依賴禾谷多粘菌以持久性方式傳播，長距離擴散則隨感病植株的無性繁殖材料傳播。目前，omv主要分布于美國、加拿大、新西蘭、英國、法國、愛爾蘭等國，在我國尚未見發(fā)生，2007年農(nóng)業(yè)部862號公文《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》將其列為重要的對外檢疫性有害生物。因此，建立該病毒的快速檢疫鑒定技術及相關檢測標準具有非常重要的經(jīng)濟價值和社會價值。半個世紀來，現(xiàn)代病毒學研究水平不斷提高，病毒的檢測技術也在不斷發(fā)展和改進。目前病毒的檢測方法主要包括枯斑和指示植物檢測法，酶標免疫吸附法(elisa)，電鏡負染檢測法，免疫電鏡檢測法，電鏡超薄切片法以及pcr檢測方法。血清學方法是目前普遍運用的常規(guī)檢測方法，可操作性強，檢測結果相對可靠。但是該方法依賴于高質量的抗血清，成本較高，周期性長，且靈敏度有限，難以檢測含量很少的病毒。同時，燕麥花葉病毒所在的大麥黃花葉病毒屬各個成員在血清學上密切相關，因而難以采用elisa方法來準確檢測燕麥花葉病毒。pcr技術也是目前國內(nèi)外植物病毒檢測中應用較成功的方法。專利cn102102133a“棉花曲葉病毒檢測用引物”公開了棉花曲葉病毒定性pcr檢測方法。但是，迄今為止，缺乏一種針對燕麥花葉病毒的特異性強、靈敏度高的rt-pcr檢測方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，針對omv的外殼蛋白基因(cpgene)設計一對特異性檢測燕麥花葉病毒的引物，并優(yōu)化反應體系和反應程序，建立了rt-pcr快速檢測omv病毒的方法。該方法具有很強的特異性，可以從大麥黃花葉病毒屬中特異性檢出omv病毒。該方法靈敏度高、特異性強、快速高效，檢測結果準確可靠，非常適合在檢驗檢疫口岸的推廣應用。為此，本發(fā)明所采用的技術方案是：一種用于燕麥花葉病毒的rt-pcr檢測的引物，包括上游引物omv-f2、下游引物omv-r2，其序列分別如下：omv-f2：5′-cctcggatggtgcgtcaata-3′；(seqidno.1)omv-r2：5′-aaccctgtggtgggttgttt-3′。(seqidno.2)一種燕麥花葉病毒的rt-pcr檢測方法，包括使用上述引物進行pcr擴增的步驟。進一步地，該檢測方法包括以下步驟：s1、取待測樣品提取植物組織總rna；s2、以總rna為模板，引入下游引物omv-r2進行反轉錄模板cdna的合成；s3、將上游引物omv-f2、下游引物omv-r2置于pcr儀中進行pcr擴增反應；s4、對擴增產(chǎn)物進行電泳分離，鑒定樣品中是否含有燕麥花葉病毒。進一步地，所述步驟s2中進行反轉錄模板cdna的合成時，其反應體系為：反應條件為：37℃保溫60min，70℃15min滅活反轉錄酶。進一步地，所述dntp的濃度為10mmol/l，所述下游引物omv-r2的濃度為10μmol/l。進一步地，所述步驟s3中pcr反應體系為：反應條件為：95℃5min；95℃1min，60℃50s，72℃60s，35個循環(huán)；72℃10min。進一步地，所述上游引物omv-f2和下游引物omv-r2的濃度均為10μmol/l。一種燕麥花葉病毒的rt-pcr檢測試劑盒，包含以上所述的引物。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明針對檢疫性有害生物燕麥花葉病毒，設計了特異性引物，建立了rt-pcr快速檢測omv的方法，具有檢測快速簡單、特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強等優(yōu)點，檢測時間也縮減到2小時之內(nèi)，極大的提高了效率，適用于我國各大檢驗檢疫機構針對檢疫性有害生物燕麥花葉病毒的鑒定。附圖說明圖1是實施例rt-pcr檢測omv的特異性結果；圖2是實施例rt-pcr檢測omv的靈敏度結果。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。實施例一、選擇供試驗材料。采用的供試驗的病毒樣品見表1。表1供試驗病毒樣品中文名英文名燕麥花葉病毒oatmosaicvirus，omv大麥黃花葉病毒barleyyellowmosaicvirus，bymv大麥和性花葉病毒barleymildmosaicvirus，bammv小麥黃花葉病毒wheatyellowmosaicvirus，wymv小麥梭條斑花葉病毒wheatspindlestreakmosaicvirus，wssmv水稻壞死花葉病毒ricenecrosismosaicvirus，rnmv本實施例使用到的主要試劑和儀器如下：pcr擴增試劑由珠海寶銳生物科技有限公司提供；rna提取試劑盒、反轉錄試劑盒、引物由寶生物工程(大連)有限公司提供；其他試劑按普通分子生物學實驗操作規(guī)定。二、取待測樣品提取植物組織總rna。采用液氮進行供試樣品的前處理，植物總rna提取按照試劑盒(takaracode:d9108a)方法，操作步驟如下：1、于冰箱中取冷凍樣品置于預冷的研缽中，加入液氮，迅速研磨至粉末狀；2、迅速將粉末狀樣品轉移至2ml離心管中，加入1mlrnaisoplus，劇烈振蕩混勻，直至樣品呈勻漿狀，室溫靜置5min；3、12000g，4℃離心5min；4、小心吸取上清(1ml)，轉移至新的2ml離心管中；5、向上述溶液中加入1/5體積的氯仿(200μl)，蓋緊管蓋，劇烈震蕩15s，待溶液充分乳化后，室溫靜置5min；6、12000g，4℃離心15min；7、從離心機中小心取出離心管，此時溶液分三層，小心吸取上層清液(400μl)，轉移至新的2ml離心管中；8、向上述清液中加入等體積(400μl)的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻，室溫靜置10min；9、12000g，4℃離心10min，此時管底有白色沉淀；10、小心地棄去上清，沿離心管管壁緩慢加入1ml預冷的75％乙醇，切勿碰觸到沉淀，輕輕地上下顛倒離心管洗滌沉淀；11、12000g，4℃離心5min，小心地棄去乙醇，保留沉淀；12、室溫狀態(tài)下干燥10min左右；13、待乙醇充分晾干之后，向離心管中加入60μl，rnase-freeh2o溶解沉淀；14、溶解后的rna保存于-20℃冰箱，備用。三、根據(jù)genbank中已登錄的omv的核苷酸序列，利用dnastar軟件包primerselect設計引物。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物的相關信息如表2。表2特異性引物四、以總rna為模板，引入所述下游引物omv-r2進行反轉錄模板cdna的合成。以總rna為模板，以下游引物omv-r2作引物反轉錄合成cdna，0.2mlpcr管中加入：反應條件為：37℃保溫60min，70℃15min滅活反轉錄酶，反應結束后cdna于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。五、將上游引物omv-f2、下游引物omv-r2置于pcr儀中進行pcr擴增反應。其反應體系為：反應條件為：95℃5min；95℃1min，60℃50s，72℃60s，35個循環(huán)；72℃10min。用omv作陽性對照，用ddh2o作空白對照，6種供試驗病毒作陰性對照，重復兩次。六、瓊脂糖電泳rt-pcr產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析，每個樣品取5μl擴增產(chǎn)物與1μl的6×加樣緩沖液混合均勻點樣，用dnamarker作分子標記，在1×tae中以5v/cm的電壓電泳50min，溴化乙錠溶液(0.5μg/ml)染色10min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結果。七、結果判斷如圖1所示，其中m為marker，1是陽性對照，2為待測樣品，3是大麥黃花葉病毒，4是小麥黃花葉病毒，5是大麥和性花葉病毒，6是小麥梭條斑花葉病毒，7是水稻壞死花葉病毒，8是空白對照。陽性對照在406bp處有擴增片段，待測樣品出現(xiàn)與陽性對照一致的擴增條帶，判定為陽性，其他近緣種類(陰性對照)和空白對照無特異性擴增，表明該體系具有良好的特異性。將反轉錄的omv陽性樣品產(chǎn)物cdna，加入到pcr反應體系中，進行靈敏度檢測，結果如圖2所示，其中，m為marker，1為100ng/μl，2為10ng/μl，3為1ng/μl，4為0.1ng/μl，5為0.01ng/μl，6為0.001ng/μl?？芍０鍧舛仍?～100ng/μl時，均能擴增出強烈的檢測信號；對于0.1～0.01ng/μl的dna模板，檢測擴增產(chǎn)物明顯降低，檢測信號較弱；當dna模板濃度為0.001ng/μl時，由于無擴增產(chǎn)物或檢測信號太弱而無法檢出。表明該方法的檢測限度為0.1ng/μl，最適檢測濃度為1～100ng/μl。本發(fā)明針對omv的外殼蛋白基因設計一對特異性檢測燕麥花葉病毒的引物，并優(yōu)化反應體系和反應程序，建立了rt-pcr檢測omv病毒的方法。特異性測試結果表明該方法具有很強的特異性，可以從大麥黃花葉病毒屬中特異性檢出omv病毒，而且準確靈敏，成本較低，檢測范圍廣，非常適合在檢驗檢疫口岸的推廣應用。以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何屬于本
技術領域：
的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求的保護范圍為準。sequencelisting<110>珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心<120>一種燕麥花葉病毒的rt-pcr檢測方法、引物和試劑盒<130><160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1cctcggatggtgcgtcaata20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2aaccctgtggtgggttgttt20當前第1頁12