一種紫花苜蓿HPPD基因的啟動子及其制備方法和應用與流程

本發(fā)明涉及紫花苜蓿領(lǐng)域，特別是涉及一種紫花苜蓿啟動子及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
：啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游的DNA序列，能與RNA聚合酶結(jié)合，使之與模板DNA準確結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄。一個典型的啟動子包括CAAT-box和TATA-box等核心順式作用元件，按功能及作用方式可大致將其分為組成型表達啟動子、時空特異性表達啟動子和誘導型表達啟動子三類。目前，植物啟動子已經(jīng)被大量的分離并研究，花椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟動子和木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子即組成型啟動子。Pyk10啟動子是擬南芥中的組織特異性表達啟動子。組成型表達的啟動子在植物基因工程的早期研究中發(fā)揮了重要的作用，但是在應用過程中也存在一定的問題。組成型啟動子在轉(zhuǎn)基因作物中驅(qū)動相關(guān)基因持續(xù)高量的表達可能造成物質(zhì)和能量上的浪費，甚至會影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，而特定時空表達和誘導型表達的啟動子可以較好地解決這一問題。如馬鈴薯中冷誘導表達啟動子pCL、擬南芥中干旱誘導表達啟動子Prd29A等。紫花苜蓿是世界上分布最廣的一種多年生豆科牧草，也是我國最重要的豆科牧草之一。它不僅產(chǎn)量高而且營養(yǎng)豐富，為譽為“牧草之王”。但由于紫花苜蓿多年生，多倍體的特點，目前對紫花苜?；蚍矫娴难芯窟€遠遠落后于其它作物。對于紫花苜蓿啟動子研究的相關(guān)報道還比較少。維生素E是動物不能合成但又必須的營養(yǎng)物質(zhì)。在維生素E的生物合成中，對羥基苯丙酮酸雙加氧酶是第一個關(guān)鍵酶，對于維生素E的合成具有重要作用。本專利以紫花苜蓿為材料，研究編碼對羥基苯丙酮酸雙加氧酶基因的啟動子，旨在闡明該啟動子不同區(qū)域發(fā)揮的功能，及其響應的誘導條件，為更真實的了解紫花苜蓿的基因表達調(diào)控特性，進而幫助我們了解紫花苜蓿的維生素E性狀形成的生物學過程，探討生物對其生長環(huán)境的適應機制以及更好地控制基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達等具有重要意義。同時也為一個誘導型啟動子，尤其是光/暗誘導啟動子的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的是提供一種紫花苜蓿HPPD基因的啟動子。本發(fā)明的第二目的是提供一種紫花苜蓿HPPD基因的啟動子的制備方法。本發(fā)明的第三目的是提供一種紫花苜蓿HPPD基因的啟動子的應用。一種紫花苜蓿HPPD基因的啟動子，其基因序列如序列表中SEQIDNO:1所示。本發(fā)明所述的紫花苜蓿HPPD基因的啟動子的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)基因組DNA的獲取；(2)特異性引物的設計；(3)1stPCR反應；(4)2ndPCR反應；(5)3rdPCR反應；(6)取1st、2nd、3rdPCR反應液各5μl，使用1％的瓊脂糖凝膠進行電泳；(7)切膠回收清晰的電泳條帶，以SP3Primer為引物對PCR產(chǎn)物進行DNA測序；將測序獲得的序列進行拼接，去除重疊序列，最終獲得紫花苜蓿HPPD基因的啟動子序列；所述SP3Primer如序列表中SEQIDNO:4所示。本發(fā)明所述的紫花苜蓿HPPD基因的啟動子的制備方法，其特征在于：步驟(1)具體包括：取1.0g紫花苜蓿新鮮葉片，利用QIAGEN公司的DNeasyPlantMaxiKit提取總DNA，所得的DNA量≥30μg。本發(fā)明所述的紫花苜蓿HPPD基因的啟動子的制備方法，其特征在于：步驟(2)具體包括：根據(jù)已知的紫花苜蓿HPPD基因編碼區(qū)DNA序列，設計三個特異性引物SP1：5'-GTGTTTGTCTTGGTGTTGTTGTTA-3'、SP2：5'-AGAGTAATGGAGCGACGG-CGTAGTTG-3'、SP3：5'-GTTCGGGCTCGATCAAACGACTACTG-3'；設計方向為5'端；設計原則為：SP2位于SP1內(nèi)側(cè)，SP3位于SP2內(nèi)側(cè)；每兩個引物之間的距離為100bp左右，引物長度22-26bp，GC含量45-55％，Tm值60-70℃；所述引物SP1、SP2和SP3如序列表中SEQIDNO:2-4所示。本發(fā)明所述的紫花苜蓿HPPD基因的啟動子的制備方法，其特征在于：步驟(3)具體包括：基因組DNA經(jīng)OD測定，濃度為50ng/μl，取2μl作為模板，以TAKARAgenomewalking試劑盒APPrimer四種中的任意一種，作為上游引物，SP1Primer為下游引物，進行1stPCR反應；A.按表1中的組份配制1stPCR反應液：表1試劑使用量紫花苜?；蚪MDNA，50ng/μL2μLdNTPMixture，2.5mMeach8μl10×LAPCRBufferII，Mg2+plus5μlTaKaRaLATaq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSPPrimer，10pmol/μl1μldH2O32.5μlB.1stPCR反應條件及步驟如表2所示：表2本發(fā)明所述的紫花苜蓿HPPD基因的啟動子的制備方法，其特征在于：步驟(4)具體包括：取1μl1stPCR反應液作為2ndPCR反應的模板，以AP1Primer為上游引物，SP2Primer為下游引物，進行2ndPCR反應；A.按表3中的組份配制2ndPCR反應液：表3B.2ndPCR反應條件及步驟如表4所示：表4本發(fā)明所述的紫花苜蓿HPPD基因的啟動子的制備方法，其特征在于：步驟(5)具體包括：取1μl2ndPCR反應液作為3rdPCR反應的模板，以APPrimer為上游引物，SP3Primer為下游引物，進行3rdPCR反應；A.按表5中的組份配制3rdPCR反應液：表5試劑使用量2ndPCR反應液1μLdNTPMixture，2.5mMeach8μl10×LAPCRBufferII，Mg2+plus5μlTaKaRaLATaq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSP3Primer，10pmol/μl1μldH2O33.5μl總體積50μlB.3rdPCR反應條件及步驟如表6所示：表6本發(fā)明所述的紫花苜蓿HPPD基因的啟動子在調(diào)控基因的光/暗反應以及逆境反應中的應用。用PlantCARE軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對該啟動子序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)該啟動子中存在逆境響應，水楊酸(SA)以及多個光響應原件。為驗證該啟動子對MsHPPD基因的調(diào)控功能，構(gòu)建了HPPDpromoter：：35S植物表達載體，將該載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中。用SA、干旱(PEG)、鹽(NaCl)、脫落酸(ABA)和光/暗對轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進行處理，然后將整個植株進行GUS組織化學染色處理。結(jié)果顯示：經(jīng)水楊酸，PEG，NaCl，ABA多種逆境處理后，與PBI::GUS對照相比，GUS染色濃度升高；光/暗處理時，暗處理后，GUS染色濃度顯著升高，而恢復光照后，GUS染色變淺。結(jié)果說明，HPPD基因的啟動子在調(diào)控基因的光/暗反應以及多種逆境反應中起到了重要作用，可以作為一個逆境響應，尤其是光調(diào)控響應的啟動子使用。本發(fā)明的有益效果在于：(1)獲得了HPPD基因的啟動子基因序列，并發(fā)現(xiàn)了HPPD基因的啟動子在調(diào)控基因的光/暗反應以及多種逆境反應中的應用。(2)闡明了該啟動子不同區(qū)域發(fā)揮的功能，及其響應的誘導條件，為更真實的了解紫花苜蓿的基因表達調(diào)控特性，進而可以了解紫花苜蓿的維生素E性狀形成的生物學過程，探討生物對其生長環(huán)境的適應機制以及更好地控制基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達等具有重要意義。同時也為一個誘導型啟動子，尤其是光/暗誘導啟動子的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。下面結(jié)合附圖說明和具體實施例對本發(fā)明所述的紫花苜蓿HPPD基因的啟動子及其制備方法和應用作進一步說明。附圖說明圖1為GUS組織化學的染色結(jié)果彩色圖；圖2為GUS組織化學的染色結(jié)果灰度圖。具體實施方式紫花苜蓿HPPD基因的啟動子，其基因序列如序列表中SEQIDNO:1所示。通過染色體步移技術(shù)獲得該序列，具體方法為：(1)基因組DNA的獲取取1.0g紫花苜蓿新鮮葉片，利用QIAGEN公司的DNeasyPlantMaxiKit提取總DNA，所得的DNA量≥30μg。(2)特異性引物的設計根據(jù)已知的紫花苜蓿HPPD基因編碼區(qū)DNA序列，設計三個特異性引物SP1：5'-GTGTTTGTCTTGGTGTTGTTGTTA-3'、SP2：5'-AGAGTAATGGAGCGACGG-CGTAGTTG-3'、SP3：5'-GTTCGGGCTCGATCAAACGACTACTG-3'；設計方向為5'端；設計原則為：SP2位于SP1內(nèi)側(cè)，SP3位于SP2內(nèi)側(cè)；每兩個引物之間的距離為100bp左右，引物長度22-26bp，GC含量45-55％，Tm值60-70℃；引物SP1、SP2和SP3如序列表中SEQIDNO:2-4所示。(3)1stPCR反應基因組DNA經(jīng)OD測定，濃度為50ng/μl，取2μl作為模板，以TAKARAgenomewalking試劑盒APPrimer四種中的任意一種，作為上游引物，SP1Primer為下游引物，進行1stPCR反應；A.按表1中的組份配制1stPCR反應液：表1試劑使用量紫花苜?；蚪MDNA，50ng/μL2μLdNTPMixture，2.5mMeach8μl10×LAPCRBufferII，Mg2+plus5μlTaKaRaLATaq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSPPrimer，10pmol/μl1μldH2O32.5μlB.1stPCR反應條件及步驟如表2所示：表2(4)2ndPCR反應取1μl1stPCR反應液作為2ndPCR反應的模板，以AP1Primer為上游引物，SP2Primer為下游引物，進行2ndPCR反應；A.按表3中的組份配制2ndPCR反應液：表3試劑使用量1stPCR反應液1μLdNTPMixture，2.5mMeach8μl10×LAPCRBufferII，Mg2+plus5μlTaKaRaLATaq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSP2Primer，10pmol/μl1μldH2O33.5μl總體積50μlB.2ndPCR反應條件及步驟如表4所示：表4(5)3rdPCR反應取1μl2ndPCR反應液作為3rdPCR反應的模板，以APPrimer為上游引物，SP3Primer為下游引物，進行3rdPCR反應；A.按表5中的組份配制3rdPCR反應液：表5試劑使用量2ndPCR反應液1μLdNTPMixture，2.5mMeach8μl10×LAPCRBufferII，Mg2+plus5μlTaKaRaLATaq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSP3Primer，10pmol/μl1μldH2O33.5μl總體積50μlB.3rdPCR反應條件及步驟如表6所示：表6(6)取1st、2nd、3rdPCR反應液各5μl，使用1％的瓊脂糖凝膠進行電泳。(7)切膠回收清晰的電泳條帶，以SP3Primer為引物對PCR產(chǎn)物進行DNA測序；將測序獲得的序列進行拼接，去除重疊序列，最終獲得紫花苜蓿HPPD基因的啟動子序列；所述SP3Primer如序列表中SEQIDNO:4所示。并且最終實驗結(jié)果表明：AP1Primer擴增出的條帶最清晰，非特異性擴增少，便于后期回收，條帶最長，效果最好。紫花苜蓿HPPD基因的啟動子在調(diào)控基因的光/暗反應以及逆境反應中的應用：用PlantCARE軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對該啟動子序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)該啟動子中存在逆境響應，水楊酸(SA)以及多個光響應原件。為驗證該啟動子對MsHPPD基因的調(diào)控功能，構(gòu)建了HPPDpromoter::35S植物表達載體，將該載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中。用SA、干旱(PEG)、鹽(NaCl)、脫落酸(ABA)和光/暗對轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進行處理，然后將整個植株進行GUS組織化學染色處理。結(jié)果顯示：經(jīng)水楊酸、PEG、NaCl、ABA多種逆境處理后，與PBI：：GUS對照相比，GUS染色濃度升高；光/暗處理時，暗處理后，GUS染色濃度顯著升高，而恢復光照后，GUS染色變淺(如圖1-2所示及表7所示)。表7GUS組織化學染色結(jié)果對照Control染色較淺PEG染色比對照深NaCl染色比對照深ABA染色比對照深SA染色比對照深黑暗染色比對照深恢復光照染色程度較黑暗處理淺結(jié)果說明，HPPD基因的啟動子在調(diào)控基因的光/暗反應以及多種逆境反應中起到了重要調(diào)控作用，可以作為一個逆境響應，尤其是光調(diào)控響應的啟動子使用。以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進，均應落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所<120>一種紫花苜蓿啟動子及其制備方法和應用<130>None<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1264<212>DNA<213>Artificial<220><223>HPPD啟動子序列<400>1ggcttagtaatctagagttcggccgcgaggtaatcatagcctgaccaaaaattgttccat60ccaagaatcaaactcgggtatatacactaagcaagaattaagcatattacgcctcttaaa120aaaaacatattgcctaaattatttagcttaactaataaattggttcattcatatcaacaa180gaattgagtgtagattttcacttcaccgcatacaaatctcggttgaaacagatgtacata240ttaggtgtttgatgtacctcactgaaaaatatatatagaaaaaaaatgacacttaaatta300atatgacacttttagataaatgatgctgacaatttaaatctaataagaaataattgtggt360agctcataagtatgagcagaattaagatgtggttggaggcactgatagagaatgtgtttt420gtagatagatataaggtgctatgctggtttttggcaatgtaaattttgattggtttctaa480caatgtatttaaagaatatggtgatgaggatgctagattttagttatattcttgcgcaga540agtcggtttattaattattatgtgtgaggatgtttgatgtcatgcttatcttgtgttaga600taaacatcttttaatggttgacatgtttaacgtagactttaatggataaggaaaatatga660tgtttatatttgtcgtgttcacacgtttgatacatcagtagtcgtttgatcgagcccgaa720ctattcatattttaatataaattattcaatctcgatcaaccactactgaagtataattgt780gacaaattattcgatcgtaagatcgaagaaagtaatatcagttcatgaaattgcgattgc840gtttgccattcttatttggagttaactaacttaggttactttaatgaaagttgagtgtgg900aggatgttttttccggttcaatatttctaaaaacattccgacaaaaaaaacaaaaaacta960aaacaatactactatagaaagtcgtgtttttcttctccacttccaatattttatttcttg1020tctatttcctatgaaattatcatcttcaccatttcttccttcatcctcatccatccactc1080ttacacaccatttctcccacgcaacacacaaaattccaactacgccgtcgctccattact1140ctcatccaatcacatttctccacgtttcaccttccctcaacataaaaacaccaacaagta1200caacaacactcttacaaattctaacaacaacaccaagacaaacactaaaacaacaatctc1260catg1264<210>2<211>24<212>DNA<213>Artificial<220><223>引物SP1<400>2gtgtttgtcttggtgttgttgtta24<210>3<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>引物SP2<400>3agagtaatggagcgacggcgtagttg26<210>4<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>引物SP3<400>4gttcgggctcgatcaaacgactactg26當前第1頁1 2 3