一種鈣黃綠素可視化RT?LAMP試劑盒及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

新型鴨呼腸孤病毒(new-typeduckreovirus,ndrv)病，是一種以肝臟不規(guī)則壞死，出血斑點(diǎn)和心肌，法氏囊出血為主要特征的新疫病。其主要臨床癥狀為病鴨精神不振、采食量降低或廢絕，有些鴨有拉白稀糞、發(fā)病急、病程短(24h內(nèi))，并且與以往鴨呼腸孤病不一樣，該病無(wú)軟腳現(xiàn)象。該病毒在致病性、抗原性和基因序列方面都有別于番鴨呼腸孤病毒(黃瑜，2009；陳宗艷等，2012；袁遠(yuǎn)華等，2013)。自2005年以來(lái)，該病由福建、廣東及浙江等地區(qū)不斷向其它地區(qū)蔓延，來(lái)勢(shì)洶洶，給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前常用于新型鴨呼腸孤病毒的檢測(cè)方法包括病原學(xué)診斷法、血清學(xué)診斷法和rt-pcr診斷法。病原學(xué)診斷法是最傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但其影響因素多，實(shí)際操作起來(lái)相當(dāng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性；血清學(xué)診斷法包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(agpt)，其中酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)需要配置昂貴的pcr儀器，實(shí)驗(yàn)操作的時(shí)間消耗較長(zhǎng)、復(fù)雜，不便于在基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的推廣和使用，而瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的敏感性不高；而rt-pcr技術(shù)需要特殊的儀器設(shè)備(如pcr儀和凝膠成像系統(tǒng)等)和專業(yè)人員進(jìn)行相關(guān)的操作，顯然無(wú)法滿足基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。

近年來(lái)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)廣泛應(yīng)用于各種病原的快速診斷，于可響等(于可響,馬秀麗,韓宏宇等.新型鴨呼腸孤病毒rt-lamp檢測(cè)方法的建立[j].生物技術(shù)通報(bào).2015，31(8):71-75.)針對(duì)ndrv的σb蛋白保守序列設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，建立了rt-lamp可視化快速檢測(cè)方法，對(duì)ndrvrna最低檢出量為0.1pg，敏感性約為常規(guī)rt-pcr方法的100倍，但其需要開蓋加入sybrgreeni熒光劑，檢測(cè)方法不夠優(yōu)良，檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。

因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒及其應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)新型鴨呼腸孤病毒檢測(cè)方法操作復(fù)雜、靈敏度不高、耗時(shí)長(zhǎng)、不能滿足現(xiàn)場(chǎng)及基層快速檢測(cè)需要的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒，其中，包括引物組、鈣黃綠素、氯化錳；

所述引物組如下：

上游外引物f3：5’-cgtggatggtcaaagtcgt-3’；(seqidno.1)

下游外引物b3：5’-acctacactccaggaaggac-3’；(seqidno.2)

上游內(nèi)引物fip：

5’-tagttctggcatggcctcgc-ctttacatgtgctgcaggga-3’；(seqidno.3)

下游內(nèi)引物bip：

5’-tgttcggacgttctcttccgga-tttaatggcgcggacgac-3’；(seqidno.4)

環(huán)引物loopf：5’-agcctagattcgcactccg-3’；(seqidno.5)

環(huán)引物loopb：5’-cgaggagactacccacgtt-3’；(seqidno.6)。

一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒，其中，還包括新型鴨呼腸孤病毒rna模板。

一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒，其中，rnase-freewater、10倍反應(yīng)緩沖液、dntps、甜菜堿、mgso4、bst聚合酶和amv反轉(zhuǎn)錄酶。

一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒，其中，還包括2.5mmol/l的dntps、5mmol/l的甜菜堿、100mmol/l的mgso4、625mmol/l的鈣黃綠素、25mmol/l的mncl2、8u/μl的bst聚合酶和10u/μlamv的反轉(zhuǎn)錄酶。

一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒，其中，所述外引物f3+b3的濃度為10μmol/l，所述內(nèi)引物fip+bip的濃度為10μmol/l，所述環(huán)引物loopf+loopb的濃度為10μmol/l。

一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒的應(yīng)用，其中，包括步驟：

(1)配制rt-lamp反應(yīng)體系：加入鈣黃綠素、氯化錳、硫酸鎂、甜菜堿、dntps、amv酶、bst聚合酶、10倍反應(yīng)緩沖液、上游外引物f3、下游外引物b3、上游內(nèi)引物fip、下游內(nèi)引物bip、環(huán)引物loopf、環(huán)引物loopb以及待測(cè)樣品；

(2)反應(yīng)：將步驟(1)配制好的反應(yīng)體系反應(yīng)，條件為59～66℃恒溫反應(yīng)，然后滅活；

(3)結(jié)果判讀：

在自然光或紫外光下判讀反應(yīng)的結(jié)果或者二者結(jié)合判讀:

在自然光下，反應(yīng)產(chǎn)物為綠色，說明測(cè)試樣品中含有新型鴨呼腸孤病毒；在自然光下，反應(yīng)產(chǎn)物為橙色，說明測(cè)試樣品中不含新型鴨呼腸孤病毒；

在紫外光下，反應(yīng)產(chǎn)物為熒光綠色，說明測(cè)試樣品中含有新型鴨呼腸孤病毒；在紫外光下，反應(yīng)產(chǎn)物為淺藍(lán)色或接近透明，說明測(cè)試樣品中不含新型鴨呼腸孤病毒。

一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒的應(yīng)用，其中，所述步驟(1)中，鈣黃綠素和氯化錳終濃度比為1:8～1:128，硫酸鎂的終濃度為1mmol/l～6mmol/l，甜菜堿的終濃度為0.5mmol/l～1.5mmol/l，dntps的終濃度為0.2mmol/l～0.6mmol/l，amv酶的終濃度為0.06u/μl～0.16u/μl，bst聚合酶的終濃度為0.08u/μl～0.48u/μl，10倍反應(yīng)緩沖液的終體積分?jǐn)?shù)4％～16％。

一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒的應(yīng)用，其中，所述步驟(1)中，內(nèi)引物與外引物的終濃度比為2:1～12:1，環(huán)引物與外引物的終濃度比為0～6:1。

一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒的應(yīng)用，其中，所述步驟(2)中，恒溫反應(yīng)的時(shí)間為10min～60min。

一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒的應(yīng)用，其中，所述步驟(2)中，滅活的條件為溫度85℃、時(shí)間5min。

有益效果：本發(fā)明通過rt-lamp技術(shù)與鈣黃綠素可視化技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)新型鴨呼腸孤病毒進(jìn)行檢測(cè)，操作更加簡(jiǎn)單，檢測(cè)更加方便快捷，同時(shí)，敏感性比常規(guī)rt-pcr高約100倍，解決現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)新型鴨呼腸孤病毒檢測(cè)方法操作復(fù)雜、靈敏度不高、耗時(shí)長(zhǎng)、不能滿足現(xiàn)場(chǎng)及基層快速檢測(cè)需要的問題。

附圖說明

圖1為primer1的rt-lamp產(chǎn)物酶切產(chǎn)物電泳圖。

圖1中泳道m(xù)：2000bpdnamarker；泳1：酶切產(chǎn)物；泳道2：陽(yáng)性；泳道3：ddh2o陰性

圖2為本發(fā)明引物特異性檢測(cè)熒光圖。

圖3為本發(fā)明引物特異性檢測(cè)電泳圖。

圖2、3中，m：2000bpdnamarker；1：陽(yáng)性質(zhì)粒樣品；2：陽(yáng)性rna樣品；3～10：mdrv、arv、dpv、dhav、nd、h9+h5；h7；dtmuv；11：ddh2o陰性。

圖4為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)體系溫度與熒光亮度關(guān)系圖。

圖5為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)體系溫度與電泳亮度關(guān)系圖。

圖4、5中，m：2000bpdnamarker；1～8：66℃、65℃、64℃、63℃、62℃、61℃、60℃、59℃；9：ddh2o陰性。

圖6為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)時(shí)間與熒光亮度關(guān)系圖。

圖7為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)時(shí)間與電泳亮度關(guān)系圖。

圖6、7中，m：2000bpdnamarker；1～6：10min、20min、30min、40min、50min、60min；7：ddh2o陰性。

圖8為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)中鈣黃綠素和錳離子的比例與熒光亮度關(guān)系圖。

圖9為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)鎂離子濃度與熒光亮度關(guān)系圖。

圖10為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)鎂離子濃度與電泳亮度關(guān)系圖。

圖9、10中，m：2000bpdnamarker；1～7中鎂離子濃度分別為0mmol/l、1.0mmol/l、2.0mmol/l、3.0mmol/l、4.0mmol/l、5.0mmol/l、6.0mmol/l；8：ddh2o陰性。

圖11為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)甜菜堿濃度與熒光亮度關(guān)系圖。

圖12為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)甜菜堿濃度與電泳亮度關(guān)系圖。

圖11、12中，m：2000bpdnamarker；1～4中甜菜堿濃度分別為0mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l；5：ddh2o陰性。

圖13為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)dntps濃度與熒光亮度關(guān)系圖。

圖14為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)dntps濃度與電泳亮度關(guān)系圖。

圖13、14中，m：2000bpdnamarker；1～6中dntps濃度分別為0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l、0.6mmol/l、0.7mmol/l；7：ddh2o陰性。

圖15為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)amv酶濃度與熒光亮度關(guān)系圖。

圖16為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)amv酶濃度與電泳亮度關(guān)系圖。

圖15、16中，m：2000bpdnamarker；1～6中amv酶濃度分別為0.06u/μl、0.08u/μl、0.1u/μl、0.12u/μl、0.14u/μl、0.16u/μl；7：ddh2o陰性。

圖17為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)bst聚合酶濃度與熒光亮度關(guān)系圖。

圖18為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)bst聚合酶濃度與電泳亮度關(guān)系圖。

圖17、18中，m：2000bpdnamarker；1～6中bst聚合酶濃度分別為0.08u/μl、0.16u/μl、0.24u/μl、0.32u/μl、0.4u/μl、0.48u/μl；7：ddh2o陰性。

圖19為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)10×buffer體積分?jǐn)?shù)與熒光亮度關(guān)系圖。

圖20為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)10×buffer體積分?jǐn)?shù)與電泳亮度關(guān)系圖。

圖19、20中，m：2000bpdnamarker；1～6中10×buffer體積分?jǐn)?shù)分別為0μl、4％μl、8％μl、10％μl、12％μl、16％μl；7：ddh2o陰性。

圖21為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)內(nèi)外引物濃度比例與熒光亮度關(guān)系圖。

圖22為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)內(nèi)外引物濃度比例與電泳亮度關(guān)系圖。

圖21、22中，m：2000bpdnamarker；1：fip+bip0.4μmol/l、f3+b30.2μmol/l；2：fip+bip0.8μmol/l，f3+b30.2μmol/l；3：fip+bip1.2μmol/l，f3+b30.2μmol/l；4：fip+bip1.6μmol/l，f3+b30.2μmol/l；5：fip+bip2.0μmol/l，f3+b30.2μmol/l；6：fip+bip2.4μmol/l，f3+b30.2μmol/l；7：ddh2o陰性。

圖23為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)環(huán)外引物濃度比例與熒光亮度關(guān)系圖。

圖24為本發(fā)明引物rt-lamp反應(yīng)環(huán)外引物濃度比例與電泳亮度關(guān)系圖。

圖23、24中，m：2000bpdnamarker；1：loopf+loopb0μmol/l、f3+b30.2μmol/l；2：loopf+loopb0.2μmol/l、f3+b30.2μmol/l；3：loopf+loopb0.4μmol/l、f3+b30.2μmol/l；4：loopf+loopb0.6μmol/l、f3+b30.2μmol/l；5：loopf+loopb0.8μmol/l、f3+b30.2μmol/l；6：loopf+loopb1.0μmol/l、f3+b30.2μmol/l；7：loopf+loopb1.2μmol/l、f3+b30.2μmol/l；8：ddh2o陰性。

圖25為本發(fā)明ndrv鈣黃綠素可視化rt-lamp方法的敏感性分析熒光圖。

圖26為本發(fā)明ndrv鈣黃綠素可視化rt-lamp方法的敏感性分析電泳圖。

圖27為本發(fā)明ndrv鈣黃綠素可視化rt-lamp方法的陽(yáng)性質(zhì)粒名感性驗(yàn)證熒光圖。

圖28為本發(fā)明ndrv鈣黃綠素可視化rt-lamp方法的陽(yáng)性質(zhì)粒名感性驗(yàn)證電泳圖。

圖25、26、27、28中，m：2000bpdnamarker；1～7中drv-qy株基因組rna量分別為2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg、2fg；8：ddh2o陰性。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒及應(yīng)用，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

以下實(shí)施例中，新型鴨呼腸孤病毒qy株(drv-qy)、番鴨呼腸孤毒株(mdrv)、禽呼腸孤毒株(arv)和鴨瘟疫苗(dpv)、鴨肝炎疫苗(dhav)、鴨新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒(h9+h5)疫苗、禽流感(h7)疫苗、鴨坦布蘇病毒(dtmuv)均由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存和提供，bstdna大片段聚合酶(配備10×thermopolbuffer)、amv反轉(zhuǎn)錄酶、dntps、硫酸鎂(mgso4)均產(chǎn)自neb公司，甜菜堿(betaine)、鈣黃綠素(calcein)、氯化錳(mncl2)產(chǎn)自sigma公司，trizolreagent試劑盒、rri、randomprimer、ex-taqdna聚合酶、瓊脂糖產(chǎn)自takara公司，異戊醇、無(wú)水乙醇等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭淮涡悦荛]核酸檢測(cè)裝置購(gòu)自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司。

實(shí)施例1：引物設(shè)計(jì)

以drv-qy株sigmab基因序列為設(shè)計(jì)模板(全長(zhǎng)1104bp)，應(yīng)用lamp在線引物設(shè)計(jì)軟件primerexplorer4設(shè)計(jì)出若干套引物，利用larsergene7.0primerselect和oligo7.0對(duì)引物進(jìn)行篩選，并利用primer-blast檢索所設(shè)計(jì)引物的特異性，既要保證每套引物進(jìn)行rt-lamp擴(kuò)增時(shí)具有較優(yōu)的理論值，又要保證各引物對(duì)之間產(chǎn)生最少的二聚體和具有良好保守性及特異性。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，設(shè)計(jì)篩選出的引物如下：

表1rt-lamp鈣黃綠素可視化引物(primer1)

rt-lamp鈣黃綠素可視化引物在基因中的位置如下：

(注：方框內(nèi)加粗的四個(gè)“ccgg”堿基為hpaⅱ酶的酶切位點(diǎn)，fip由f1c(f1的互補(bǔ)序列)和f2序列組成，bip由b1c和b2(b2c的互補(bǔ)序列)序列組成。)

實(shí)施例2：酶切鑒定引物特異性

用hpaⅱ酶對(duì)primer1的rt-lamp產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，在100bp～250bp范圍靠近100bp處有酶切條帶，這與預(yù)算的兩個(gè)條帶(127bp和114bp)大小相符，表明primer1的rt-lamp產(chǎn)物的酶切特異性良好。

新型鴨呼腸孤病毒的鈣黃綠素可視化rt-lamp試劑盒的應(yīng)用，包括步驟：

s1、配制rt-lamp反應(yīng)體系：加入鈣黃綠素、氯化錳、硫酸鎂、甜菜堿、dntps、amv酶、bst聚合酶、10倍反應(yīng)緩沖液、上游外引物f3、下游外引物b3、上游內(nèi)引物fip、下游內(nèi)引物bip、環(huán)引物loopf、環(huán)引物lb以及待測(cè)樣品；

s2、反應(yīng)：將步驟s1配制好的反應(yīng)體系反應(yīng)，條件為59～66℃恒溫反應(yīng)，然后滅活；

s3、結(jié)果判讀：

在自然光或紫外光下判讀反應(yīng)的結(jié)果或者二者結(jié)合判讀:

在自然光下，反應(yīng)產(chǎn)物為綠色，說明測(cè)試樣品中含有新型鴨呼腸孤病毒；在自然光下，反應(yīng)產(chǎn)物為橙色，說明測(cè)試樣品中不含新型鴨呼腸孤病毒；

在紫外光下，反應(yīng)產(chǎn)物為熒光綠色，說明測(cè)試樣品中含有新型鴨呼腸孤病毒；在紫外光下，反應(yīng)產(chǎn)物為淺藍(lán)色或接近透明，說明測(cè)試樣品中不含新型鴨呼腸孤病毒。

以下實(shí)施例中，熒光綠色越強(qiáng)或電泳條帶越亮，則說明產(chǎn)物中新型鴨呼腸孤病毒含量越高

實(shí)施例3：引物特異性驗(yàn)證

用primer1引物分別對(duì)drv、mdrv、arv、dpv、dhav、nd、h9+h5、h7、鴨坦布蘇病毒(dtmuv)進(jìn)行rt-lamp特異性試驗(yàn)，然后進(jìn)行熒光觀察和2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2和圖3所示，表明primer1引物對(duì)drv特異性良好。

實(shí)施例4：rt-lamp檢測(cè)體系的建立

設(shè)計(jì)59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃共8個(gè)溫度梯度，其他成分的用量如表2所示，進(jìn)行rt-lamp反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次以上，產(chǎn)物用熒光和2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化出rt-lamp反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度。結(jié)果如圖4和5所示，由圖4和5可知，65℃為rt-lamp反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度。

設(shè)計(jì)10min、20min、30min、40min、50min、60min6個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行rt-lamp反應(yīng)，其他成分的用量如表2所示，進(jìn)行rt-lamp反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次以上，產(chǎn)物用熒光和2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化出rt-lamp反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度。結(jié)果如圖6和7所示，由圖6和7可知，最佳反應(yīng)時(shí)間為50min。

鈣黃綠素可視化rt-lamp初始反應(yīng)體系(25μl)如表2所示：

表2ndrv鈣黃綠素可視化rt-lamp方法初始反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

實(shí)施例5：rt-lamp檢測(cè)體系的優(yōu)化(以下實(shí)驗(yàn)均按25.0μl記算)

一、設(shè)計(jì)鈣黃綠素和錳離子的終濃度比為1:8、1:12、1:16、1:32、1:64、1:128、1：10、1:12和1:24進(jìn)行rt-lamp反應(yīng)，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater補(bǔ)足差量，進(jìn)行rt-lamp反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次以上，產(chǎn)物用熒光和2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化出rt-lamp反應(yīng)的最佳鈣黃綠素與錳離子的終濃度比。結(jié)果如圖8所示，由圖8可知，當(dāng)鈣黃綠素和錳離子終濃度比為25μmol/l:0.3mmol/l(1:12)時(shí)，鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)的陽(yáng)性和陰性結(jié)果區(qū)分最明顯。

二、設(shè)計(jì)鎂離子濃度為0mmol/l、1mmol/l、2mmol/l、3mmol/l、4mmol/l、5mmol/l和6mmol/l7個(gè)濃度梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater補(bǔ)足差量，進(jìn)行rt-lamp反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次以上，產(chǎn)物用熒光和2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化出rt-lamp反應(yīng)的最佳反應(yīng)鎂離子濃度。結(jié)果如圖9和10所示，由圖9和10可知，在鎂離子終濃度為3.0mmol/l前(泳道1～3)，隨著鎂離子濃度的增加，反應(yīng)效率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)濃度大于3.0mmol/l時(shí)(泳道4～7)，反應(yīng)效率下降但又趨于平穩(wěn)，故最佳反應(yīng)鎂離子濃度為3.0mmol/l。

三、設(shè)計(jì)0mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l4個(gè)甜菜堿終濃度梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater補(bǔ)足差量，進(jìn)行rt-lamp反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)至少重復(fù)3次，產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化出rt-lamp反應(yīng)的最佳反應(yīng)甜菜堿濃度。結(jié)果如圖11和12所示，由圖11和12可知，無(wú)甜菜堿時(shí)，該反應(yīng)仍然可以順利擴(kuò)增，但甜菜堿濃度為0.5mmol/l時(shí)條帶最亮，反應(yīng)最佳，甜菜堿濃度大于0.5mmol/l時(shí)反而會(huì)使反應(yīng)擴(kuò)增效率下降。

四、設(shè)計(jì)0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l、0.6mmol/l、0.7mmol/l6個(gè)dntps濃度梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater補(bǔ)足差量，進(jìn)行rt-lamp反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)至少重復(fù)3次，產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化出鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)的最佳dntps濃度。結(jié)果如圖13和14所示，由圖13和14可知，終濃度為0.3mmol/l的dntps能夠使反應(yīng)順利進(jìn)行，故最佳dntps濃度為0.3mmol/l(泳道2)。

五、設(shè)計(jì)0.06u/μl、0.08u/μl、0.1u/μl、0.12u/μl、0.14u/μl、0.16u/μl6個(gè)amv酶濃度梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater補(bǔ)足差量，進(jìn)行鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)至少重復(fù)3次，產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化出鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)的最佳a(bǔ)mv酶濃度。結(jié)果如圖15和16所示，由圖15和16可知，當(dāng)amv酶終濃度為0.14u/μl時(shí)，鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)擴(kuò)增效率最高(泳道5)，amv酶濃度增加反而使反應(yīng)效率下降。故0.14u/μl為該rt-lamp反應(yīng)的最佳a(bǔ)mv反轉(zhuǎn)錄酶終濃度。

六、設(shè)計(jì)0.08u/μl、0.16u/μl、0.24u/μl、0.32u/μl、0.4u/μl、0.48u/μl6個(gè)bst聚合酶濃度梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater補(bǔ)足差量，進(jìn)行鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)至少重復(fù)3次，產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化出鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)的最佳bst聚合酶濃度。結(jié)果如圖17和18所示，由圖17和18可知，泳道4、5、6在rt-lamp反應(yīng)進(jìn)行至22min時(shí)，反應(yīng)速度比泳道1、2、3的要快，從紫外下鈣黃綠素亮度可判斷，隨著bst聚合酶的濃度增加，反應(yīng)速度是上升的，但是只有在濃度為0.32u/μl(泳道4)時(shí)，最終擴(kuò)增效率最大，故鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)的最佳bst聚合酶濃度為0.32u/μl。

七、設(shè)計(jì)0μl、1μl、2μl、2.5μl、3μl、4μl6個(gè)10×buffer梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater補(bǔ)足差量，進(jìn)行鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)至少重復(fù)3次，產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化出鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)的最佳10×buffer加入量。結(jié)果如圖19和20所示，由圖19和20可知，從紫外可視化圖可知，從開始至25min時(shí)，泳道3、4、5反應(yīng)速度比較快，但從跑膠結(jié)果可知，在泳道4時(shí)(2.5μl)，最終擴(kuò)增效率最佳，能使反應(yīng)順利進(jìn)行，故最佳鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)的10×buffer加入量為2.5μl(即在25μl反應(yīng)體系中的含量為10％)。

八、分別設(shè)計(jì)內(nèi)引物和外引物濃度比為2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、12:1，由rnase-freewater補(bǔ)足差量，具體的，依次設(shè)計(jì)fip+bip為0.4μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l、fip+bip為0.8μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l、fip+bip為1.2μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l、fip+bip為1.6μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l、fip+bip為2.0μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l、fip+bip為2.4μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l，其他成分的用量如表2所示，進(jìn)行鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)至少重復(fù)3次，產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化出鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)的最佳內(nèi)引物和外引物比例。結(jié)果如圖21和22所示，由圖21和22可知，在反應(yīng)至20min時(shí)，泳道3、4、5的反應(yīng)速度相當(dāng)，但比泳道1、2、6的要快；由跑膠圖可知泳道5最終擴(kuò)增效率最高，故鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)的最佳內(nèi)引物和外引物比例為10:1(fip+bip2.0μmol/l，f3+b30.2μmol/l)。

九、分別設(shè)計(jì)環(huán)引物和外引物濃度比例比為0、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1，由rnase-freewater補(bǔ)足差量，具體的，依次設(shè)計(jì)loopf+loopb為0μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l、loopf+loopb為0.2μmol/l與f3+b30.2μmol/l、loopf+loopb為0.4μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l、loopf+loopb為0.6μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l、loopf+loopb為0.8μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l、loopf+loopb為1.0μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l、loopf+loopb為1.2μmol/l與f3+b3為0.2μmol/l；其他成分的用量如表2所示，進(jìn)行鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)至少重復(fù)3次，產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化出鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)的最佳環(huán)引物和外引物比例。結(jié)果如圖23和24所示，由圖23和24可知，環(huán)引物與內(nèi)引物比例在3:1時(shí)，從開始至20min時(shí)的反應(yīng)速率最快，但最終擴(kuò)增效率并不佳；由電泳圖可知，當(dāng)不加入環(huán)引物(泳道1)時(shí)，并無(wú)擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，當(dāng)環(huán)引物與內(nèi)引物比例在4:1(泳道5)時(shí)，最終擴(kuò)增效率最佳，可使反應(yīng)有些進(jìn)行，故鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)的最佳環(huán)引物和外引物比例為4:1(loopf+loopb0.8μmol/l，f3+b30.2μmol/l)。

經(jīng)過反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化，最終確定ndrvrt-lamp的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表3所示：

表3ndrv鈣黃綠素可視化rt-lamp反應(yīng)優(yōu)化后反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

實(shí)施例6

對(duì)前面建立的ndrv鈣黃綠素可視化rt-lamp方法進(jìn)行敏感性分析，結(jié)果顯示(圖25、26)，該方法對(duì)drv-qy株基因組rna的最低檢測(cè)量為200fg，并且經(jīng)陽(yáng)性質(zhì)粒名感性驗(yàn)證結(jié)果一致。

綜上所述，本發(fā)明通過rt-lamp技術(shù)與鈣黃綠素可視化技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)新型鴨呼腸孤病毒進(jìn)行檢測(cè)，操作更加簡(jiǎn)單，檢測(cè)更加方便快捷，同時(shí)，敏感性比常規(guī)rt-pcr高約100倍，解決現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)新型鴨呼腸孤病毒檢測(cè)方法操作復(fù)雜、靈敏度不高、耗時(shí)長(zhǎng)、不能滿足現(xiàn)場(chǎng)及基層快速檢測(cè)需要的問題。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

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