順式還原酮加雙氧酶基因在提高水稻抗旱能力方面的應(yīng)用的制作方法

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于水稻整體生長(zhǎng)發(fā)育情況改進(jìn)的技術(shù)領(lǐng)域，涉及提高水稻抗旱能力方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

農(nóng)作物的產(chǎn)量會(huì)受到生長(zhǎng)環(huán)境的影響，目前全球作物產(chǎn)量由于土地缺水受到嚴(yán)重的制約，隨著全球氣候變暖，世界各國(guó)旱災(zāi)發(fā)生的頻率和范圍也在加大。水稻是我國(guó)重要糧食作物之一，我國(guó)是世界上最大的稻米生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，但在水稻的種植和生產(chǎn)中，需要耗費(fèi)大量的淡水資源，因此干旱已成為制約我國(guó)水稻生產(chǎn)的重要因素。

當(dāng)植物受到干旱脅迫環(huán)境時(shí)，植物會(huì)對(duì)脅迫產(chǎn)生應(yīng)答，誘導(dǎo)抗旱相關(guān)基因的表達(dá)從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育來(lái)起到保護(hù)作用，所以研究和挖掘植物抗旱基因，利用轉(zhuǎn)基因策略來(lái)提高作物的抗旱能力，培育抗旱作物品種，提高作物產(chǎn)量、確保糧食生產(chǎn)安全具有重要的意義。

研究表明植物激素在逆境脅迫中起到十分關(guān)鍵的作用，如ABA及乙烯。植物激素ABA在逆境脅迫中的功能已有較為明確的分析，但乙烯在脅迫中的調(diào)控通路還不清楚，目前有研究發(fā)現(xiàn)，脅迫會(huì)增加植物體內(nèi)乙烯的含量，如在干旱、高鹽、寒冷、水淹，機(jī)械損傷、寒冷等脅迫下都能誘導(dǎo)植物體內(nèi)乙烯含量的增加。

順式還原酮加雙氧酶(Acireductone Dioxygenase，ARD)是乙烯合成途徑中的一個(gè)重要的酶，首先，順式還原酮加雙氧酶催化順式還原酮生成2-Keto-4-methylthiobutyrate (KMTB)，KMTB進(jìn)而被催化形成甲硫氨酸(Met)。Met是乙烯合成途中的重要物質(zhì)，植物中乙烯的合成是首先通過(guò)Met催化形成S-腺苷甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸由ACC合成酶催化形成乙烯前體1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC)，ACC被氧化后形成乙烯^[1]，所以ARD位于乙烯合成的上游。在細(xì)菌里，Dai等^[2]發(fā)現(xiàn)在肺炎克雷伯菌(Klebsiela pneumoniae)中有兩種ARD酶，這兩種酶的蛋白質(zhì)構(gòu)成完全相同，由同一個(gè)基因編碼，但由于結(jié)合的金屬離子不同，卻行使了完全相反的功能。很多研究表明真核生物中參與甲硫氨酸循環(huán)的兩個(gè)ARD蛋白同樣行使著完全不同的功能，F(xiàn)e-ARD催化順式還原酮形成KMTB進(jìn)而促進(jìn)甲硫氨酸(Met)的合成，而Ni-ARD參與催化順式還原酮生成甲基丙酸乙酯，順式還原酮的消耗使甲硫氨酸的合成減少^[3]。目前OsARD1具體的生物學(xué)功能仍然未知，我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干旱可以誘導(dǎo)OsARD1的表達(dá)。我們進(jìn)一步構(gòu)建了OsARD1的過(guò)表達(dá)載體獲得了其過(guò)表達(dá)植株，發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)OsARD1能夠增強(qiáng)水稻的抗旱能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻抗旱基因OsARD1核苷酸序列，其特征在于OsARD1基因的核苷酸序列為SEQ ID No.1， OsARD1所編碼的氨基酸序列為SEQ ID No.2。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了OsARD1基因在提高水稻抗旱能力方面的應(yīng)用。

本發(fā)明公開(kāi)的水稻抗旱基因OsARD1核苷酸序列如下：

ATGGAGAACGAATTCCAGGATGGTAAGACGGAGGTGATAGAAGCATGGTACATGGATGATAGCGAAGAGGACCAGAGGCTTCCTCATCACCGCGAACCCAAAGAATTCATTCATGTTGATAAGCTTACAGAACTAGGAGTAATCAGCTGGCGCCTAAATCCTGATAACTGGGAGAATTGCGAGAACCTGAAGAGAATCCGCGAAGCCAGAGGTTACTCTTATGTGGACATTTGTGATGTGTGCCCAGAGAAGCTGCCAAATTATGAAACTAAGATCAAGAGTTTCTTTGAAGAACACCTGCATACCGATGAAGAAATACGCTATTGTCTTGAAGGGAGTGGATACTTTGATGTGAGAGACCAAAATGATCAGTGGATTCGTATAGCACTGAAGAAAGGAGGCATGATTGTTCTGCCTGCAGGGATGTACCACCGCTTTACGTTGGACACCGACAACTATATCAAGGCAATGCGACTGTTTGTTGGCGATCCTGTTTGGACACCCTACAACCGTCCCCATGACCATCTTCCTGCAAGAAAGGAGTTTTTGGCTAAACTTCTCAAGTCAGAAGGTGAAAATCAAGCAGTTGAAGGCTTCTGA

OsARD1所編碼的氨基酸序列為：

MENEFQDGKTEVIEAWYMDDSEEDQRLPHHREPKEFIHVDKLTELGVISWRLNPDNWENCENLKRIREARGYSYVDICDVCPEKLPNYETKIKSFFEEHLHTDEEIRYCLEGSGYFDVRDQNDQWIRIALKKGGMIVLPAGMYHRFTLDTDNYIKAMRLFVGDPVWTPYNRPHDHLPARKEFLAKLLKSEGENQAVEGF。

附圖說(shuō)明

圖1為 OsARD1的表達(dá)模式分析；其中A. OsARD1的組織特異性分析；M：莖頂端分生組織；Root：根；Leaf：葉片；LS：葉鞘；Stem：莖；Panicle1：0.5-1 cm長(zhǎng)幼穗； Panicle1：1-2cm長(zhǎng)幼穗；Panicle3：3-4cm長(zhǎng)幼穗；Panicle4：5-6cm長(zhǎng)幼穗；Panicle5：10cm長(zhǎng)幼穗；Panicle6：抽穗開(kāi)花期的幼穗；C. OsARD1在模擬干旱滲透脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)分析，空心框表示光期，實(shí)心框表示暗期；

圖2為OsARD1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建；其中A.過(guò)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)；LB：T-DNA的左邊界；NPTⅡ：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性標(biāo)記基因；2×35S：兩個(gè)串聯(lián)排列的花椰菜病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子；OsARD1：OsARD1的全長(zhǎng)ORF片段；RB：T-DNA的右邊界；B.目的基因OsARD1全長(zhǎng)ORF片段的PCR擴(kuò)增；C.過(guò)表達(dá)重組載體酶切鑒定，1-3為3個(gè)不同的單克??；M為Marker標(biāo)記；

圖3為 OsARD1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的表型及表達(dá)分析；其中A. T₀代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中NPTⅡ基因的PCR檢測(cè)。1-22為獲得的40株中的22個(gè)轉(zhuǎn)基因單株，P: pCAMBIA2300空載體質(zhì)粒； WT: 轉(zhuǎn)入pCAMBIA2300空載體對(duì)照；CK: 正常未轉(zhuǎn)化的野生型中花11；所用引物為載體中NPTⅡ基因特異引物；B. 部分T₀代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)分析；WT為空載體對(duì)照轉(zhuǎn)基因植株；1-18為1-6號(hào)株系的18株過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株； C. T₁代轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)分析。WT為空載對(duì)照體轉(zhuǎn)基因植株，＃2~#6為4個(gè)獨(dú)立的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株； D. 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表型。WT為空載對(duì)照體轉(zhuǎn)基因植株；OsARD1-OV為過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；

圖4為干旱及PEG處理情況下表型分析；其中A. 脫水處理前的表型；B. 脫水處理2h后的表型；C. 5% PEG6000滲透脅迫處理6天后表型；對(duì)照組為未加PEG6000的Arga培養(yǎng)基，處理組為加入5% PEG6000的Arga培養(yǎng)基中；WT為轉(zhuǎn)入空載體的轉(zhuǎn)基因植株，OsARD1-OV為過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所用原料及試劑均有市售。粳稻品種中花11有市售。

實(shí)施例1

1 材料和方法

1.1 材料

粳稻品種中花11（Oryza sativa L. ssp. Japonica cv. Zhonghua 11）及其轉(zhuǎn)基因植株用于本研究，田間材料均種植于天津市天津師范大學(xué)試驗(yàn)田，田間保持日常管理。用于處理的材料均種植于人工氣候箱中（Climacell MMM，德國(guó)）。

1.2 OsARD1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

OsARD1目的基因用RT-PCR方法獲得，總RNA從60天的成熟水稻葉片中提取，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Vazyme,南京）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，用OsARD1特異性引物

OsARD1-F: 5’-TTAggtaccTTCCACCCCGCAATCCACAT-3’

和OsARD1-R: 5’-GTTgtcgacGTGCAGGAGCCCAACAAAAC-3’（小寫(xiě)字母部分為酶切位點(diǎn)序列）進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得 OsARD1完整的ORF（Open Reading Frame）。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 1 min；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，所用DNA聚合酶為高保真特性的酶（Vazyme,南京）。目的片段凝膠檢測(cè)正確后進(jìn)行純化回收，然后與pCAMBIA2300空載體進(jìn)行連接，獲得重組載體。對(duì)重組載體進(jìn)行酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（EHA105）中，通過(guò)農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得OsARD1 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，同時(shí)轉(zhuǎn)入pCAMBIA2300空載體作為對(duì)照，轉(zhuǎn)化方法參照Hiei等的轉(zhuǎn)化方法(Hiei et al., 1994)。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)

待T₀代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在田間長(zhǎng)到約60天后，我們對(duì)其進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因分子檢測(cè)。用CTAB法(張鳳娟等, 2004)提取葉片基因組DNA，然后用pCAMBIA2300載體中獨(dú)有的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（NPTⅡ）對(duì)獲得的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)。

所用引物為NPTⅡ-F: 5’-TTCTCACTGAAGCGGGAAGGG-3’

和NPTⅡ-R: 5’-GCGATACCGTAAAGCACCAGG-3’,

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 4 min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)。

1.4 缺水處理及PEG滲透脅迫處理

缺水處理實(shí)驗(yàn)，將催芽后的野生型和OsARD1-OV過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因種子種植在營(yíng)養(yǎng)液里生長(zhǎng)，14天的水稻幼苗撤去營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行缺水處理，觀察記錄表型。

對(duì)于滲透脅迫實(shí)驗(yàn)是將催芽后的種子種在瓊脂（Arga）培養(yǎng)基中，將催芽后的野生型和OsARD1-OV過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因種子分別種在含有5% PEG6000（滲透勢(shì)為-0.05 Mpa）(Michel and Kaufmann et al.,1973)及無(wú)PEG6000的Arga培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并進(jìn)行表型觀察記錄。

滲透脅迫處理及表達(dá)分析

滲透脅迫：將營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)的14天大小的野生型幼苗，轉(zhuǎn)入含有20% PEG6000營(yíng)養(yǎng)液(滲透勢(shì)為-0.49 Mpa) (Michel and Kaufmann et al.,1973)中進(jìn)行處理，以在正常營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)的幼苗作為對(duì)照，分別提取處理0、6、12、24、48、72小時(shí)后處理組和對(duì)照組幼苗的總RNA進(jìn)行表達(dá)分析。

非生物脅迫處理后提取總RNA, 經(jīng)DNaseⅠ進(jìn)行處理，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用RT-PCR方法分析不同非生物脅迫處理下目的基因的表達(dá)規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsARD1的表達(dá)模式分析

為了研究OsARD1在水稻不同器官中的表達(dá)，我們分別提取了水稻野生型中花11的莖頂端分生組織（SAM）、根、莖、葉片、葉鞘和不同時(shí)期的穗的總 RNA，通過(guò)RT-PCR方法分析目的基因的表達(dá)。結(jié)果顯示OsARD1 在各個(gè)組織器官中均有表達(dá)，但在不同器官中的表達(dá)量有明顯差異，OsARD1在根和已經(jīng)成熟開(kāi)花的幼穗（Panicle 6）中高表達(dá)（圖1-A），但在其它組織器官中表達(dá)量低（圖1-A）。我們進(jìn)一步分析了OsARD1在不同時(shí)期水稻葉片中表達(dá)情況，結(jié)果顯示，OsARD1在幼嫩的葉片中表達(dá)量較低，在成熟的葉片中表達(dá)量稍高，而在124天水稻衰老的葉片中表達(dá)量最高（圖1-B），表明OsARD1在植株成熟的組織高表達(dá)，在植株的衰老期被明顯的誘導(dǎo)。

上述時(shí)空特異性表達(dá)結(jié)果表明，OsARD1在衰老的葉片中表達(dá)明顯提高，這提示我們OsARD1的表達(dá)可能受某些環(huán)境因素的誘導(dǎo)，因此我們用2周大小的野生型中花11幼苗進(jìn)行模擬干旱PEG滲透脅迫處理，結(jié)果表明OsARD1的表達(dá)受到強(qiáng)烈的誘導(dǎo)，在處理6h后OsARD1的表達(dá)明顯升高，處理12h后達(dá)到峰值（圖1-C）。上述結(jié)果表明 OsARD1的表達(dá)明顯受PEG滲透脅迫誘導(dǎo)，預(yù)示OsARD1可能與水稻的耐旱密切相關(guān)。

2.2 OsARD1 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

從水稻成熟葉片中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后利用RT-PCR的方法獲得OsARD1的全長(zhǎng)ORF，經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)目的片段大小與預(yù)期相符（圖2-B）。將凝膠純化回收后的目的片段與含有2×35S啟動(dòng)子的空載體pCAMBIA2300經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ 和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，利用T4 DNA連接酶16 ℃過(guò)夜連接獲得重組載體。重組載體經(jīng)酶切檢測(cè)，酶切出預(yù)期的目的條帶（圖2-C），表明OsARD1的全長(zhǎng)ORF片段已成功的連入過(guò)表達(dá)空載體中，獲得最終的過(guò)表達(dá)載體（圖2-A）。為了進(jìn)一步確保載體的正確性，我們將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中以備后續(xù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。

2.3 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的獲得及表達(dá)分析

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將重組載體轉(zhuǎn)入野生型中花11中獲得 OsARD1 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)轉(zhuǎn)化獲得了6個(gè)獨(dú)立株系共40株T₀代轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)轉(zhuǎn)基因分子檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)有37株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(圖3-A)，田間觀察過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株與空載體對(duì)照表型，二者沒(méi)有明顯差異。我們進(jìn)一步提取了過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，用RT-PCR方法分析了6個(gè)獨(dú)立株系的18個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中目的基因OsARD1的表達(dá)，結(jié)果表明，OsARD1的表達(dá)在不同株系過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)明顯提高(圖3-B)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因植株中起到了過(guò)量表達(dá)的作用，正常工作。收獲T₀代轉(zhuǎn)基因植株種子后，來(lái)年我們選取了4個(gè)過(guò)表達(dá)株系在大田里進(jìn)行種植獲得T₁代轉(zhuǎn)基因株系，并檢測(cè)了T₁代植株中目的基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)OsARD1在4個(gè)過(guò)表達(dá)株系中表達(dá)量均明顯提高(圖3-C)，進(jìn)一步表明構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體能夠正常工作，而且可以穩(wěn)定的遺傳到后代。進(jìn)一步觀察T₁代轉(zhuǎn)基因植株的表型，與對(duì)照相比，仍未見(jiàn)明顯差異(圖3-D)。由于OsARD1干旱滲透脅迫的誘導(dǎo)，我們推測(cè)OsARD1可能與干旱脅迫相關(guān)，因此我們接下來(lái)用干旱缺水和PEG模擬干旱處理觀察轉(zhuǎn)基因植株的表型。

2.4 過(guò)表達(dá)OsARD1增強(qiáng)了水稻的抗旱能力

由于OsARD1受機(jī)械損傷、干旱及滲透脅迫的誘導(dǎo)，我們推測(cè)OsARD1可能與非生物脅迫相關(guān)，因此我們用干旱缺水和PEG模擬干旱處理過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株及空載體對(duì)照轉(zhuǎn)基因植株，觀察過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株及對(duì)照的表型，以揭示OsARD1的可能功能。首先將水培生長(zhǎng)的14天的水稻幼苗進(jìn)行缺水處理，處理1h后，對(duì)照植株葉片開(kāi)始卷曲，而過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株沒(méi)有明顯變化，處于正常狀態(tài)。處理2h后，對(duì)照植株葉片已經(jīng)完全下垂并且皺縮卷曲呈針狀，表現(xiàn)出了嚴(yán)重的缺水癥狀。但是過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)正常，葉片不僅沒(méi)有下垂，而且仍處于舒展?fàn)顟B(tài)(圖4-A)，這一結(jié)果表明過(guò)量表達(dá)OsARD1明顯增強(qiáng)了水稻抗旱耐缺水能力。此外，我們將催芽后的對(duì)照和 OsARD1 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因種子分別種在含有5% PEG6000及不含PEG6000的瓊脂培養(yǎng)基中。處理6天后發(fā)現(xiàn)，不含PEG的Arga培養(yǎng)基中對(duì)照和過(guò)表達(dá)的幼苗生長(zhǎng)情況沒(méi)有明顯的差別(圖4-B)，但在PEG處理組中，對(duì)照幼苗根的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，而過(guò)表達(dá)植株幼苗根的生長(zhǎng)受到的抑制較小，根長(zhǎng)明顯長(zhǎng)于對(duì)照植株(圖4-B)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)植株對(duì)PEG處理的耐受力更強(qiáng)，表明過(guò)量表達(dá)OsARD1明顯提高了水稻對(duì)滲透脅迫的耐受能力。

參考文獻(xiàn)

以上是本發(fā)明所引用的參考文獻(xiàn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津師范大學(xué)

<120> 順式還原酮加雙氧酶基因在提高水稻抗旱能力方面的應(yīng)用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggagaacg aattccagga tggtaagacg gaggtgatag aagcatggta catggatgat 60

agcgaagagg accagaggct tcctcatcac cgcgaaccca aagaattcat tcatgttgat 120

aagcttacag aactaggagt aatcagctgg cgcctaaatc ctgataactg ggagaattgc 180

gagaacctga agagaatccg cgaagccaga ggttactctt atgtggacat ttgtgatgtg 240

tgcccagaga agctgccaaa ttatgaaact aagatcaaga gtttctttga agaacacctg 300

cataccgatg aagaaatacg ctattgtctt gaagggagtg gatactttga tgtgagagac 360

caaaatgatc agtggattcg tatagcactg aagaaaggag gcatgattgt tctgcctgca 420

gggatgtacc accgctttac gttggacacc gacaactata tcaaggcaat gcgactgttt 480

gttggcgatc ctgtttggac accctacaac cgtccccatg accatcttcc tgcaagaaag 540

gagtttttgg ctaaacttct caagtcagaa ggtgaaaatc aagcagttga aggcttctga 600

<210> 2

<211> 199

<212> PRT

<213> 順式還原酮加雙氧酶

<400> 2

Met Glu Asn Glu Phe Gln Asp Gly Lys Thr Glu Val Ile Glu Ala Trp

1 5 10 15

Tyr Met Asp Asp Ser Glu Glu Asp Gln Arg Leu Pro His His Arg Glu

20 25 30

Pro Lys Glu Phe Ile His Val Asp Lys Leu Thr Glu Leu Gly Val Ile

35 40 45

Ser Trp Arg Leu Asn Pro Asp Asn Trp Glu Asn Cys Glu Asn Leu Lys

50 55 60

Arg Ile Arg Glu Ala Arg Gly Tyr Ser Tyr Val Asp Ile Cys Asp Val

65 70 75 80

Cys Pro Glu Lys Leu Pro Asn Tyr Glu Thr Lys Ile Lys Ser Phe Phe

85 90 95

Glu Glu His Leu His Thr Asp Glu Glu Ile Arg Tyr Cys Leu Glu Gly

100 105 110

Ser Gly Tyr Phe Asp Val Arg Asp Gln Asn Asp Gln Trp Ile Arg Ile

115 120 125

Ala Leu Lys Lys Gly Gly Met Ile Val Leu Pro Ala Gly Met Tyr His

130 135 140

Arg Phe Thr Leu Asp Thr Asp Asn Tyr Ile Lys Ala Met Arg Leu Phe

145 150 155 160

Val Gly Asp Pro Val Trp Thr Pro Tyr Asn Arg Pro His Asp His Leu

165 170 175

Pro Ala Arg Lys Glu Phe Leu Ala Lys Leu Leu Lys Ser Glu Gly Glu

180 185 190

Asn Gln Ala Val Glu Gly Phe

195