本發(fā)明涉及培養(yǎng)基，特別涉及一種含有豆粕提取物的發(fā)酵培養(yǎng)基，以及所述培養(yǎng)基在促進(jìn)高山被孢霉產(chǎn)EPA中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
EPA(全順式-5、8、11、l4、17-二十碳五烯酸)是一種ω-3系列長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，具有抗凝血、抗癌、抗炎、防心血管病、降血脂等特殊生理功能，在醫(yī)藥保健品、食品和飼料行業(yè)均有較多的應(yīng)用。EPA的生物來(lái)源主要包括海洋魚(yú)類和微生物發(fā)酵生產(chǎn)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)EPA原料豐富、周期短、價(jià)格便宜、占地面積小、不受氣候影響等，越來(lái)越受關(guān)注。目前通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)EPA的商業(yè)化產(chǎn)品是杜邦公司報(bào)道的New HarvestTMEPAoil和salmon，所用菌株是解脂耶氏酵母基因工程菌。高山被孢霉油脂含量豐富，目前已是花生四烯酸(AA)的商業(yè)化生產(chǎn)菌。野生型高山被孢霉需在低溫下合成EPA，且產(chǎn)量較低。中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN2016101289357公開(kāi)了一株高產(chǎn)EPA的重組高山被孢霉MA-oPaFADS17-3(它同樣被命名為CCFM695)，該菌株是通過(guò)在野生型高山被孢酶中過(guò)表達(dá)來(lái)源于瓜果腐霉的ω-3脂肪酸脫飽和酶，最終得到成功表達(dá)候選ω-3脂肪酸脫飽和酶的高山被孢霉重組菌株。據(jù)記載，將該重組菌接種于Broth培養(yǎng)基中，在28℃200rpm搖床培養(yǎng)7d，測(cè)得其EPA(C20:5)的產(chǎn)量達(dá)到617.1mg/L，占總脂肪(TFA)的18.7％，而且表現(xiàn)出高效率地將AA催化轉(zhuǎn)化為EPA，轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.9％。為進(jìn)一步提高其EPA產(chǎn)量，本發(fā)明對(duì)其培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，在降低發(fā)酵成本的前提下通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成配方，進(jìn)一步提高高山被孢霉CCFM695在常溫條件下的EPA產(chǎn)量。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供豆粕提取物在促進(jìn)高山被孢霉產(chǎn)EPA中的應(yīng)用。
進(jìn)一步地，本發(fā)明提供豆粕提取物在高山被孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基中作為氮源的應(yīng)用。
在本發(fā)明中，豆粕提取物的制備方法是：以重量計(jì)，取豆粕1份，加入5份水，煮沸并保持沸騰10-30min；所得產(chǎn)物用雙層紗布過(guò)濾，棄去濾渣，所得濾液冷卻至室溫，即為所述豆粕提取物。
優(yōu)選地，所述豆粕提取物在高山被孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度是10-70g/L。
本發(fā)明還提供一種發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.0-8.0；
所述磷酸鹽選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉中的一種。
在本發(fā)明中，所述淀粉是玉米淀粉、可溶性淀粉或馬鈴薯淀粉。
本發(fā)明還提供上述發(fā)酵培養(yǎng)基作為高山被孢霉產(chǎn)EPA的培養(yǎng)基的應(yīng)用。
以下詳細(xì)解釋本發(fā)明的技術(shù)方案。
本發(fā)明以中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN 2016101289357公開(kāi)的高山被孢霉MA-oPaFADS17-3(它同樣被命名為CCFM695)作為對(duì)象。該菌株是通過(guò)過(guò)表達(dá)來(lái)源于瓜果腐霉的ω-3脫飽和酶oPaFADS17基因的重組高山被孢霉，該菌株于2015年10月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.11394。
根據(jù)記載，該菌株是以Broth培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成為：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/L磷酸二氫鉀，0.25g/L七水硫酸鎂，10g/L硝酸鉀，余量為水，pH 6.0。
本發(fā)明是通過(guò)如逐步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，試圖進(jìn)一步提高高山被孢霉CCFM695的EPA產(chǎn)量。
優(yōu)化過(guò)程如下：
A、菌種活化
將高山被孢霉CCFM695以1％接種量接種到活化培養(yǎng)基中，在28℃200rpm的轉(zhuǎn)速下活化36h，活化兩代；
活化培養(yǎng)基的組成為：20g/L葡萄糖、5g/L酵母提取物(Yeast extract)、10g/L硝酸鉀、1g/L磷酸二氫鉀、0.25g/L七水合硫酸鎂，采用1M HCl和1M NaOH水溶液將其pH調(diào)節(jié)至6.0，再在溫度115℃下滅菌20min，得到所述的活化培養(yǎng)基。
B、葡萄糖濃度對(duì)EPA產(chǎn)量的影響
將活化兩代的高山被孢霉CCFM695按1％的接種量接種到葡萄糖濃度分別為40g/L、50g/L和60g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度28℃的室溫條件下，以200rpm的轉(zhuǎn)速發(fā)酵7天，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，分別測(cè)定所得發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酸組成，確認(rèn)碳源(即葡萄糖)的合理濃度。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖(不同濃度)、5g/L酵母提取物(Yeast extract)、10g/L硝酸鉀、1g/L磷酸二氫鉀、0.25g/L七水合硫酸鎂，采用1M HCl和1M NaOH水溶液將其pH調(diào)節(jié)至6.0，再在溫度115℃下滅菌20min，得到所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。
C、碳源的優(yōu)化
確認(rèn)碳源(即葡萄糖)的合理濃度后，分別以玉米淀粉、可溶性淀粉、馬鈴薯淀粉及它們的混合物，以及甘油作為碳源，替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他培養(yǎng)條件同步驟B，分別測(cè)定所得發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酸組成，確認(rèn)碳源的合理選擇。
D、有機(jī)氮源的優(yōu)化
確認(rèn)碳源的合理濃度和具體選擇后，分別以10g/L、30g/L、50g/L、70g/L豆粕提取物作為有機(jī)氮源，替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物(Yeast extract)，其他培養(yǎng)條件同步驟B，分別測(cè)定所得發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酸組成，確認(rèn)有機(jī)氮源的合理選擇。
其中，所述豆粕提取物的制備方法是：稱取豆粕適量，按豆粕與水重量比1：5分別加水后煮沸并保持沸騰20min，所得產(chǎn)物用雙層紗布過(guò)濾，棄去濾渣，所得濾液冷卻至室溫，即為所述豆粕提取物。
在本發(fā)明中，豆粕應(yīng)當(dāng)理解為大豆提取豆油后得到的副產(chǎn)品，其呈不規(guī)則碎片狀，顏色為淺黃色至淺褐色，味道具有烤大豆香味。豆粕是市場(chǎng)上能夠購(gòu)買獲得的產(chǎn)品，例如中儲(chǔ)糧鎮(zhèn)江糧油有限公司銷售的豆粕產(chǎn)品。
E、無(wú)機(jī)氮源的優(yōu)化
確認(rèn)碳源和有機(jī)氮源后，以硝酸鉀作為發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)氮源，分別設(shè)置添加濃度設(shè)為0g/L、5g/L、10g/L，其他培養(yǎng)條件同步驟B，分別測(cè)定所得發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酸組成，確認(rèn)無(wú)機(jī)氮源的合理選擇。
F、pH值的優(yōu)化
通過(guò)鹽酸和/或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別設(shè)為5、6、7、8、9，培養(yǎng)條件同步驟B，分別測(cè)定所得發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酸組成，確認(rèn)pH值的合理選擇。
經(jīng)過(guò)上述試驗(yàn)和結(jié)果比較，本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)通過(guò)合理選擇碳源和有機(jī)氮源能夠大幅提高高山被孢霉CCFM695在常溫環(huán)境下的EPA產(chǎn)量，由現(xiàn)有技術(shù)記載的617.1mg/L提高至1.7g/L，為現(xiàn)有技術(shù)的275.5％。而且所選用的碳氮源為葡萄糖和豆粕，二者市場(chǎng)價(jià)格較低且容易獲得，能夠有效降低發(fā)酵培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本。
【具體實(shí)施方式】
通過(guò)下述實(shí)施例將能夠更好地理解本發(fā)明。
在本發(fā)明中，如無(wú)特殊說(shuō)明，用于表示濃度的“％”均為重量百分比，或“份”均為重量份。
本發(fā)明使用的培養(yǎng)設(shè)備是上海知楚儀器有限公司銷售的振蕩培養(yǎng)箱(型號(hào):ZQZY-70B)。
實(shí)施例1：發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的確定
將高山被孢霉CCFM695以1％接種量接種到活化培養(yǎng)基中，在28℃200rpm轉(zhuǎn)速條件下活化36h，活化兩代；
活化培養(yǎng)基的組成為：20g/L葡萄糖、5g/L酵母提取物(Yeast extract)、10g/L硝酸鉀、1g/L磷酸二氫鉀、0.25g/L七水合硫酸鎂，采用1M HCl和1M NaOH將其水溶液的pH調(diào)節(jié)至6.0，再在溫度115℃下滅菌20min，得到所述的活化培養(yǎng)基。
在現(xiàn)有技術(shù)記載的Broth培養(yǎng)基(20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/L磷酸二氫鉀，0.25g/L七水硫酸鎂，10g/L硝酸鉀，余量為水，pH 6.0。)的基礎(chǔ)上，考察提高葡萄糖濃度是否有利于高山被孢霉生長(zhǎng)和提高脂肪酸產(chǎn)量，所以將其中的葡萄糖濃度設(shè)置為40g/L、50g/L、60g/L(培養(yǎng)基中的其他組分不變)，將實(shí)驗(yàn)菌株高山被孢霉MA-oPaFADS17在28℃條件下常溫發(fā)酵7天，測(cè)定樣品中脂肪酸含量。
所述的脂肪酸測(cè)定方法參考文獻(xiàn)：
Wang L,Chen W,Feng Y,et al.Genome characterization of the oleaginous fungusMortierella alpina.Plos One,2011,6(12):e28319.
表1不同初始葡萄糖濃度對(duì)高山被孢霉CCFM695發(fā)酵產(chǎn)EPA的影響
注：表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法進(jìn)行著性分析。
結(jié)果顯示，CCFM695菌株在常溫條件下可積累大量的EPA，其結(jié)果與現(xiàn)有技術(shù)記載的一致。與CN 2016101289357記載的數(shù)據(jù)相比，適當(dāng)提高葡萄糖濃度有利于總脂肪酸(TFA)和EPA產(chǎn)量的提高，該提高幅度低于預(yù)期。其中，過(guò)高或過(guò)低的葡萄糖濃度都不利于EPA產(chǎn)量的提高，50g/L的葡萄糖濃度最適宜該菌株在搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)EPA。
實(shí)施例2：碳源種類的確定
分別以50g/L的玉米淀粉、可溶性淀粉、馬鈴薯淀粉或甘油替代實(shí)施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，還設(shè)置葡萄糖和可溶淀粉各25g的組別，其他組成及條件不變，將實(shí)驗(yàn)菌株高山被孢霉CCFM695在28℃條件下常溫發(fā)酵7天，測(cè)定樣品中脂肪酸含量。
表2不同碳源種類對(duì)高山被孢霉CCFM695發(fā)酵產(chǎn)EPA的影響
注：表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法進(jìn)行著性分析。
結(jié)果顯示，高山被孢霉CCFM695可以不同程度利用多種淀粉作底物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)脂，其中玉米淀粉的效果最佳，EPA產(chǎn)量最高達(dá)到1237mg/L且總脂肪酸(TFA)含量最高，顯著優(yōu)于其他組別，而可溶性淀粉的效果也顯著高于現(xiàn)有技術(shù)達(dá)到935mg/L，這主要是因?yàn)橛衩椎矸刍蚩扇苄缘矸劬梢燥@著提高菌體的生物量的原因。但以可溶性淀粉作為碳源時(shí)，明顯看到其總脂肪酸含量較低，這可能是由于可溶性淀粉有利于生物量的提高而不利于脂肪酸的積累，因此其綜合效果不如玉米淀粉。而馬鈴薯淀粉、葡萄糖與可溶性淀粉的混合物以及甘油作為碳源時(shí)，EPA產(chǎn)量則沒(méi)有顯著變化。
實(shí)施例3：有機(jī)氮源的確定
在培養(yǎng)基中碳源為50g/L的葡萄糖的前提下，對(duì)比有機(jī)氮源酵母提取物(Yeastextract，價(jià)格昂貴)與豆粕提取物(廉價(jià))對(duì)高山被孢霉產(chǎn)脂肪酸的影響，其中酵母萃取物在培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，豆粕提取物在培養(yǎng)基中的濃度為50g/L，其他組成及條件不變，將實(shí)驗(yàn)菌株高山被孢霉CCFM695在28℃條件下常溫發(fā)酵7天，測(cè)定樣品中脂肪酸含量。
表3不同有機(jī)氮源對(duì)高山被孢霉CCFM695發(fā)酵產(chǎn)EPA的影響
注：表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法進(jìn)行著性分析。
進(jìn)一步設(shè)定豆粕提取物的不同添加濃度，分別為10g/L、30g/L、50g/L與70g/L，其他組成及條件不變，將實(shí)驗(yàn)菌株高山被孢霉CCFM695在28℃條件下常溫發(fā)酵7天，測(cè)定樣品中脂肪酸含量。
表4不同豆粕提取物濃度對(duì)高山被孢霉CCFM695發(fā)酵產(chǎn)EPA的影響
注：表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法進(jìn)行著性分析。
結(jié)果表明，相比昂貴的酵母萃取物，豆粕提取物作為有機(jī)氮源使用時(shí)，不僅價(jià)格低廉，還意外地發(fā)現(xiàn)其對(duì)菌體生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用，EPA產(chǎn)量大副提高，高達(dá)1551mg/L。
此外，當(dāng)用酵母提取物作為有機(jī)氮源時(shí)，AA和EPA的產(chǎn)量比約為1:1，表明AA轉(zhuǎn)化為EPA的轉(zhuǎn)化率約50％(轉(zhuǎn)化率＝EPA產(chǎn)量/AA+EPA總量*100％)，而以豆粕提取物作有機(jī)氮源時(shí)，EPA的產(chǎn)量明顯高于AA產(chǎn)量，約為2倍，轉(zhuǎn)化率達(dá)到61.4％，表明豆粕提取物有利于促進(jìn)高山被孢霉從AA向EPA的催化轉(zhuǎn)化，更適合EPA的工業(yè)化生產(chǎn)。
當(dāng)中，豆粕提取物濃度為30-70g/L時(shí)均表現(xiàn)出明顯的增產(chǎn)效應(yīng)，其中以50g/L效果最佳，EPA產(chǎn)量最高。
實(shí)施例4：無(wú)機(jī)氮源濃度的確定
在50g/L葡萄糖作碳源、5g/L酵母萃取物作氮源的情況下，設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)氮源硝酸鉀的不同添加濃度，分別設(shè)為0g/L、5g/L、10g/L，其他培養(yǎng)條件不變，將實(shí)驗(yàn)菌株高山被孢霉CCFM695在28℃條件下常溫發(fā)酵7天，測(cè)定樣品中脂肪酸含量。
表5不同硝酸鉀濃度對(duì)高山被孢霉CCFM695發(fā)酵產(chǎn)EPA的影響
注：表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法進(jìn)行著性分析。
與現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)的一致，氮源限制有利于高山被孢霉產(chǎn)脂一致，通過(guò)調(diào)節(jié)不同的無(wú)機(jī)氮源的濃度可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中添加低濃度的無(wú)機(jī)氮源時(shí)，可適當(dāng)提高EPA的產(chǎn)量。
實(shí)施例5：pH值的確定
考察培養(yǎng)基pH值對(duì)菌株EPA產(chǎn)量的影響。分別用1M鹽酸和1M氫氧化鈉溶液將Broth基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值調(diào)為5、6、7、8、9，其他條件不變，將實(shí)驗(yàn)菌株高山被孢霉CCFM695在28℃條件下常溫發(fā)酵7天，測(cè)定樣品中脂肪酸含量。
表8不同pH值對(duì)高山被孢霉CCFM695發(fā)酵產(chǎn)EPA的影響
注：表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法進(jìn)行著性分析。
從表格數(shù)據(jù)可以看出，pH6-8時(shí)均有異于菌株的發(fā)酵產(chǎn)脂肪，表現(xiàn)為產(chǎn)量高于現(xiàn)有技術(shù)的記載，其中，pH＝6時(shí)效果最優(yōu)，EPA產(chǎn)量最高。
實(shí)施例6：正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
將碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源三個(gè)對(duì)EPA合成影響較大的三個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)表格如下：
表9影響EPA合成的因素和水平
表10SPSS設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表11正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析
注：K值表示A、B、C的某一水平對(duì)應(yīng)的EPA含量
Rj值為kmax-kmin
根據(jù)極值R可以判斷出，RA>RB>RC，所以碳源種類對(duì)EPA的影響最大，有機(jī)氮源豆粕提取物的濃度次之，無(wú)機(jī)氮源KNO3濃度的影響在三者中最小。通過(guò)比較k值的大小，可以得出，最優(yōu)發(fā)酵方案為A1B2C2，即碳源為葡萄糖，豆粕濃度50g/L，KNO3濃度5g/L，在此條件下，EPA產(chǎn)量最高可達(dá)1733.5mg/L。比原始條件(600mg/L)下提高了2.9倍。
綜上所述，本發(fā)明通過(guò)合理選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和有機(jī)氮源，以葡萄糖或淀粉(特別是玉米淀粉)作為碳源、且以豆粕提取物作為有機(jī)氮源，實(shí)現(xiàn)大幅提高高山被孢霉CCFM695在常溫環(huán)境下的EPA產(chǎn)量至1.7g/L，為現(xiàn)有技術(shù)的275.5％。而且所選用原料的市場(chǎng)價(jià)格較低且容易獲得，能夠有效降低發(fā)酵培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本。