本發(fā)明屬于醫(yī)藥保健、食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體屬于一種從蛹蟲草培養(yǎng)基中提取及連續(xù)富集多糖的方法。
背景技術(shù)：
蛹蟲草[Cordyceps militaris (Fr) Link.]，又名北冬蟲夏草、北蟲草，屬子囊菌亞門、核菌綱、球殼目、麥角菌科、蟲草屬真菌。其為蟲草屬的模式種，分布廣泛，為世界各國學(xué)者所認(rèn)識(shí)和接受且在人工條件下育成了完整子座而且蛹蟲草具有更高含量的蟲草多糖和蟲草素等有效成分，其獨(dú)特藥理作用已日益引起藥學(xué)界的高度重視。由于蛹蟲草具有以上優(yōu)點(diǎn)，成為蟲草屬中藥用蟲草菌的佼佼者。蛹蟲草人工培養(yǎng)技術(shù)的成功，為我國開辟了名貴藥材產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的又一片天空。目前，國內(nèi)蛹蟲草的人工培養(yǎng)已進(jìn)入到產(chǎn)業(yè)化階段。
蟲草多糖作為蛹蟲草的主要活性成分之一，是蛹蟲草中含量最高的藥理活性物質(zhì)，含量可以達(dá)到10％，是一種很有價(jià)值的潛在新型藥食兩用資源。蟲草多糖是由甘露糖、蟲草素、腺苷、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、巖藻糖等組成的多聚糖。它的抗癌活性和免疫活性引起人們的極大興趣，另外冬蟲夏草還用于治肺結(jié)核、氣短喘咳、陽痿、夢遺、自汗盜汗、腰膝酸痛等。
目前在工業(yè)生產(chǎn)中蟲草多糖主要從蛹蟲草子實(shí)體中提取。但是由于蟲草子實(shí)體的生產(chǎn)成本高，從而導(dǎo)致蟲草多糖的生產(chǎn)成本極高。如今蛹蟲草的人工栽培技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)，取得了一定的經(jīng)濟(jì)效益，隨之產(chǎn)生的問題是大量的培養(yǎng)基（下腳料）廢棄，發(fā)酸變臭，造成環(huán)境污染。也有研究者將其作為動(dòng)物飼料，但沒有對其進(jìn)行綜合利用。根據(jù)我們前期的測定發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草固體培養(yǎng)基中充滿菌絲，其中富含大量的蟲草多糖，但因沒有成熟的工藝對其中的有效成份進(jìn)行提取分離，通常在培養(yǎng)結(jié)束后固體培養(yǎng)基都被作為廢物棄掉。
目前用蟲草多糖的提取方法主要有熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法、超聲波提取法、微波提取法等，上述這些方法由于存在蟲草多糖溶出率低、產(chǎn)品雜質(zhì)多、工藝復(fù)雜、生產(chǎn)周期長等缺點(diǎn)，使其工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模臨床應(yīng)用收到限制，而利用淀粉酶、蛋白質(zhì)和纖維素酶等復(fù)合酶處理等綠色提取技術(shù)對蛹蟲草菌絲體或培養(yǎng)基進(jìn)行前處理，通過對酶法提取條件進(jìn)行控制，可最大程度降低其中淀粉、纖維素等對蟲草多糖提取的影響，也可最大程度提高蟲草多糖的得率和純度，同時(shí)排除淀粉、纖維素等非功能性多糖對產(chǎn)品質(zhì)量的影響具有提取條件溫和、提取率高等優(yōu)點(diǎn)。而且最新研究表明，蟲草等真菌多糖的藥理活性與其結(jié)構(gòu)、相對分子量等密切相關(guān)，一般分子量在30-250 KDa的大分子組分才具有較強(qiáng)的生物活性。然而，傳統(tǒng)蟲草多糖的提取方法，如水提醇沉法等，得到的粗多糖組成較為復(fù)雜，分子量范圍廣，而且多糖經(jīng)乙醇作用后，高級(jí)結(jié)構(gòu)很容易遭到破壞，很難保證每批次產(chǎn)品的質(zhì)量和療效，因此，對具有生物活性的多糖進(jìn)行有效地提取和富集，對控制蟲草多糖產(chǎn)品的質(zhì)量具有十分重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對背景技術(shù)提出的不足，本發(fā)明研究一種從蛹蟲草培養(yǎng)基中提取及連續(xù)富集多糖的方法，其目的在于：本方法利用酶法等綠色提取技術(shù)聯(lián)合功能型膜分離技術(shù)制備蟲草多糖，即保證了蟲草多糖的純度和品質(zhì)，又實(shí)現(xiàn)了快速富集濃縮，并保證了多糖的生物活性。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案：
一種從蛹蟲草培養(yǎng)基中提取及連續(xù)富集多糖的方法，包括如下 步驟：
對蛹蟲草大米殘余培養(yǎng)基進(jìn)行干燥、超微粉碎、生物多酶體系酶法水解、離心過濾、回流控制、多功能膜濃縮富集、噴霧干燥、定性定量檢測等步驟。
干燥步驟具體為：將同一品種采收用蛹蟲草后的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切成片狀，在真空干燥箱中70-100℃下分別烘干2-4次，每次1.5-3h，至培養(yǎng)基切片含水量為≤5%。
超微粉碎步驟具體為：將已準(zhǔn)備的含水量≤5%的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切片用錘片粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，得到蛹蟲草大米培養(yǎng)基粗粉，進(jìn)一步將其經(jīng)超音速氣流旋轉(zhuǎn)碰撞式粉碎機(jī)粉碎后，顆粒由空氣流送至旋風(fēng)分離器，不同粒度的蛹蟲草大米培養(yǎng)基粉經(jīng)分離后分別進(jìn)入初級(jí)收集器和二級(jí)收集器，得到氣流粉碎一級(jí)分離物和二級(jí)分離物（獲得量較少），氣流粉碎一級(jí)分離物。將已經(jīng)制備好的氣流粉碎一級(jí)分離物放入行星球磨罐，采用物料和研磨球1:1-1:3的比例進(jìn)行行星球磨粉碎1-3h，共粉碎2-3次（粉碎時(shí)間合計(jì)不超過6h），得到粒度均勻的蛹蟲草大米培養(yǎng)基超微粉，粒度分布為20-60μm，粉末含量≤3%。
生物多酶體系酶法水提步驟具體為：在上述培養(yǎng)基超微粉中加入比例為10-30倍的水后，先在60-100℃下浸提1-4h，然后加入纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶（這三種酶需最適溫度和最適pH接近，最適pH范圍為6.0-7.5），三種酶的添加量為提取體系重量的0.03%-0.20%（m/v），三種酶的比例為1:1:1。將上述預(yù)浸提后的浸提液用HCl或者NaOH調(diào)節(jié)pH至上述酶的最適范圍，并將溫度調(diào)節(jié)至35-45℃，攪拌酶解2-6h后，將pH調(diào)節(jié)至中性，并于90-95℃下滅酶3-6min，冷卻至室溫。
離心過濾及回流控制步驟具體為：將上述得到的含有沉淀的提取液進(jìn)行過濾，并將濾液在3000 -5000r/min的速度下利用立式自動(dòng)刮刀下部卸料離心機(jī)離心10-30min，得到含有蛹蟲草多糖的上清提取液;將得到的沉淀加入比例為5-15倍的水，按照生物多酶體系酶法水提步驟中酶用量、用法再提取1-2次，所得濾液可與上述提取液合并使用。
多功能膜濃縮富集步驟具體為：將上述得到的蛹蟲草多糖提取液利用陶瓷膜設(shè)備進(jìn)行活性富集。在超濾富集進(jìn)行之前先使用0.1-0.45μm膜微濾，以除去連續(xù)壓濾后少量的懸浮固形物和小顆粒物質(zhì)，料液溫度為30-60℃，pH 6-8之間，操作壓力0.1-0.4MPa，微濾時(shí)間0.5-3.5h，收集微濾液待用；將上述得到的微濾液置于多功能超濾設(shè)備儲(chǔ)液桶中，根據(jù)活性多糖分子量分布范圍，選取截留分子量（MwCO）為30-300 KDa的有機(jī)膜超濾，超濾壓力選擇為0.1-0.4MPa，pH 6-8之間，微濾時(shí)間0.5-3.0h；得到的截留液再用0.1-0.45μm的微濾膜進(jìn)行濃縮富集0.5-3.5h，此時(shí)所得多糖濃縮液濃縮倍數(shù)為5-15倍，且多糖分子量分布處于30-250 KDa的活性范圍。
噴霧干燥步驟具體為：如欲生產(chǎn)干粉型蟲草多糖產(chǎn)品，可利用閉式循環(huán)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥處理，設(shè)置噴霧干燥設(shè)備入口溫度為150-190℃，出口溫度為60-100℃，進(jìn)行調(diào)噴霧干燥后即可收集蛹蟲草多糖超微粉。
定性定量檢測步驟具體為：
（1）高效液相色譜法測定蟲草多糖含量、純度及分子量
將不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)Dextran相繼進(jìn)樣，記錄保留時(shí)間（TR），以各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間（TR）為橫坐標(biāo)，其分子量（M）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出分子量與保留時(shí)間（TR）的回歸方程。
高效液相色譜條件為：色譜儀：Agilent 1200高效液相色譜儀；色譜柱：TSK-GEL G4000 PWXL色譜柱（300 × 7.8 mm）；檢測器：Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），靈敏度為7，霧化溫度55℃，霧化壓力3.06 bar；柱溫：30℃；流動(dòng)相：ddH2O；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL
各蟲草多糖樣品按上述步驟進(jìn)樣，根據(jù)各蟲草多糖在色譜圖上峰的數(shù)目和形狀來鑒定多糖的純度；另外，根據(jù)所得的保留時(shí)間（TR），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算各多糖的相對分子量；
（2）硫酸-苯酚法測定蟲草多糖含量
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：配制0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0 μL分別置于八個(gè)同等規(guī)格的玻璃試管中，加水補(bǔ)至500.0 μL。然后分別加入500 μL的蒸餾水、6%的苯酚500.0 μL和濃硫酸2.5 mL，振蕩搖勻，室溫放置20 min后，采用紫外可見分光光度計(jì)于490 nm處測定吸光度值。以單糖標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作橫坐標(biāo)，吸光度值作縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出回歸方程。
樣品測定：取0.5 mL蟲草多糖溶液于試管中，替代標(biāo)準(zhǔn)品溶液，后續(xù)操作一樣，平行三次，測定各自的吸光度值，求三管A490的平均值（若測定值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍可對樣品進(jìn)行適度稀釋）。
經(jīng)檢測，通過本發(fā)明的方法分離得到的多糖濃縮液中蟲草多糖含量達(dá)80%以上，產(chǎn)品回收率達(dá)85%以上。
本發(fā)明的有益效果：
最大程度的提高蟲草多糖的得率，以蛹蟲草收獲后廢棄的大米培養(yǎng)基（下腳料）為原料，對其中的蟲草多糖進(jìn)行提取，利用纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶復(fù)合處理等綠色提取技術(shù)對蛹蟲草培養(yǎng)基進(jìn)行前處理，通過對酶法提取條件進(jìn)行控制，最大程度降低其中纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)對蟲草多糖提取的影響，提高了蟲草多糖的得率;利用微濾、超濾膜等設(shè)備對提取液中的蟲草多糖進(jìn)行富集，通過優(yōu)化膜通量等關(guān)鍵參數(shù)，達(dá)到最佳富集效果，替代傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑沉淀、旋轉(zhuǎn)濃縮等高污染、高耗能的方法，最大程度減少能耗和加工對環(huán)境的污染，節(jié)約了能源，整個(gè)膜分離過程中無相變，有限個(gè)保護(hù)了蟲草多糖的活性。本發(fā)明有效的利用了廢棄的蛹蟲草培養(yǎng)基，節(jié)約了資源和成本。本發(fā)明適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
將同一品種采收用蛹蟲草后的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切成片狀，在真空干燥箱中70℃下分別烘干4次，每次2h，至培養(yǎng)基切片含水量為≤5%；將已準(zhǔn)備的含水量≤5%的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切片用錘片粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，得到蛹蟲草大米培養(yǎng)基粗粉，由空氣流送至旋風(fēng)分離器，得到氣流粉碎一級(jí)分離物和二級(jí)分離物，采之后用物料和研磨球1:3的比例進(jìn)行行星球磨粉碎1h，共粉碎3次，得到粒度均勻的蛹蟲草大米培養(yǎng)基超微粉，粒度分布為60μm，粉末含量≤3%；在上述培養(yǎng)基超微粉中加入比例為10倍的水后，先在60℃下浸提4h，然后加入纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶（最適pH范圍為6.0-7.5），三種酶的添加量為提取體系重量的0.03%（m/v），且添加比例為1:1:1。將上述預(yù)浸提后的浸提液用HCl或者NaOH調(diào)節(jié)pH至上述酶的最適范圍，并將溫度調(diào)節(jié)至35℃，攪拌酶解6h后，將pH調(diào)節(jié)至中性，并于90℃下滅酶6min，冷卻至室溫；將上述得到的含有沉淀的提取液進(jìn)行過濾，并將濾液在3000 r/min的速度下離心30min，得到含有蛹蟲草多糖的上清提取液，將得到的沉淀加入比例為5倍的水，按照生物多酶體系酶法水提步驟中酶用量、用法再提取1次，所得濾液可與上述提取液合并使用；在超濾富集進(jìn)行之前先使用0.1μm膜微濾，以除去連續(xù)壓濾后少量的懸浮固形物和小顆粒物質(zhì)，料液溫度為30℃，pH 6，操作壓力0.1MPa，微濾時(shí)間3.5h，收集微濾液待用；將上述得到的微濾液置于多功能超濾設(shè)備儲(chǔ)液桶中，根據(jù)活性多糖分子量分布范圍，選取截留分子量（MwCO）為30 KDa的有機(jī)膜超濾，超濾壓力選擇為0.1MPa，pH 6，微濾時(shí)間3.0h；得到的截留液再用0.1μm的微濾膜進(jìn)行濃縮富集3.5h，此時(shí)所得多糖濃縮液濃縮倍數(shù)為7倍，且多糖分子量分布處于30-250 KDa的活性范圍；如欲生產(chǎn)干粉型蟲草多糖產(chǎn)品，可利用閉式循環(huán)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥處理，設(shè)置噴霧干燥設(shè)備入口溫度為190℃，出口溫度為100℃，進(jìn)行調(diào)噴霧干燥后即可收集蛹蟲草多糖超微粉。
實(shí)施例2
將同一品種采收用蛹蟲草后的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切成片狀，在真空干燥箱中80℃下分別烘干3次，每次2h，至培養(yǎng)基切片含水量為≤5%；將已準(zhǔn)備的含水量≤5%的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切片用錘片粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，得到蛹蟲草大米培養(yǎng)基粗粉，由空氣流送至旋風(fēng)分離器，得到氣流粉碎一級(jí)分離物和二級(jí)分離物，采之后用物料和研磨球1:2的比例進(jìn)行行星球磨粉碎1h，共粉碎3次，得到粒度均勻的蛹蟲草大米培養(yǎng)基超微粉，粒度分布為50μm，粉末含量≤3%；在上述培養(yǎng)基超微粉中加入比例為15倍的水后，先在60℃下浸提3h，然后加入纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶（最適pH范圍為6.0-7.5），三種酶的添加量為提取體系重量的0.06%（m/v），且添加比例為1:1:1。將上述預(yù)浸提后的浸提液用HCl或者NaOH調(diào)節(jié)pH至上述酶的最適范圍，并將溫度調(diào)節(jié)至40℃，攪拌酶解4h后，將pH調(diào)節(jié)至中性，并于95℃下滅酶3min，冷卻至室溫；將上述得到的含有沉淀的提取液進(jìn)行過濾，并將濾液在3000 r/min的速度下離心30min，得到含有蛹蟲草多糖的上清提取液，將得到的沉淀加入比例為5倍的水，按照生物多酶體系酶法水提步驟中酶用量、用法再提取1次，所得濾液可與上述提取液合并使用；在超濾富集進(jìn)行之前先使用0.2μm膜微濾，以除去連續(xù)壓濾后少量的懸浮固形物和小顆粒物質(zhì)，料液溫度為40℃，pH 7，操作壓力0.2MPa，微濾時(shí)間3.0h，收集微濾液待用；將上述得到的微濾液置于多功能超濾設(shè)備儲(chǔ)液桶中，根據(jù)活性多糖分子量分布范圍，選取截留分子量（MwCO）為50 KDa的有機(jī)膜超濾，超濾壓力選擇為0.2MPa，pH 6，微濾時(shí)間2.5h；得到的截留液再用0.2μm的微濾膜進(jìn)行濃縮富集3.0h，此時(shí)所得多糖濃縮液濃縮倍數(shù)為9倍，且多糖分子量分布處于30-250 KDa的活性范圍；如欲生產(chǎn)干粉型蟲草多糖產(chǎn)品，可利用閉式循環(huán)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥處理，設(shè)置噴霧干燥設(shè)備入口溫度為190℃，出口溫度為100℃，進(jìn)行調(diào)噴霧干燥后即可收集蛹蟲草多糖超微粉。
實(shí)施例3
將同一品種采收用蛹蟲草后的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切成片狀，在真空干燥箱中90℃下分別烘干3次，每次1.5h，至培養(yǎng)基切片含水量為≤5%；將已準(zhǔn)備的含水量≤5%的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切片用錘片粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，得到蛹蟲草大米培養(yǎng)基粗粉，由空氣流送至旋風(fēng)分離器，得到氣流粉碎一級(jí)分離物和二級(jí)分離物，采之后用物料和研磨球1:2的比例進(jìn)行行星球磨粉碎1h，共粉碎3次，得到粒度均勻的蛹蟲草大米培養(yǎng)基超微粉，粒度分布為50μm，粉末含量≤3%；在上述培養(yǎng)基超微粉中加入比例為20倍的水后，先在80℃下浸提2h，然后加入纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶（最適pH范圍為6.0-7.5），三種酶的添加量為提取體系重量的0.06%（m/v），且添加比例為1:1:1。將上述預(yù)浸提后的浸提液用HCl或者NaOH調(diào)節(jié)pH至上述酶的最適范圍，并將溫度調(diào)節(jié)至40℃，攪拌酶解4h后，將pH調(diào)節(jié)至中性，并于95℃下滅酶3min，冷卻至室溫；將上述得到的含有沉淀的提取液進(jìn)行過濾，并將濾液在4000 r/min的速度下離心20min，得到含有蛹蟲草多糖的上清提取液，將得到的沉淀加入比例為10倍的水，按照生物多酶體系酶法水提步驟中酶用量、用法再提取1次，所得濾液可與上述提取液合并使用；在超濾富集進(jìn)行之前先使用0.2μm膜微濾，以除去連續(xù)壓濾后少量的懸浮固形物和小顆粒物質(zhì)，料液溫度為50℃，pH 7，操作壓力0.2MPa，微濾時(shí)間2.5h，收集微濾液待用；將上述得到的微濾液置于多功能超濾設(shè)備儲(chǔ)液桶中，根據(jù)活性多糖分子量分布范圍，選取截留分子量（MwCO）為100 KDa的有機(jī)膜超濾，超濾壓力選擇為0.2MPa，pH 6，微濾時(shí)間2.5h；得到的截留液再用0.3μm的微濾膜進(jìn)行濃縮富集2.5h，此時(shí)所得多糖濃縮液濃縮倍數(shù)為10倍，且多糖分子量分布處于30-250 KDa的活性范圍；如欲生產(chǎn)干粉型蟲草多糖產(chǎn)品，可利用閉式循環(huán)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥處理，設(shè)置噴霧干燥設(shè)備入口溫度為180℃，出口溫度為90℃，進(jìn)行調(diào)噴霧干燥后即可收集蛹蟲草多糖超微粉。
實(shí)施例4
將同一品種采收用蛹蟲草后的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切成片狀，在真空干燥箱中100℃下分別烘干2次，每次1.5h，至培養(yǎng)基切片含水量為≤5%；將已準(zhǔn)備的含水量≤5%的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切片用錘片粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，得到蛹蟲草大米培養(yǎng)基粗粉，由空氣流送至旋風(fēng)分離器，得到氣流粉碎一級(jí)分離物和二級(jí)分離物，采之后用物料和研磨球1:3的比例進(jìn)行行星球磨粉碎1h，共粉碎2次，得到粒度均勻的蛹蟲草大米培養(yǎng)基超微粉，粒度分布為30μm，粉末含量≤3%；在上述培養(yǎng)基超微粉中加入比例為20倍的水后，先在90℃下浸提1.5h，然后加入纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶（最適pH范圍為6.0-7.5），三種酶的添加量為提取體系重量的1.0%（m/v），且添加比例為1:1:1。將上述預(yù)浸提后的浸提液用HCl或者NaOH調(diào)節(jié)pH至上述酶的最適范圍，并將溫度調(diào)節(jié)至42℃，攪拌酶解3h后，將pH調(diào)節(jié)至中性，并于95℃下滅酶3min，冷卻至室溫；將上述得到的含有沉淀的提取液進(jìn)行過濾，并將濾液在5000 r/min的速度下離心10min，得到含有蛹蟲草多糖的上清提取液，將得到的沉淀加入比例為12倍的水，按照生物多酶體系酶法水提步驟中酶用量、用法再提取1次，所得濾液可與上述提取液合并使用；在超濾富集進(jìn)行之前先使用0.2μm膜微濾，以除去連續(xù)壓濾后少量的懸浮固形物和小顆粒物質(zhì)，料液溫度為55℃，pH 7，操作壓力0.3MPa，微濾時(shí)間1.0h，收集微濾液待用；將上述得到的微濾液置于多功能超濾設(shè)備儲(chǔ)液桶中，根據(jù)活性多糖分子量分布范圍，選取截留分子量（MwCO）為100 KDa的有機(jī)膜超濾，超濾壓力選擇為0.3MPa，pH 7，微濾時(shí)間1.0h；得到的截留液再用0.3μm的微濾膜進(jìn)行濃縮富集2.5h，此時(shí)所得多糖濃縮液濃縮倍數(shù)為12倍，且多糖分子量分布處于30-250 KDa的活性范圍；如欲生產(chǎn)干粉型蟲草多糖產(chǎn)品，可利用閉式循環(huán)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥處理，設(shè)置噴霧干燥設(shè)備入口溫度為180℃，出口溫度為90℃，進(jìn)行調(diào)噴霧干燥后即可收集蛹蟲草多糖超微粉。
實(shí)施例5
將同一品種采收用蛹蟲草后的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切成片狀，在真空干燥箱中100℃下分別烘干2次，每次1.5h，至培養(yǎng)基切片含水量為≤5%；將已準(zhǔn)備的含水量≤5%的蛹蟲草大米培養(yǎng)基切片用錘片粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，得到蛹蟲草大米培養(yǎng)基粗粉，由空氣流送至旋風(fēng)分離器，得到氣流粉碎一級(jí)分離物和二級(jí)分離物，采之后用物料和研磨球1:3的比例進(jìn)行行星球磨粉碎1h，共粉碎2次，得到粒度均勻的蛹蟲草大米培養(yǎng)基超微粉，粒度分布為30μm，粉末含量≤3%；在上述培養(yǎng)基超微粉中加入比例為30倍的水后，先在1000℃下浸提1.0h，然后加入纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶（最適pH范圍為6.0-7.5），三種酶的添加量為提取體系重量的2.0%（m/v），且添加比例為1:1:1。將上述預(yù)浸提后的浸提液用HCl或者NaOH調(diào)節(jié)pH至上述酶的最適范圍，并將溫度調(diào)節(jié)至45℃，攪拌酶解2h后，將pH調(diào)節(jié)至中性，并于95℃下滅酶3min，冷卻至室溫；將上述得到的含有沉淀的提取液進(jìn)行過濾，并將濾液在5000 r/min的速度下離心10min，得到含有蛹蟲草多糖的上清提取液，將得到的沉淀加入比例為12倍的水，按照生物多酶體系酶法水提步驟中酶用量、用法再提取1次，所得濾液可與上述提取液合并使用；在超濾富集進(jìn)行之前先使用0.1μm膜微濾，以除去連續(xù)壓濾后少量的懸浮固形物和小顆粒物質(zhì)，料液溫度為60℃，pH 7，操作壓力0.4MPa，微濾時(shí)間0.5h，收集微濾液待用；將上述得到的微濾液置于多功能超濾設(shè)備儲(chǔ)液桶中，根據(jù)活性多糖分子量分布范圍，選取截留分子量（MwCO）為300 KDa的有機(jī)膜超濾，超濾壓力選擇為0.4MPa，pH 7，微濾時(shí)間0.5h；得到的截留液再用0.45μm的微濾膜進(jìn)行濃縮富集1.0h，此時(shí)所得多糖濃縮液濃縮倍數(shù)為14倍，且多糖分子量分布處于30-250 KDa的活性范圍；如欲生產(chǎn)干粉型蟲草多糖產(chǎn)品，可利用閉式循環(huán)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥處理，設(shè)置噴霧干燥設(shè)備入口溫度為190℃，出口溫度為70℃，進(jìn)行調(diào)噴霧干燥后即可收集蛹蟲草多糖超微粉。
以上詳細(xì)說明了本發(fā)明的實(shí)施方式，但這只是為了便于理解而舉的實(shí)例，不應(yīng)被視為是對本發(fā)明范圍的限制。同樣，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員均可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其較佳實(shí)施例的描述，做出各種可能的等同改變或替換，但所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。