本發(fā)明涉及一種丹參丹酚酸a制備方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
丹參在臨床上廣泛用于治療心血管系統(tǒng)疾病，其主要活性成分為水溶性酚酸類，主要有丹酚酸b、原兒茶醛、原兒茶酸、丹參素、迷迭香酸等，丹酚酸a是丹參水溶性酚酸類成分中的一種，其含量較低。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸a是目前已知的最強(qiáng)的抗氧化化合物之一，丹酚酸a在抗氧化、心肌缺血保護(hù)、抗血栓、神經(jīng)保護(hù)、抗肝纖維化、防治糖尿病及并發(fā)癥等多個方面具有廣泛的藥理活性(張莉，張維庫，趙瑩，楊秀穎，方蓮花，王守寶，杜冠華(2011)。
丹酚酸a為淡黃色粉末，易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等溶劑，對光和熱不穩(wěn)定，暴露空氣易氧化成丹酚酸c和異丹酚酸c等，其結(jié)構(gòu)式如下：
現(xiàn)有大量關(guān)于丹酚酸a制備方法的專利和文獻(xiàn)，其中丹酚酸a制備方法的中國專利有cn200610012615.1、cn200610052442.6、cn200610165779.8、cn200710001055.4、cn200710070553.4、cn200710099618.8、cn200810120784.6、cn201010143656.0、cn201010143666.4、cn201010143678.7、cn201010143689.5、cn201010143714.x、cn201010148488.4、cn201010541651.3、cn201010598480.8、cn201010620911.6、cn201110083924.9、cn201110141512.6、cn201210487598.2、cn201210487600.6、cn201210487643.4、cn201210488782.9、cn201310192210.0、cn201310258565.5、cn201310487751.6、cn201410216134.7、cn201510086508.2、cn201511019464.8，其中專利cn200610052442.6、cn200610165779.8、cn200710070553.4、cn200810120784.6、cn201010143656.0、cn201110083924.9、cn201210487643.4、cn201310487751.6采用水或醇直接提取，該法由于丹參藥材中丹酚酸a的含量約為0.03％～0.06％，故采取直接提取的方法得到的丹酚酸a提取率比較低；專利cn200710099618.8、cn201010143678.7、cn201010143689.5、cn201010143714.x、cn201010598480.8、cn201210487598.2、cn201310192210.0、cn201310258565.5采用以丹酚酸b或丹參多酚酸鹽為起始原料，經(jīng)過高溫高壓、酶促反應(yīng)或加入催化劑如氯化鋅等反應(yīng)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)丹酚酸a，該法比較容易控制，但是以丹酚酸b或丹參多酚酸鹽為原料其成本較高，且轉(zhuǎn)化為丹酚酸a的轉(zhuǎn)移率比較低，如cn201010143678.7僅為10％左右。另外一部分專利，如cn1830947公開了高溫處理丹參提取物制備丹酚酸a的條件為101～140℃處理0.5～24小時，隨后，cn100999470對其條件進(jìn)行了細(xì)化，條件進(jìn)一步優(yōu)化為ph3.5～6.0,110～130℃下處理1～6小時制備丹酚酸a，為解決丹參藥材中丹酚酸a含量低提供了較好的方法，解決了丹酚酸a的來源問題，但是此工藝，由于是水提液不經(jīng)處理直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，存在如下不利因素：1)水提液中含有蛋白質(zhì)及膠體物質(zhì)，將與轉(zhuǎn)化后的丹酚酸a結(jié)合，增加后續(xù)分離難度；2)水提取液中含有部分金屬離子在轉(zhuǎn)化過程中可能與丹酚酸a或丹酚酸b螯合，阻礙或加劇丹酚酸a的生成或降解；3)轉(zhuǎn)化體積過大，需要增大設(shè)備從而增大了能耗，且加壓操作存在安全性問題。
另外，以上的專利僅考慮丹酚酸b轉(zhuǎn)化生成丹酚酸a，而忽略了紫草酸，根據(jù)文獻(xiàn)(xia,h.,sun,l.,lou,h.,&rahman,m.m.(2014).conversionofsalvianolicacidbintosalvianolicacidaintissuesofradixsalviaemiltiorrhizaeusinghightemperature,highpressureandhighhumidity.phytomedicineinternationaljournalofphytotherapy&phytopharmacology,21(6),906-911.)，丹酚酸b在一定條件下降解產(chǎn)生丹酚酸a，丹酚酸b先降解產(chǎn)生紫草酸，再經(jīng)過脫去一份子二氧化碳才生成丹酚酸a，故丹酚酸a是丹酚酸b和紫草酸共同的降解產(chǎn)物，如下式：
在精制過程，現(xiàn)有的專利和文獻(xiàn)主要采用大孔吸附樹脂、硅膠、聚酰胺、以及mci和sephadexlh-20，使用硅膠往往使用比較多的有機(jī)溶劑，且死吸附較大而造成丹酚酸a較多的損失，后兩種mci、sephadexlh-20成本較高，且工藝控制研究不深入，往往造成在處理過程中丹酚酸a的降解和破壞。
通過轉(zhuǎn)化的方式生成丹酚酸a，為丹酚酸a的制備提供了很好的思路，但是綜合以上的專利文獻(xiàn)，對丹參藥材中降解生成丹酚酸a的途徑及轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件還沒有深入的研究，根據(jù)已有的研究報道，丹酚酸a的提取和收率有一定提高，但是仍然存在轉(zhuǎn)化率低，分離純化過程較長，收率低的問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一個低成本、轉(zhuǎn)化率高，后續(xù)分離精制過程簡單，能產(chǎn)業(yè)化制備丹酚酸a的方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種丹酚酸a的制備方法，包括(1)提取步驟、(2)過大孔吸附樹脂柱的粗分離步驟、(3)轉(zhuǎn)化步驟、(4)精制步驟、(5)萃取步驟、(6)干燥步驟，所述(4)精制步驟是采用中高壓柱色譜對丹酚酸a進(jìn)行精制純化，中高壓色譜的填料為odsc18，填料粒徑為10～40um，壓力10～25bar。
優(yōu)選地，所述的中高壓色譜洗脫溶劑為甲醇-磷酸水或乙醇-磷酸水的一種，所述甲醇-磷酸水或乙醇-磷酸水的體積比為15:85～25:75，其中所述磷酸水中磷酸的質(zhì)量百分比為0.1％～0.4％。
優(yōu)選地，所述(4)精制步驟中，填料粒徑為20um。
優(yōu)選地，所述(4)精制步驟中，上樣溶液的丹酚酸a濃度為1.10mg/ml～1.50mg/ml的溶液。
優(yōu)選地，所述(1)提取步驟中，使用的提取溶劑選自水、甲醇、乙醇、甲醇水溶液或乙醇水溶液。
優(yōu)選地，所述(2)過大孔吸附樹脂柱的粗分離步驟選用的大孔吸附樹脂為lk02或lky134或d101中的一種，上樣速度為1bv/h，上樣量為18.0～25.0ml/g大孔吸附樹脂，用水和10％乙醇水分別洗脫4～5bv，棄去，然后用70％乙醇洗脫10bv，收集70％乙醇洗脫液。
優(yōu)選地，所述(3)轉(zhuǎn)化步驟，首先將所述70％乙醇洗脫液濃縮至丹酚酸b和紫草酸總量濃度為10.0～16.0mg/ml的溶液，再加鹽酸或硫酸調(diào)ph值為3～6，加熱回流16～20小時。
優(yōu)選地，所述(3)轉(zhuǎn)化步驟中所述丹酚酸b和紫草酸總量最佳濃度為12.5mg/ml，所述ph值最佳為4.0，最佳加熱回流18個小時。
優(yōu)選地，所述(5)萃取步驟采用乙酸乙酯作為萃取劑。
優(yōu)選地，所述丹酚酸a的制備方法包括如下步驟：
(1)提取步驟：丹參加8倍量50％乙醇回流提取3次，每次2小時，合并濾液，濃縮至藥液體積與重量1:1的溶液，靜置過夜，取上清液過濾，或離心，得濃縮液；
(2)過大孔吸附樹脂柱的粗分離步驟：步驟(1)得到的濃縮液過大孔吸附樹脂柱的粗分離，大孔吸附樹脂為lk02或lky134或d101的一種，上樣速度為1bv/h，上樣量為18.0～25.0ml/g大孔吸附樹脂，靜置4小時，用水和10％乙醇水分別洗脫4～5bv，棄去，然后70％乙醇洗脫10bv，收集70％乙醇洗脫液；
(3)轉(zhuǎn)化步驟：將步驟(2)收集70％乙醇洗脫液減壓回收乙醇，減壓濃縮至丹酚酸b和紫草酸總量濃度為12.5mg/ml的溶液，加鹽酸或硫酸調(diào)ph值為4.0，加熱回流18小時，即得富含丹酚酸a的溶液；
(4)精制步驟：將步驟(3)所得的富含丹酚酸a的溶液，加水稀釋至丹酚酸a濃度為1.10mg/ml～1.50mg/ml的溶液，過濾，上中高壓色譜柱，填料為odsc18，填料粒徑為10～40um，壓力10～25bar，洗脫溶劑為甲醇-磷酸水或乙醇-磷酸水的一種，所述甲醇-磷酸水或乙醇-磷酸水的體積比為15:85～25:75，其中所述磷酸水中磷酸的質(zhì)量百分比為0.1％～0.4％，截取符合要求的丹酚酸a溶液部分；
(5)萃取步驟：將步驟(4)截取的符合要求的丹酚酸a溶液，減壓濃縮至無醇，用乙酸乙酯萃?。?/p>
(6)干燥步驟：減壓回收乙酸乙酯，冷凍干燥。
發(fā)明詳述：
1、過大孔吸附樹脂柱的粗分離步驟工藝優(yōu)化
發(fā)明人用步驟(1)提取步驟獲得的提取液，以丹酚酸b和紫草酸為指標(biāo)考察樹脂的吸附量、解析量、解析率及純度篩選了一批大孔吸附樹脂，最終發(fā)現(xiàn)采用lk02或lky134或d101中的一種為吸附樹脂最好。另外，對上樣速度、上樣量和洗脫溶劑及洗脫體積等進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)上樣速度為1bv/h，上樣量為18.0～25.0ml/g大孔吸附樹脂，用水和10％乙醇水分別洗脫4～5bv，棄去，然后用70％乙醇洗脫10bv，收集70％乙醇洗脫液富集的丹酚酸b和紫草酸最多。
2、轉(zhuǎn)化步驟工藝優(yōu)化
發(fā)明人將步驟(2)粗分離步驟收集的大孔樹脂柱層析液減壓回收乙醇，采用單因素和響應(yīng)曲面法以丹酚酸a為指標(biāo)，考察丹酚酸b和紫草酸總量的濃度、轉(zhuǎn)化液ph值、轉(zhuǎn)化時間，得出丹酚酸b和紫草酸總量濃度為10.0～16.0mg/ml，ph值為3～6，加熱回流16～20小時時，丹酚酸a的轉(zhuǎn)化率較理想，轉(zhuǎn)化率在45.84％～85.03％。最佳轉(zhuǎn)化條件為丹酚酸b和紫草酸總量濃度為12.5mg/ml的溶液，ph值為4.0，加熱回流18小時，丹酚酸a轉(zhuǎn)化率最高，可達(dá)78.35％～85.03％。
在研究過程中同時發(fā)現(xiàn)，在丹參多酚酸環(huán)境條件下，丹酚酸a穩(wěn)定性較好，不易過度破壞降解為丹酚酸c、異丹酚酸c和丹參素等，在堿性環(huán)境中丹酚酸a降解破壞比較嚴(yán)重；在轉(zhuǎn)化過程中丹酚酸b和紫草酸與丹酚酸a的轉(zhuǎn)化關(guān)系較為密切，以丹酚酸a為指標(biāo)，考察丹酚酸b和紫草酸在丹參多酚酸中的比例，對轉(zhuǎn)化結(jié)果影響不大，而二者的總量的濃度與丹酚酸a的轉(zhuǎn)化率有較大影響。其中丹酚酸b和紫草酸總量的濃度為12.5mg/ml，丹酚酸a的轉(zhuǎn)化率最高。
其中，丹酚酸a轉(zhuǎn)化率的計算方法為：
3、精制步驟工藝優(yōu)化研究
發(fā)明人在精制步驟的色譜柱的選擇中，意外的發(fā)現(xiàn)采用中高壓色譜柱比低壓(常壓)色譜柱在丹酚酸a純化效率和轉(zhuǎn)移率方面效果更好，具體明細(xì)如下：
其中對比評價方法為在相同丹酚酸a純度98％的水平下，以精制相同量的丹酚酸a原料中間體所耗費時間、丹酚酸a的轉(zhuǎn)移率作為指標(biāo)進(jìn)行對比。
由上表可以看出，采用中高壓色譜精制的丹酚酸a的收率較高，可能與經(jīng)轉(zhuǎn)化步驟后的溶液在用色譜柱精制過程中，受填料及洗脫溶液及壓力等條件共同作用下，將轉(zhuǎn)化步驟未能轉(zhuǎn)化完的丹酚酸b和紫草酸等丹酚酸成分又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丹酚酸a的緣故。
在填料的類型上，本發(fā)明優(yōu)選odsc18柱填料，可工業(yè)化生產(chǎn)，其中精制純化使用的設(shè)備工業(yè)化規(guī)模的有cs-prep工業(yè)制備液相色譜分離純化系統(tǒng)，色譜柱型號dac-hb800，odsc18柱填料最佳粒徑為20um，徑高比為1:8，洗脫溶劑最佳為甲醇-0.1％磷酸水，考慮到工業(yè)化可優(yōu)化為乙醇-0.2％磷酸水，使用乙醇為無水乙醇，也可為95％乙醇或其他濃度的乙醇，可適當(dāng)在0.1％～0.4％范圍內(nèi)調(diào)整磷酸水濃度，甲醇-磷酸水或乙醇-磷酸水的體積比在15:85～25:75范圍內(nèi)均可達(dá)到理想收率。
4、萃取步驟優(yōu)化
在精制工藝步驟，截取符合要求的丹酚酸a溶液部分含有大量的乙醇或甲醇，因此需要將其蒸除，從保持丹酚酸a結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的角度考慮，最好采用減壓蒸餾法，待溶液無醇味為止。然后將丹酚酸a采用有機(jī)溶劑從剩余溶液中萃取出來。本發(fā)明優(yōu)選采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，更優(yōu)選萃取3～5次。
5、丹酚酸a的含量檢測
色譜方法：色譜柱為welchmaterialsxbc18(4.6×150mm，5μm)；流動相：乙腈(a)-0.5％乙酸水(b)梯度洗脫；流速：1.0ml/min；柱溫：25℃；檢測波長：286nm；流動相梯度洗脫比例如下：
對照品溶液的制備：精密稱取丹酚酸a對照品(工作對照品)適量，加50％乙醇制成每1.0ml含丹酚酸a0.5mg的溶液，搖勻，即得。
供試品溶液的制備：取樣品粉末10mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加50％乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
測定法：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得。
本發(fā)明有益的技術(shù)效果：
(1)本發(fā)明在轉(zhuǎn)化步驟前先將丹酚酸類成分進(jìn)行粗分離，分出富含丹酚酸b及紫草酸的溶液，再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而使要轉(zhuǎn)化藥液的體積減小，不需要較大的設(shè)備。
(2)本發(fā)明采用常壓下加熱回流轉(zhuǎn)化，無需高壓反應(yīng)，易工業(yè)化操作。
(3)采用中高壓色譜柱，能將未轉(zhuǎn)化完的丹酚酸b和紫草酸的丹酚酸溶液再經(jīng)過轉(zhuǎn)化加以利用，提高丹酚酸a整體收率。
(4)本發(fā)明獲得的丹酚酸a純度高(98％以上)，收率高(3.0‰以上)，且重復(fù)性好。
附圖
圖1：丹酚酸a含量測定色譜圖
具體實施方案
下述是結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實施例僅限于說明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
(1)提取步驟
取丹參藥材，粉碎成粗粉，稱取8kg，加8倍量50％乙醇回流提取3次，每次2小時，合并濾液，濃縮至藥液體積與重量1:1的溶液，靜置過夜，取上清液過濾，或離心。
(2)粗分離步驟
將得到的濃縮液，大孔吸附樹脂為lk02，上樣速度為1bv/h，上樣量為20.0ml/g大孔吸附樹脂，靜置4小時，水洗和10％乙醇水分別洗脫5bv，棄去，以薄層色譜監(jiān)測，三氯化鐵顯色未出現(xiàn)藍(lán)色斑點，然后70％乙醇洗脫10bv，三氯化鐵顯色至不顯藍(lán)色為止。
(3)轉(zhuǎn)化步驟
將收集的大孔樹脂柱層析液減壓回收乙醇，減壓濃縮至丹酚酸b和紫草酸總量為12.5mg/ml的溶液，加鹽酸或硫酸調(diào)ph值為4.0，加熱回流18小時，即得富含丹酚酸a的溶液。
(4)精制步驟
將富含丹酚酸a的溶液，加水稀釋至丹酚酸a濃度為1.10mg/ml的溶液，過濾，上中高壓色譜柱，填料為odsc18(粒徑為10um)，壓力20～25bar，洗脫溶劑為甲醇-0.2％磷酸水，甲醇-0.2％磷酸水的體積比為15:85，檢測波長286nm，截取符合要求的丹酚酸a溶液部分。
(5)萃取步驟
將截取的丹酚酸a溶液，減壓濃縮至無醇，使用等體積的乙酸乙酯萃取3～5次。
(6)干燥步驟
減壓回收乙酸乙酯，冷凍干燥,放入冷凍干燥箱中，溫度在-20～-40℃預(yù)凍2～4小時，抽真空，在-5～-10℃，升華干燥12小時，0～10℃再干燥3小時，得到丹酚酸a32.8g(收率4.1‰，收率＝丹酚酸a的量/丹參藥材)，按丹酚酸a含量測定方法檢測，丹酚酸a純度為98.3％。
實施例2
(1)提取步驟
取丹參藥材，粉碎成粗粉，稱取8kg，加6倍量無水乙醇回流提取3次，每次1.5小時，合并濾液，濃縮至藥液體積與重量1:1的溶液，靜置過夜，取上清液過濾，或離心。
(2)粗分離步驟
將得到的濃縮液，大孔吸附樹脂為lky134，上樣速度為1bv/h，上樣量為19.0ml/g大孔吸附樹脂，靜置4小時，水洗和10％乙醇水分別洗脫4～5bv，棄去，然后70％乙醇洗脫10bv。
(3)轉(zhuǎn)化步驟
將收集的大孔樹脂柱層析也減壓回收乙醇，減壓濃縮至丹酚酸b和紫草酸總量為12.5mg/ml的溶液，加鹽酸或硫酸調(diào)ph值為4.0，加熱回流18小時，即得富含丹酚酸a的溶液。
(4)精制步驟
將富含丹酚酸a的溶液液，加水稀釋至丹酚酸a濃度為1.10mg/ml的溶液，過濾，上中高壓色譜柱，填料為odsc18(粒徑為20um)，壓力10～20bar，洗脫溶劑為乙醇-0.2％磷酸水，乙醇-0.2％磷酸水的體積比為15:85，檢測波長286nm，截取符合要求的丹酚酸a溶液部分。
(5)萃取步驟
將截取的丹酚酸a溶液，減壓濃縮至無醇，使用等體積的乙酸乙酯萃取3～5次。
(6)干燥步驟
減壓回收乙酸乙酯，冷凍干燥，溫度在-20～-40℃預(yù)凍2～4小時，抽真空，在-5～-10℃，升華干燥12小時，0～10℃再干燥3小時，得到丹酚酸a31.8g(收率3.9‰)，按丹酚酸a含量測定方法檢測，丹酚酸a純度為98.1％。
實施例3
(1)提取步驟
取丹參藥材，粉碎成粗粉，稱取8kg，加6倍量70％甲醇回流提取2次，每次1小時，合并濾液，濃縮至藥液體積與重量1:1的溶液，靜置過夜，取上清液過濾，或離心。
(2)粗分離步驟
將得到的濃縮液，大孔吸附樹脂為d101，上樣速度為1bv/h，上樣量為18.0ml/g大孔吸附樹脂，靜置4小時，水洗和10％乙醇水分別洗脫5bv，棄去，以薄層色譜監(jiān)測，三氯化鐵顯色未出現(xiàn)藍(lán)色斑點，然后70％乙醇洗脫10bv，三氯化鐵顯色至不顯藍(lán)色為止。
(3)轉(zhuǎn)化步驟
將收集的大孔樹脂柱層析液減壓回收乙醇，減壓濃縮至丹酚酸b和紫草酸總量為10mg/ml的溶液，加鹽酸或硫酸調(diào)ph值為3.0，加熱回流20小時，即得富含丹酚酸a的溶液。
(4)精制步驟
將富含丹酚酸a的溶液，加水稀釋至丹酚酸a濃度為1.50mg/ml的溶液，過濾，上中高壓色譜柱，填料為odsc18(粒徑為30um)，壓力10～20bar，洗脫溶劑為甲醇-0.2％磷酸水，乙醇-0.2％磷酸水的體積比為25:75，檢測波長286nm，截取符合要求的丹酚酸a溶液部分。
(5)萃取步驟
將截取的丹酚酸a溶液，減壓濃縮至無醇，使用等體積的乙酸乙酯萃取3～5次。
(6)干燥步驟
減壓回收乙酸乙酯，冷凍干燥,放入冷凍干燥箱中，溫度在-20～-40℃預(yù)凍2～4小時，抽真空，在-5～-10℃，升華干燥12小時，0～10℃再干燥3小時，得到丹酚酸a24.8g(收率3.0‰)，按丹酚酸a含量測定方法檢測，丹酚酸a純度為98.6％。
實施例4
(1)提取步驟
取丹參藥材，粉碎成粗粉，稱取8kg，加6倍量甲醇回流提取3次，每次1小時，合并濾液，濃縮至藥液體積與重量1:1的溶液，靜置過夜，取上清液過濾，或離心。
(2)粗分離步驟
將得到的濃縮液，大孔吸附樹脂為lky134，上樣速度為1bv/h，上樣量為25.0ml/g大孔吸附樹脂，靜置4小時，水洗和10％乙醇水分別洗脫4～5bv，棄去，然后70％乙醇洗脫10bv。
(3)轉(zhuǎn)化步驟
將收集的大孔樹脂柱層析也減壓回收乙醇，減壓濃縮至丹酚酸b和紫草酸總量為16.0mg/ml的溶液，加鹽酸或硫酸調(diào)ph值為6.0，加熱回流20小時，即得富含丹酚酸a的溶液。
(4)精制步驟
將富含丹酚酸a的溶液，加水稀釋至丹酚酸a濃度為1.30mg/ml的溶液，過濾，上中高壓色譜柱，填料為odsc18(粒徑為40um)，壓力10～15bar，洗脫溶劑為乙醇-0.4％磷酸水，乙醇-0.2％磷酸水的體積比為20:80檢測波長286nm，截取符合要求的丹酚酸a溶液部分。
(5)萃取步驟
將截取的丹酚酸a溶液，減壓濃縮至無醇，使用等體積的乙酸乙酯萃取3～5次。
(6)干燥步驟
減壓回收乙酸乙酯，冷凍干燥，溫度在-20～-40℃預(yù)凍2～4小時，抽真空，在-5～-10℃，升華干燥12小時，0～10℃再干燥3小時，得到丹酚酸a26.4g(收率3.3‰)，按丹酚酸a含量測定方法檢測，丹酚酸a純度為98.7％。
實施例5
(1)提取步驟
取丹參藥材，粉碎成粗粉，稱取8kg，加12倍量水回流提取3次，每次2小時，合并濾液，濃縮至藥液體積與重量1:1的溶液，靜置過夜，取上清液過濾，或離心。
(2)粗分離步驟
將得到的濃縮液，大孔吸附樹脂為d101，上樣速度為1bv/h，上樣量為25.0ml/g大孔吸附樹脂，靜置4小時，水洗和10％乙醇水分別洗脫5bv，棄去，以薄層色譜監(jiān)測，三氯化鐵顯色未出現(xiàn)藍(lán)色斑點，然后70％乙醇洗脫10bv，三氯化鐵顯色至不顯藍(lán)色為止。
(3)轉(zhuǎn)化步驟
將收集的大孔樹脂柱層析液減壓回收乙醇，減壓濃縮至丹酚酸b和紫草酸總量為16.0mg/ml的溶液，加鹽酸或硫酸調(diào)ph值為5.0，加熱回流16小時，即得富含丹酚酸a的溶液。
(4)精制步驟
將富含丹酚酸a的溶液，加水稀釋至丹酚酸a濃度為1.20mg/ml的溶液，過濾，上中高壓色譜柱，填料為odsc18(粒徑為10um)，壓力20～25bar，洗脫溶劑為甲醇-0.1％磷酸水，甲醇-0.1％磷酸水的體積比為15:85，檢測波長286nm，截取符合要求的丹酚酸a溶液部分。
(5)萃取步驟
將截取的丹酚酸a溶液，減壓濃縮至無醇，使用等體積的乙酸乙酯萃取3～5次。
(6)干燥步驟
減壓回收乙酸乙酯，冷凍干燥,放入冷凍干燥箱中，溫度在-20～-40℃預(yù)凍2～4小時，抽真空，在-5～-10℃，升華干燥12小時，0～10℃再干燥3小時，得到丹酚酸a29.5g(收率3.7‰)，按丹酚酸a含量測定方法檢測，丹酚酸a純度為99.2％。
實施例6
(1)提取步驟
取丹參藥材，粉碎成粗粉，稱取8kg，加7倍量無水乙醇回流提取2次，每次2小時，合并濾液，濃縮至藥液體積與重量1:1的溶液，靜置過夜，取上清液過濾，或離心。
(2)粗分離步驟
將得到的濃縮液，大孔吸附樹脂為lk02，上樣速度為1bv/h，上樣量為25.0ml/g大孔吸附樹脂，靜置4小時，水洗和10％乙醇水分別洗脫4～5bv，棄去，然后70％乙醇洗脫10bv。
(3)轉(zhuǎn)化步驟
將收集的大孔樹脂柱層析也減壓回收乙醇，減壓濃縮至丹酚酸b和紫草酸總量為14.0mg/ml的溶液，加鹽酸或硫酸調(diào)ph值為3.0，加熱回流19小時，即得富含丹酚酸a的溶液。
(4)精制步驟
將富含丹酚酸a的溶液液，加水稀釋至丹酚酸a濃度為1.10mg/ml的溶液，過濾，上中高壓色譜柱，填料為odsc18(粒徑為20um)，壓力10～20bar，洗脫溶劑為乙醇-0.4％磷酸水，乙醇-0.4％磷酸水的體積比為20:80，檢測波長286nm，截取符合要求的丹酚酸a溶液部分。
(5)萃取步驟
將截取的丹酚酸a溶液，減壓濃縮至無醇，使用等體積的乙酸乙酯萃取3～5次。
(6)干燥步驟
減壓回收乙酸乙酯，冷凍干燥，溫度在-20～-40℃預(yù)凍2～4小時，抽真空，在-5～-10℃，升華干燥12小時，0～10℃再干燥3小時，得到丹酚酸a27.2g(收率3.4‰)，按丹酚酸a含量測定方法檢測，丹酚酸a純度為99.4％。
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