本發(fā)明涉及糖蛋白提取
技術領域：
，具體涉及一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法。
背景技術：
：土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉或冀地鱉的雌蟲干燥體，主產(chǎn)福建、河北、陜西、甘肅、青海、山東、河南、江蘇、浙江、湖南等地，具有破血逐瘀，續(xù)筋接骨之功效，是一種重要的傳統(tǒng)中藥。其生物體內(nèi)含有多種活性蛋白、氨基酸、不飽和脂肪酸、微量元素、生物堿和脂溶性維生素等物質(zhì)，現(xiàn)在藥理研究表明土鱉蟲具有溶栓、抗凝血、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂等作用。活性肽廣泛存在于自然界中，生物體很多活性物質(zhì)都以肽的形式存在，沒有肽，就沒有活性，沒有生命。科學家們研究發(fā)現(xiàn)了具有免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、酶調(diào)節(jié)、抗病毒、降血壓和降血脂等功能性肽。由于功能性肽的特殊功能，使得人們對它需求增加，現(xiàn)在已提取出多種功能性肽多用于醫(yī)用和保健，如功能性大豆蛋白肽已經(jīng)用于降血脂。目前，對土鱉蟲化學成分的研究主要集中在氨基酸、脂肪酸、微量元素、生物堿等方面，對土鱉蟲糖蛋白的研究較少；現(xiàn)有技術公開了采用水提法對新鮮的土鱉蟲進行糖蛋白的提取，然后再通過Sevag法、離子交換層析法進行糖蛋白的純化；雖然采用Sevag法可有效除去游離蛋白，但是所得的糖蛋白的提取率低而且生物活性較差、純度低。因此，有必要提供一種更合理的糖蛋白的提取純化方法，以提高土鱉蟲糖蛋白的提取率同時還保持糖蛋白的生物活性。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是：針對現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，該方法可提高糖蛋白提取率、同時保持糖蛋白生物活性。為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案是：一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，所述提取純化方法包括下列步驟：(1)預處理：取新鮮的雌性土鱉蟲清洗干凈，然后加入pH3～6的PBS溶液浸泡10～30min，然后用蒸餾水清洗，將所述雌性土鱉蟲烘干、粉碎，得到土鱉蟲粉；(2)脫脂處理：取步驟(1)得到的土鱉蟲粉，然后加入所述土鱉蟲粉重量5～10倍的脫脂溶劑進行超聲處理，抽濾，得到脫脂土鱉蟲粉；(3)糖蛋白的提?。喝〔襟E(2)中的脫脂土鱉蟲粉，然后再加入脫脂土鱉蟲粉重量3～8倍的0.2～0.35mol/L鹽溶液進行微波輔助浸提，然后再進行水浴浸提，離心分離，經(jīng)過減壓濃縮得到土鱉蟲糖蛋白粗提液；(4)糖蛋白的純化：取步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液，加入所述土鱉蟲糖蛋白粗提液體積3～10倍的體積濃度為45％～65％的乙醇進行分級沉淀，棄去上清液，收集沉淀物，然后用蒸餾水將沉淀物進行復溶，調(diào)pH為3.5～5.8，溫度控制在40℃～60℃，再加入所述沉淀物重量0.2～0.5倍復合酶進行酶解，酶解結束后在95℃條件滅酶，得到酶解液，然后將酶解液進行超濾膜處理后得到的截留液過DEAE-52陰離子交換柱進行分離純化，用0.2～0.35mol/L的氯化鈉洗脫，檢測糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脫峰，將洗脫液透析處理，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。作為一種改進的技術方案，步驟(2)中的脫脂溶劑為質(zhì)量濃度為8％～10％的十二烷基苯磺酸鈉。作為一種改進的技術方案，步驟(2)中超聲處理時的超聲功率為220～400V，超聲時間為0.5～2min，溫度控制在25℃～35℃。作為一種改進的技術方案，步驟(3)中微波輔助浸提條件：微波功率為200W～300W,微波輔助提取時間為1～5min。作為一種改進的技術方案，步驟(3)中水浴浸提的溫度為40～60℃，浸提時間為0.5～2h。作為一種改進的技術方案，步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液在純化之前，先于截留分子量為500Da的透析袋中，蒸餾水透析48h。作為一種改進的技術方案，步驟(4)中復合酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶，且所述胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶的質(zhì)量比為0.3～0.6:0.2～0.35:0.1～0.3。作為一種改進的技術方案，步驟(4)中超濾膜的截留分子量為8000Da。本發(fā)明還研究了上述方法制備的土鱉蟲糖蛋白在胃癌離體細胞生長抑制方面的應用。本發(fā)明建立的土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，通過該方法獲得的土鱉蟲糖蛋白對胃癌離體細胞生長起到抑制作用；為了更好的說明土鱉蟲糖蛋白在胃癌離體細胞生長抑制中的作用，本發(fā)明通過藥理實驗及結果進行如下描述：(1)腫瘤細胞的培養(yǎng)將人胃癌細胞SGC-7901于37℃、5％CO2、含10％新生小牛血清和1.25μg/ml慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)，每隔2-3d換新鮮培養(yǎng)基1次。(2)苔盼藍活細胞計數(shù)法檢測土鱉蟲糖蛋白對細胞的作用選取對數(shù)生長期的胃癌細胞，制成單細胞懸浮液，調(diào)整細胞濃度至2×105個/ml,接種1ml上述細胞懸液至25ml的細胞培養(yǎng)瓶中，加入3ml生長培養(yǎng)液，培養(yǎng)18h，滅菌的PBS洗滌3次后加入3ml不同濃度的土鱉蟲糖蛋白溶液(以維持培養(yǎng)液配置，過濾除菌)，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h、36h、48h。取出培養(yǎng)瓶，用0.2mL胰酶液在1min內(nèi)將細胞消化使脫落，隨即加入3ml生長培養(yǎng)液終止消化并吹打成單個細胞懸液，吸取0.5ml細胞懸液于干凈的試管中，加入0.1ml苔盼染色液(0.4％，以生理鹽水配)，搖勻靜置2min，用血球計數(shù)板對未染色的細胞計數(shù)，并在1min完成。(3)MTT法檢測細胞對土鱉蟲糖蛋白的敏感性用生長液調(diào)整細胞濃度至5×104個/ml，隨即接孔到96孔板，每孔200μl，96孔板邊緣一圈的36個孔棄用，各孔加200μl滅菌的PBS；37℃，5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中放置18h使細胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，各孔用滅菌的PBS洗3次，除去孔中的殘留血清，加入不同濃度的糖蛋白溶液(以維持液配成)各200μl，培養(yǎng)24h、36h、48h，設空白對照。樣品液作用后，各孔各加入配置好的5mg/ml,25μl的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，傾倒各孔液體，每孔加入150μl,37℃預溫的二甲基亞砜(DMSO),震蕩10min后放入酶標儀作雙波長吸光度檢測，檢測波長570nm，參考波長630nm。(4)實驗結果苔盼藍活細胞計數(shù)法檢測分析結果顯示：胃癌細胞在土鱉蟲糖蛋白作用24h、36h和48h后，均呈現(xiàn)明顯的抑制作用，多數(shù)細胞出現(xiàn)壞死癥狀，與陰性對照組相比有顯著性差異，p＜0.05。其實驗結果見表1。表1糖蛋白對胃癌細胞的抑制作用土鱉蟲糖蛋白濃度(mg/L)24h抑制率(％)36h抑制率(％)48h抑制率(％)00000.0861.461.852.970.8606.2311.4220.358.60012.4623.6232.4686.0048.7954.8258.54MTT法檢測結果顯示：胃癌細胞對糖蛋白比較敏感，作用36h即呈現(xiàn)較明顯的抑制作用，作用48h后抑制作用反而降低，與陰性對照組相比有顯著性差異，p＜0.05。其實驗結果見表2。表2糖蛋白對胃癌細胞作用24h、36h和48h的MTT檢測土鱉蟲糖蛋白濃度(mg/L)24h抑制率(％)36h抑制率(％)48h抑制率(％)00000.0862.688.906.320.8606.1412.2610.174.23828.4636.4632.378.72442.2053.6848.62采用了上述技術方案后，本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明通過PBS溶液對土鱉蟲進行浸泡預處理，可有效除去臭味，然后再加入脫脂劑十二烷基苯磺酸鈉進行超聲處理可有效除去土鱉蟲生物體內(nèi)的脂溶性色素及脂肪酸，同時還可以除去部分水溶性色素，進一步降低了脂溶性物質(zhì)對糖蛋白提取的干擾；(2)本發(fā)明采用微波輔助浸提及水浴浸提，由于微波能可使溶劑分子運動速度加快，滲透、擴散及溶解速度加快，加速糖蛋白從細胞轉移到溶劑中，隨著微波功率的提高，進一步提高了糖蛋白的提取效率，大大縮短了提取時間；(3)本發(fā)明采用酶解法來去除游離的蛋白質(zhì)，與Sevag法相比，酶解法除蛋白的反應條件溫和，而且通過加入特定的復合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶)可有效去除游離蛋白質(zhì)，同時還不會破壞糖蛋白的活性，經(jīng)過酶解處理，離子交換柱處理后得到的土鱉蟲糖蛋白純度提高。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，包括下列步驟：(1)預處理：取新鮮的雌性土鱉蟲清洗干凈，然后加入pH3.5的PBS溶液浸泡15min，然后用蒸餾水清洗，將雌性土鱉蟲烘干、粉碎，得到土鱉蟲粉；(2)脫脂處理：取步驟(1)得到的土鱉蟲粉100g，然后加入土鱉蟲粉重量5倍的質(zhì)量濃度為8％的十二烷基苯磺酸鈉進行超聲處理(超聲功率為260V，超聲時間為0.5min，溫度控制在25℃)，抽濾，得到脫脂土鱉蟲粉；(3)糖蛋白的提?。喝〔襟E(2)中的脫脂土鱉蟲粉，然后再加入脫脂土鱉蟲粉重量3倍的0.2mol/L鹽溶液進行微波輔助浸提(微波功率為230W,提取時間為1.5min)，然后再進行水浴浸提(溫度為45℃，浸提時間為0.5h)，離心分離，經(jīng)過減壓濃縮得到土鱉蟲糖蛋白粗提液；(4)糖蛋白的純化：取步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液，加入土鱉蟲糖蛋白粗提液體積3倍的體積濃度為45％的乙醇進行分級沉淀，棄去上清液，收集沉淀物，然后用蒸餾水將沉淀物進行復溶，調(diào)pH為3.5，溫度控制在45℃，再加入沉淀物重量0.2倍復合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶的質(zhì)量比為0.35:0.2:0.1)進行酶解，酶解結束后在95℃條件滅酶，得到酶解液，最后將酶解液經(jīng)過超濾膜(截留分子量為8000Da)處理后，再過DEAE-52陰離子交換柱進行分離純化，用0.2mol/L的氯化鈉洗脫，檢測糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脫峰，將洗脫液透析處理，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。此條件下土鱉蟲糖蛋白的提取率為10.89％。實施例2一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，包括下列步驟：(1)預處理：取新鮮的雌性土鱉蟲清洗干凈，然后加入pH4.2的PBS溶液浸泡20min，然后用蒸餾水清洗，將雌性土鱉蟲烘干、粉碎，得到土鱉蟲粉；(2)脫脂處理：取步驟(1)得到的土鱉蟲粉100g，然后加入土鱉蟲粉重量7倍的質(zhì)量濃度為9％的十二烷基苯磺酸鈉進行超聲處理(超聲功率為300V，超聲時間為1min，溫度控制在28℃)，抽濾，得到脫脂土鱉蟲粉；(3)糖蛋白的提?。喝〔襟E(2)中的脫脂土鱉蟲粉，然后再加入脫脂土鱉蟲粉重量5倍的0.25mol/L鹽溶液進行微波輔助浸提(微波功率為260W,提取時間為2.5min)，然后再進行水浴浸提(溫度為50℃，浸提時間為1h)，離心分離，經(jīng)過減壓濃縮得到土鱉蟲糖蛋白粗提液；(4)透析處理：取步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液，于截留分子量為500Da的透析袋中，蒸餾水透析48h，得到土鱉蟲糖蛋白保留液。(5)糖蛋白的純化：取步驟(4)中的土鱉蟲糖蛋白保留液，加入土鱉蟲糖蛋白粗提液體積5倍的體積濃度為55％的乙醇進行分級沉淀，棄去上清液，收集沉淀物，然后用蒸餾水將沉淀物進行復溶，調(diào)pH為4.2，溫度控制在48℃，再加入沉淀物重量0.3倍復合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶的質(zhì)量比為0.4:0.25:0.17)進行酶解，酶解結束后在95℃條件滅酶，得到酶解液，最后將酶解液經(jīng)過超濾膜(截留分子量為8000Da)處理后，再過DEAE-52陰離子交換柱進行分離純化，用0.25mol/L的氯化鈉洗脫，檢測糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脫峰，將洗脫液透析處理，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。此條件下土鱉蟲糖蛋白的提取率為11.45％。實施例3一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，包括下列步驟：(1)預處理：取新鮮的雌性土鱉蟲清洗干凈，然后加入pH5的PBS溶液浸泡28min，然后用蒸餾水清洗，將雌性土鱉蟲烘干、粉碎，得到土鱉蟲粉；(2)脫脂處理：取步驟(1)得到的土鱉蟲粉100g，然后加入土鱉蟲粉重量8倍的質(zhì)量濃度為9.5％的十二烷基苯磺酸鈉進行超聲處理(超聲功率為350V，超聲時間為1.5min，溫度控制在32℃)，抽濾，得到脫脂土鱉蟲粉；(3)糖蛋白的提?。喝〔襟E(2)中的脫脂土鱉蟲粉，然后再加入脫脂土鱉蟲粉重量7倍的0.3mol/L鹽溶液進行微波輔助浸提(微波功率為280W,提取時間為3.5min)，然后再進行水浴浸提(溫度為55℃，浸提時間為1.5h)，離心分離，經(jīng)過減壓濃縮得到土鱉蟲糖蛋白粗提液；(4)透析處理：取步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液，于截留分子量為500Da的透析袋中，蒸餾水透析48h，得到土鱉蟲糖蛋白保留液。(5)糖蛋白的純化：取步驟(4)中的土鱉蟲糖蛋白保留液，加入土鱉蟲糖蛋白粗提液體積8倍的體積濃度為60％的乙醇進行分級沉淀，棄去上清液，收集沉淀物，然后用蒸餾水將沉淀物進行復溶，調(diào)pH為5.3，溫度控制在56℃，再加入沉淀物重量0.45倍復合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶的質(zhì)量比為0.5:0.3:0.23)進行酶解，酶解結束后在95℃條件滅酶，得到酶解液，最后將酶解液經(jīng)過超濾膜(截留分子量為8000Da)處理后，再過DEAE-52陰離子交換柱進行分離純化，用0.3mol/L的氯化鈉洗脫，檢測糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脫峰，將洗脫液透析處理，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。此條件下土鱉蟲糖蛋白的提取率為12.36％。實施例4一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，包括下列步驟：(1)預處理：取新鮮的雌性土鱉蟲清洗干凈，然后加入pH5.8的PBS溶液浸泡35min，然后用蒸餾水清洗，將雌性土鱉蟲烘干、粉碎，得到土鱉蟲粉；(2)脫脂處理：取步驟(1)得到的土鱉蟲粉100g，然后加入土鱉蟲粉重量8倍的質(zhì)量濃度為10％的十二烷基苯磺酸鈉進行超聲處理(超聲功率為400V，超聲時間為1.8min，溫度控制在35℃)，抽濾，得到脫脂土鱉蟲粉；(3)糖蛋白的提取：取步驟(2)中的脫脂土鱉蟲粉，然后再加入脫脂土鱉蟲粉重量8倍的0.34mol/L鹽溶液進行微波輔助浸提(微波功率為300W,提取時間為2min)，然后再進行水浴浸提(溫度為60℃，浸提時間為2h)，離心分離，經(jīng)過減壓濃縮得到土鱉蟲糖蛋白粗提液；(4)透析處理：取步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液，于截留分子量為500Da的透析袋中，蒸餾水透析48h，得到土鱉蟲糖蛋白保留液。(5)糖蛋白的純化：取步驟(4)中的土鱉蟲糖蛋白保留液，加入土鱉蟲糖蛋白粗提液體積10倍的體積濃度為65％的乙醇進行分級沉淀，棄去上清液，收集沉淀物，然后用蒸餾水將沉淀物進行復溶，調(diào)pH為5.8，溫度控制在60℃，再加入沉淀物重量0.5倍復合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶的質(zhì)量比為0.58:0.32:0.27)進行酶解，酶解結束后在95℃條件滅酶，得到酶解液，最后將酶解液經(jīng)過超濾膜(截留分子量為8000Da)處理后，再過DEAE-52陰離子交換柱進行分離純化，用0.32mol/L的氯化鈉洗脫，檢測糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脫峰，將洗脫液透析處理，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。此條件下土鱉蟲糖蛋白的提取率為12.08％。對比實施例采用傳統(tǒng)方法提?。悍Q取步驟(1)中的土鱉蟲粉100g，加入蒸餾水水浴浸提，過濾后將所得濾液中加入Sevag試劑(氯仿與正丁醇的體積比為3:1)，除去沉淀蛋白，將上清液過DEAE-50纖維素離子交換柱純化，用洗脫液洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。此條件下土鱉蟲糖蛋白的提取率為8.15％。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 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