平滑受體配體及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及平滑受體配體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

平滑受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)中的F家族，其功能紊亂將導(dǎo)致出生缺陷。20世紀(jì)50年代在美國(guó)西部發(fā)現(xiàn)許多出生小羊只有一只眼睛，通過對(duì)此種獨(dú)眼癥的研究發(fā)現(xiàn)了平滑受體的第一個(gè)天然植物小分子配體環(huán)巴胺(Cyclopamine)。平滑受體的功能調(diào)控與一系列癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，因此平滑受體是醫(yī)藥開發(fā)中的重要靶標(biāo)。在過去的幾十年中，許多的先導(dǎo)化合物配體被發(fā)現(xiàn)，其中兩個(gè)小分子藥物在2015年被推向市場(chǎng)。然而，平滑受體突變體導(dǎo)致的抗藥性很快顯現(xiàn)出來，亟需針對(duì)現(xiàn)有藥物進(jìn)行進(jìn)一步的改造。與此同時(shí)，最近幾年平滑受體的結(jié)構(gòu)研究取得了豐富的成果，其跨膜區(qū)和胞外區(qū)都分別得到了高分辨解析。然而，平滑受體多區(qū)域整合的結(jié)構(gòu)還未獲成功，其也是高特異性可規(guī)避抗藥性的小分子藥物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。

美國(guó)專利US2010/324048 A1中沒有將包括硝基在內(nèi)的多種官能團(tuán)引入化合物，同時(shí)沒有指出取代基團(tuán)的引入對(duì)目標(biāo)蛋白的熱穩(wěn)定性提高的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是開發(fā)針對(duì)平滑受體(Smoothened receptor，SMO)的一類新型小分子配體，提高其熱穩(wěn)定性。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種平滑受體配體，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為：

其中，Ar為取代或未取代的苯環(huán)及芳香雜環(huán)，m＝0或1。

優(yōu)選地，所述的苯環(huán)及芳香雜環(huán)上的取代基團(tuán)為取代或未取代的硝基、鹵素、擬鹵素、羧基、磺酸基、甲基、羥基、巰基、氨基、烷基和烴基中的至少一種。

更優(yōu)選地，所述的Ar為苯環(huán)，苯環(huán)的2位未取代、或被三氟甲基取代、或被硝基取代。

優(yōu)選地，所述的平滑受體配體，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明還提供了上述的平滑受體配體的衍生物，其特征在于，為上述的平滑受體配體的對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體、阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體、消旋體、代謝產(chǎn)物、鹽類、水合物或高聚物。

本發(fā)明還提供了上述的平滑受體配體的或其衍生物在作為平滑受體的配體或作為SMO受體拮抗劑中的應(yīng)用。

一種藥物，其特征在于，其含有上述的平滑受體配體的或其衍生物。

本發(fā)明在之前平滑受體的結(jié)構(gòu)信息基礎(chǔ)上(PDB：4JKV，4OQR，4N4W，4QIM，4QIN)，本發(fā)明認(rèn)為有必要在小分子配體和K395(hSMO)的側(cè)鏈上氨基之間建立新的明確的相互作用關(guān)系，這樣可以進(jìn)一步穩(wěn)定平滑受體，更好地進(jìn)行多區(qū)域整合的結(jié)構(gòu)研究，也有利于小分子的結(jié)合，克服因突變導(dǎo)致的藥物失效。本發(fā)明在已知配體LY2940680的基礎(chǔ)上，引入了硝基(圖1A)，此化合物TC114極大地穩(wěn)定了平滑受體，在相關(guān)的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中(圖1B)，在原有配體的基礎(chǔ)上更進(jìn)一步成為超穩(wěn)定配體(super stabilizing ligand)。TC114應(yīng)用于多區(qū)域平滑受體的結(jié)晶學(xué)結(jié)構(gòu)研究，獲得了2.7埃的高分辨率(圖1C)。同時(shí)，基于熒光素酶報(bào)告基因的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了TC114大大優(yōu)于原先LY2940680的抑制劑活性(圖1D)。

受到以上結(jié)果的鼓舞，本發(fā)明拓展了小分子配體的設(shè)計(jì)思路，從已知化合物出發(fā)，在適當(dāng)位置引入硝基官能團(tuán)(圖2A)。以不同的已知化合物為母體，通過改變硝基和其他取代基的位置和數(shù)目，設(shè)計(jì)合成了多個(gè)系列的化合物。另外，本發(fā)明也進(jìn)一步地引入芳香氮雜原子的氮-氧化物作為新的作用位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成一系列化合物(圖2B)。已知母體化合物包括，但不限于，LY2940680、SANT-1、Cyclopamine、GDC-0449以及SAG等。取代基包括，但不限于，鹵素原子、擬鹵素官能團(tuán)、羧基、磺酸基、甲基及其取代甲基、羥基、巰基、氨基及衍生官能團(tuán)等。所列小分子配體符合通式以及相關(guān)聯(lián)的對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體、阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體、消旋體、代謝產(chǎn)物等，以及相應(yīng)的鹽類、水合物、高聚物等不同劑型或其他任何形式的潛藥。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明開發(fā)了針對(duì)平滑受體(Smoothened receptor，SMO)的一類新型小分子配體。本發(fā)明通過結(jié)合平滑受體的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，在小分子的相應(yīng)位置引入硝基及類似官能團(tuán)，進(jìn)一步增強(qiáng)配體和受體之間的相互作用。此類小分子配體可以作為工具分子應(yīng)用于平滑受體的功能和結(jié)構(gòu)研究，也可以作為與平滑受體相關(guān)疾病的醫(yī)藥開發(fā)候選。

附圖說明

圖1為含硝基的平滑受體小分子配體的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證。1A.基于LY2940680的小分子配體TC114的設(shè)計(jì)。1B.TC114極大地增強(qiáng)了平滑受體的熱穩(wěn)定性。1C.TC114與多區(qū)域整合的平滑受體的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)。1D.基于熒光素酶報(bào)告基因的抑制劑活性細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

圖2為含硝基的平滑受體小分子配體的拓展。2A.植入不同數(shù)目和不同位置取代的硝基化合物的設(shè)計(jì)。2B.以氮雜原子的氮氧化物為新作用位點(diǎn)的化合物設(shè)計(jì)。其中，Ar代表含有一個(gè)或多個(gè)硝基及其它取代基團(tuán)的苯基，或含有一個(gè)或多個(gè)取代基的芳雜環(huán)的氮氧化物。配體代表已知SMO配體，例如LY2940680，SANT-1，Cyclopamine，GDC-0449或SAG的母體骨架。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1：配體及其合成

1、平滑受體配體，其結(jié)構(gòu)式分別為(I)-(XXIX)。

2、除配體TC113、TC641、TC642、TC643、TC658和TC659外，其它配體合成方法如下：

在5mL N-甲基吡咯烷酮(NMP)中加入0.21g4-(N-Boc-甲氨基)哌啶、0.2g1，4-二氯呔嗪和0.28g碳酸鉀，加熱至80℃反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后加入20mL飽和氯化銨溶液淬滅，分出有機(jī)相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有機(jī)相，依次用飽和氯化銨水溶液和飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，濃縮得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用柱層析(200-300目硅膠，洗脫劑為正己烷∶乙酸乙酯＝3∶1)分離得到純凈的中間體A。

將0.37g上述中間體A與0.22g5-(1-甲基吡唑)硼酸頻哪醇酯、0.06g四(三苯基膦)鈀和0.22g碳酸鈉加入6mL體積比為3∶2∶1的甲苯/乙醇/水的混合溶劑中，加熱至90℃反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后加入飽和氯化銨溶液淬滅，分出有機(jī)相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有機(jī)相，依次用飽和氯化銨水溶液和飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，濃縮得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用柱層析(200-300目硅膠，洗脫劑為正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)分離得到純凈的中間體B。

將0.25g上述中間體B與2mL4M氯化氫/二氧六環(huán)溶液加入2mL二氯甲烷中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后濃縮除去溶劑和多余的氯化氫得到純凈的中間體1。

將1.2mmol取代的苯甲酸和1.4mmol2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)在室溫下加入3mL二氯甲烷中攪拌反應(yīng)0.5h，然后加入1.0mmol中間體1以及1.8mmolN，N-二異丙基乙胺(DIPEA)，于室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后加入飽和食鹽水淬滅，分出有機(jī)相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有機(jī)相，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，濃縮得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用柱層析(200-300目硅膠，洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分離得到純凈的配體化合物。反應(yīng)通式如下：

其中，結(jié)構(gòu)式分別為(I)-(XXIX)的配體對(duì)應(yīng)的取代的苯甲酸和中間體見下表，各取代的苯甲酸均為市售產(chǎn)品：

3、結(jié)構(gòu)式為(VI)的配體TC113由TC114反應(yīng)得到，具體步驟如下：

將0.1g TC114溶解于10mL甲醇中，加入5％鈀碳催化劑(阿拉丁，P116794)，在通入氫氣的條件下室溫?cái)嚢?h。反應(yīng)結(jié)束后過濾除去鈀碳催化劑，濃縮得到純凈的TC113。

結(jié)構(gòu)式為(XIII)(XIV)(XV)的配體TC641、TC642和TC643由下述化合物TC111反應(yīng)得到。TC111采用步驟2相同方法，通過表格中的(安耐吉，貨號(hào)A020197)作為取代的苯甲酸合成得到。

TC111的表征數(shù)據(jù)請(qǐng)?zhí)峁?。TC111：無色固體。分離產(chǎn)率49％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.87-2.39(m，4H，CH₂)，2.92(s，3H，CH₃)，2.99(br，1H，CH₂)，3.39(br，1H，CH₂)，4.04(s，3H，CH₃)，4.22(br，2H，CH₂)，4.92(br，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.61(br，1H，CH)，7.67(d，J＝1.5Hz，2H，CH)，7.84-7.91(m，2H，CH)，7.97-7.99(m，2H，CH)，8.06-8.10(m，2H，CH)，10.08(s，1H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ22.1，28.2，28.9，29.2，31.4，37.8，50.2，108.7，120.9，124.2，125.8，127.0，127.5，129.5，131.6，136.3，137.7，142.0，158.7，169.9，191.0；高分辨質(zhì)譜C₂₆H₂₆N₆O₂[M+H]⁺計(jì)算值：455.2190；實(shí)測(cè)值：455.2186。

具體步驟如下：

TC641：將0.1g TC111溶解于2mL冰醋酸、2mL硝基甲烷(安耐吉，貨號(hào)N1096611000)和0.5g乙酸銨的混合溶液中，加熱至90℃攪拌3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加入飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅，分出有機(jī)相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有機(jī)相，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，濃縮得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用柱層析(200-300目硅膠，洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分離得到純凈的TC641。

TC642：將0.05g TC641溶解于3mL甲醇中，加入0.038g硼氫化鈉(國(guó)藥，貨號(hào)80115860)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加入飽和氯化銨水溶液淬滅，分出有機(jī)相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有機(jī)相，依次用飽和氯化銨水溶液和飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，濃縮得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用柱層析(200-300目硅膠，洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分離得到純凈的TC642。

TC643：將0.1g TC111溶解于2mL甲醇、2mL硝基甲烷和0.5g乙酸鈉的混合溶液中，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加入飽和食鹽水淬滅，分出有機(jī)相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，濃縮得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用柱層析(200-300目硅膠，洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分離得到純凈的TC643。

結(jié)構(gòu)式為(XX)(XXI)的配體TC658、TC659由下述化合物L(fēng)Y2940680反應(yīng)得到。

具體步驟如下：

TC658：在2mL二甲基亞砜(DMSO)中加入0.1g苯酚、0.08g叔丁醇鉀，加熱至66℃，加入0.1g LY2940680，反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后加入20mL飽和氯化銨溶液淬滅，分出有機(jī)相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有機(jī)相，依次用飽和氯化銨水溶液和飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，濃縮得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用柱層析(200-300目硅膠，洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分離得到純凈的TC658。

TC659：在5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中依次加入0.07mL苯甲醇、0.05g氫化鈉(60％)，室溫?cái)嚢?0分鐘后加入0.1g LY2940680，反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后加入20mL飽和氯化銨溶液淬滅，分出有機(jī)相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有機(jī)相，依次用飽和氯化銨水溶液和飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，濃縮得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用柱層析(200-300目硅膠，洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分離得到純凈的TC659。

4、將各配體進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，具體如下：

TC101：無色固體。分離產(chǎn)率62％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.87-2.21(m，4H，CH₂)，2.93(s，3H，CH₃)，2.98(br，1H，CH₂)，3.38(br，1H，CH₂)，4.05(s，4H，CH₃ and CH₂)，4.19(br，1H，CH₂)，4.90(br，1H，CH)，6.59(s，1H，CH)，7.43(br，5H，CH)，7.66(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.81-7.90(m，2H，CH)，8.06-8.10(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ17.6，29.5，29.6，30.6，38.2，49.3，50.7，109.1，121.4，124.6，126.2，127.9，128.5，129.5，131.5，131.9，136.7，136.8，138.1，159.4；高分辨質(zhì)譜C₂₅H₂₆N₆O[M+H]⁺計(jì)算值：427.2247；實(shí)測(cè)值：427.2245。

TC102：無色固體。分離產(chǎn)率60％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ(ppm)1.95-2.22(m，4H，CH₂)，3.01-3.36(m，5H，CH₃ and CH₂)，3.85(s，3H，CH₃)，4.05-4.19(m，5H，CH₃ and CH₂)，4.84(br，1H，CH)，6.59(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，6.94(d，J＝8.5Hz，2H，CH)，7.42(d，J＝8.5Hz，2H，CH)，7.66(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.82-7.90(m，2H，CH)，8.06(d，J＝8.5Hz，1H，CH)，8.11(d，J＝8.0Hz，1H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ22.6，25.4，27.1，31.8，38.2，38.5，50.6，55.2，109.0，113.6，121.3，124.6，126.1，127.8，128.8，131.4，131.9，136.7，138.1，159.4，160.5；高分辨質(zhì)譜C₂₆H₂₈N₆O₂[M+H]⁺計(jì)算值：457.2347；實(shí)測(cè)值：457.2340.

TC103：無色固體。分離產(chǎn)率55％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.83-2.20(m，4H，CH₂)，2.93(s，3H，CH₃)，3.08(br，1H，CH₂)，3.40(br，1H，CH₂)，4.06(s，4H，CH₃ and CH₂)，4.19(br，1H，CH₂)，4.86(br，1H，CH)，6.59(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，7.37-7.43(m 4H，CH)，7.66(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，7.82-7.90(m，2H，CH)，8.06-8.10(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ28.6，29.6，32.5，38.3，50.57，50.63，109.1，121.3，124.6，126.2，127.9，128.4，128.8，131.5，132.0，135.1，135.6，136.7，138.1，147.5，159.4；高分辨質(zhì)譜C₂₅H₂₅ClN₆O[M+H]⁺計(jì)算值：461.1851；實(shí)測(cè)值：461.1848。

TC104：無色固體。分離產(chǎn)率47％.¹HNMR(500MHz，CDCl₃)主要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ(ppm)1.84-2.33(m，4H，CH₂)，2.93(s，3H，CH₃)，3.39-3.44(m，2H，CH₂)，4.07(s，3H，CH₃)，4.22-4.25(m，2H，CH₂)，4.88-4.93(m，1H，CH)，6.60(br，1H，CH)，7.61-7.66(m，3H，CH)，7.84-7.92(m，2H，CH)，8.07-8.15(m，2H，CH)，8.30-8.32(m，2H，CH)；次要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ(ppm)1.84-2.33(m，4H，CH₂)，3.13(s，3H，CH₃)，2.90-3.04(m，2H，CH₂)，3.66-3.73(m，2H，CH₂)，4.03(s，3H，CH₃)，5.34-5.36(m，1H，CH)，6.60(br，1H，CH)，7.61-7.66(m，3H，CH)，7.84-7.92(m，2H，CH)，8.07-8.15(m，2H，CH)，8.30-8.32(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)主要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ27.0，28.4，29.7，32.2，38.1，50.5，51.6，109.0，121.2，123.7，126.1，127.78，127.80，131.4，131.9，136.6，138.0，142.8，147.3，148.0，159.3，165.6，169.1；次要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ(ppm)22.5，25.4，27.8，31.7，38.1，50.2，56.9，107.6，124.0，124.5，127.1，128.3，128.4，131.6，132.0，136.5，138.0，142.8，147.6，148.0，159.1，165.6，169.4；高分辨質(zhì)譜C₂₅H₂₅N₇O₃[M+H]⁺計(jì)算值：472.2092；實(shí)測(cè)值：472.2087。

TC114：無色固體。分離產(chǎn)率49％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)主要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ(ppm)1.84-2.36(m，4H，CH₂)，2.77(s，3H，CH₃)，3.60-3.67(m，2H，CH₂)，4.01(s，3H，CH₃)，4.39-4.46(m，2H，CH₂)，4.88-4.93(m，1H，CH)，6.65(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.62(d，J＝8.5Hz，1H，CH)，7.70(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.98-8.06(m，2H，CH)，8.09-8.15(m，1H，CH)，8.25-8.27(m，1H，CH)，8.49-8.52(m，1H，CH)，8.60(d，J＝1.5Hz，1H，CH)；次要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ(ppm)1.84-2.36(m，4H，CH₂)，3.14(s，3H，CH₃)，3.12-3.21(m，2H，CH₂)，3.45-3.49(m，1H，CH)，3.98(s，3H，CH₃)，4.18-4.20(m，2H，CH₂)，6.63(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.61(d，J＝8.5Hz，1H，CH)，7.69(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.98-8.06(m，2H，CH)，8.09-8.15(m，1H，CH)，8.25-8.27(m，1H，CH)，8.49-8.52(m，1H，CH)，8.60(d，J＝1.5Hz，1H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)主要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ27.8，28.2，32.0，38.1，50.7，51.3，51.5，109.9，122.2，122.42(q，J＝272.9Hz)，122.45(q，J＝4.7Hz)，126.2，127.3，128.2(q，J＝33.5Hz)，128.83，128,85，133.0，134.1，134.6，138.3，141.1(q，J＝2.8Hz)，146.3，147.7，157.4，166.8；次要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ(ppm)27.7，28.9，29.3，38.0，50.1，51.0，56.3，109.8，115.6(q，J＝286.1Hz)，122.0，122.8(q，J＝4.7Hz)，125.5，127.1，128.39，128.42(q，J＝33.5Hz)，128.6，128.8，132.9，134.6，135.0，138.2，140.8(q，J＝2.3Hz)，146.8，147.8，158.0，166.5；高分辨質(zhì)譜C₂₆H₂₄F₃N₇O₃[M+H]⁺計(jì)算值：540.1965；實(shí)測(cè)值：540.1964。

TC113：無色固體。分離產(chǎn)率52％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)主要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ(ppm)1.76-2.24(m，4H，CH₂)，2.78(s，3H，CH₃)，3.34-3.40(m，2H，CH₂)，4.06(s，3H，CH₃)，4.18-4.23(m，4H，CH₂)，4.90-4.94(m，1H，CH)，6.60(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，6.83(d，J＝8.0Hz，1H，CH)，6.94(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.09(d，J＝8.0Hz，1H，CH)，7.66(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，7.81-7.90(m，2H，CH)，8.03-8.13(m，2H，CH)；次要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ(ppm)1.76-2.24(m，4H，CH₂)，3.09(s，3H，CH₃)，2.94-3.09(m，2H，CH₂)，3.57-3.62(m，1H，CH)，4.02(s，3H，CH₃)，4.11-4.18(m，4H，CH₂)，6.59(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，6.83(d，J＝8.0Hz，1H，CH)，6.96(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.09(d，J＝8.0Hz，1H，CH)，7.65(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，7.81-7.90(m，2H，CH)，8.03-8.13(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)主要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ17.5，27.5，31.7，38.11，38.16，51.0，56.7，109.0，112.0(q，J＝4.5Hz)，117.6，121.3，123.6(q，J＝272.2Hz)，124.6，124.8(q，J＝2.5Hz)，126.0，127.4(q，J＝31.4Hz)，127.8，128.2，131.4，131.9，136.7，138.0，147.2，147.3，159.5，169.6；次要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ(ppm)14.1，29.1，29.5，30.6，49.3，50.1，50.9，109.8，112.2(q，J＝4.5Hz)，117.4，121.3，123.6(q，J＝272.2Hz)，124.0(q，J＝2.1Hz)，124.4，126.1，127.4(q，J＝31.4Hz)，127.78，127.80，131.6，132.0，136.6，138.1，147.4，147.6，159.4，169.6；高分辨質(zhì)譜C₂₆H_26qF₃N₇O[M+H]⁺計(jì)算值：510.2224；實(shí)測(cè)值：510.2221。

TC262：無色固體。分離產(chǎn)率88％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.75-2.25(m，4H，CH₂)，3.03(s，3H，CH₃)，3.33(t，J＝13.0Hz，2H，CH₂，)，3.86(s，2H，CH₃)，4.05(s，3H，CH₃)，4.17(d，J＝8.0Hz，1H，CH₂)，4.80-4.85(m，1H，CH)，6.59(s，1H，CH)，7.51-7.55(m，1H，CH)，7.63-7.70(m，2H，CH)，7.82-7.92(m，2H，CH)，8.05-8.17(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ27.8，28.8，29.9，30.2，38.2，40.6，50.7，51.4，55.6，109.1，121.3，121.9，124.1，124.6，126.2，127.9，129.4，131.5，132.0，135.5，136.6，137.0，138.1，147.3，148.2，159.3，169.5；高分辨質(zhì)譜C₂₆H₂₇N₇O₃[M+H]⁺計(jì)算值：486.2248；實(shí)測(cè)值：486.2248。

TC277：無色固體。分離產(chǎn)率79％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.96-2.25(m，4H，CH₂)，3.18(s，3H，CH₃)，3.38(br，2H，CH₂)，4.06(s，3H，CH₃)，4.24(d，J＝13.0Hz，2H，CH₂)，4.70-4.80(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.66(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，7.86-7.94(m，3H，CH)，8.09-8.14(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ38.3，50.6，109.2，121.4，126.4，127.6，128.0，131.8，132.4，136.3，138.2，158.9，162.1；高分辨質(zhì)譜C₂₃H₂₃N₇O₃S[M+H]⁺計(jì)算值：478.1656；實(shí)測(cè)值：478.1681。

TC288：無色固體。分離產(chǎn)率53％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.84-2.29(m，4H，CH₂)，2.91(s，3H，CH₃)，3.01(br，1H，CH₂)，3.42(t，J＝12.5Hz，2H，CH₂)，4.08(s，3H，CH₃)，4.23(d，J＝12.5Hz，1H，CH₂)，4.87-4.97(m，1H，CH)，6.61(s，1H，CH)，7.49-7.52(m，2H，CH)，7.69(s，1H，CH)，7.84-7.92(m，2H，CH)，8.05-8.16(m，4H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ25.5，27.1，28.6，29.2，30.2，31.5，36.6，38.1，50.6，51.6，52.3，67.9，109.1，124.7，125.4，126.2，126.7，128.0，130.1，138.1，159.4，162.9；高分辨質(zhì)譜C₂₆H₂₆N₆O₃[M+H]⁺計(jì)算值：471.2139；實(shí)測(cè)值：471.2147。

TC637：無色固體。分離產(chǎn)率82％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.94-2.25(m，4H，CH₂)，3.02(s，6H，CH₃)，3.04(s，3H，CH₃)，3.27(br，1H，CH₂)，4.06(s，3H，CH₃)，4.16(d，J＝13.0Hz，2H，CH₂)，4.89(br，1H，CH)，6.59(s，1H，CH)，6.73(d，J＝8.5Hz，2H，CH)，7.39(d，J＝8.5Hz，2H，CH)，7.65(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，7.82-7.90(m，2H，CH)，8.05-8.13(m，2H，CH)，8.31(s，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ38.2，40.3，50.7，109.0，111.4，121.3，124.6，126.1，127.8，131.5，132.0，136.6，138.0，147.2，159.3；高分辨質(zhì)譜C₂₇H₃₁N₇O[M+H]⁺計(jì)算值：442.2350；實(shí)測(cè)值：442.2329。

TC638：無色固體。分離產(chǎn)率52％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.91-2.33(m，4H，CH₂)，2.96(s，3H，CH₃)，3.13(br，1H，CH₂)，3.46(br，2H，CH₂)，4.05(s，3H，CH₃)，4.28(d，J＝13.0Hz，1H，CH₂)，4.89(br，1H，CH)，6.59(s，1H，CH)，7.65(br，2H，CH)，7.79(d，J＝3.0Hz，1H，CH)，7.85-7.93(m，2H，CH)，8.06-8.14(m，2H，CH)，8.31(s，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ17.6，28.5，29.1，29.9，32.5，38.2，38.5，50.7，53.4，109.2，121.4，124.4，124.8，126.4，131.7，132.3，136.4，138.1，147.9；高分辨質(zhì)譜C₂₅H₂₅N₇O₃[M+H]⁺計(jì)算值：472.2092；實(shí)測(cè)值：472.2069。

TC639：無色固體。分離產(chǎn)率79％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.82-2.23(m，4H，CH₂)，2.81(s，3H，CH₃)，3.17(br，1H，CH₂)，3.41(t，J＝11.0Hz，2H，CH₂)，4.06(s，3H，CH₃)，4.27(d，J＝12Hz，1H，CH₂)，4.91-4.97(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.42-7.46(m，1H，CH)，7.58-7.66(m，2H，CH)，7.76(dt，J＝7.5，1.5Hz，1H，CH)，7.84-7.92(m，2H，CH)，8.05-8.09(m，1H，CH)，8.14-8.16(m，1H，CH)，8.22-8.25(m，1H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ27.6，31.2，38.2，38.3，38.5，51.2，57.1，109.2，121.4，124.5，124.7，124.8，125.0，126.2，126.3，127.4，127.8，127.9，129.6，131.6，132.2，133.5，134.7，138.1，144.8；高分辨質(zhì)譜C₂₅H₂₅N₇O₃[M+H]⁺計(jì)算值：472.2092；實(shí)測(cè)值：472.2106。

TC641：無色固體。分離產(chǎn)率93％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.87-2.31(m，4H，CH₂)，2.94(s，3H，CH₃)，3.04(br，1H，CH₂)，3.45(br，1H，CH₂)，4.06(s，3H，CH₃)，4.27(d，J＝12.5Hz，1H，CH₂)，4.89(br，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.52(d，J＝8.0Hz，2H，CH)，7.63-7.66(m，4H，CH)，7.84-7.93(m，2H，CH)，8.01-8.76(m，3H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ28.5，38.2，50.7，109.2，121.4，126.2，127.9，131.1，132.0，132.3，133.9，136.4，137.9，138.1，140.0，159.0；高分辨質(zhì)譜C₂₇H₂₇N₇O₃[M+H]⁺計(jì)算值：498.2248；實(shí)測(cè)值：498.2251。

TC642：無色固體。分離產(chǎn)率80％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.85-2.23(m，4H，CH₂)，2.92(s，3H，CH₃)，3.08(br，1H，CH₂)，3.37，(t，J＝7.0Hz，2H，CH₂)，3.43(br，2H，CH₂)，4.06(s，3H，CH₃)，4.25(d，J＝12.5Hz，1H，CH₂)，4.65(t，J＝7.0Hz，2H，CH₂)，4.88(br，1H，CH)，6.59(s，1H，CH)，7.30(m，2H，CH)，7.40(d，J＝7.5Hz，2H，CH)，7.66(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，7.84-7.91(m，2H，CH)，8.07-8.13(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ28.6，33.0，37.8，38.3，50.8，75.8，109.2，121.4，126.2，126.3，126.8，128.6，131.6，132.0，132.3，133.9，135.9，136.4，137.2，138.1，138.4，144.8；高分辨質(zhì)譜C₂₇H₂₉N₇O₃[M+H]⁺計(jì)算值：500.2405；實(shí)測(cè)值：500.2447。

TC643：無色固體。分離產(chǎn)率84％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.85-2.25(m，4H，CH₂)，2.90(s，3H，CH₃)，3.00(br，1H，CH)，3.08(br，1H，CH₂)，3.40(t，J＝13.0Hz，1H，CH₂)，4.01(s，3H，CH₃)，4.22(d，J＝12.5Hz，1H，CH₂)，4.50-4.63(m，2H，CH₂)，4.79-4.88(m，1H，CH)，5.46-5.49(m，1H，OH)，6.58(s，1H，CH)，7.37-7.47(m，4H，CH)，7.62(s，1H，CH)，7.84-7.92(m，2H，CH)，8.03-8.15(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ28.5，29.8，32.4，38.1，50.6，51.6，53.4，70.2，81.5，109.1，121.4，126.0，126.2，127.2，127.9，131.6，132.2，136.4，138.1，140.9，159.2；高分辨質(zhì)譜C₂₇H₂₉N₇O₄[M+H]⁺計(jì)算值：516.2354；實(shí)測(cè)值：516.2381。

TC645：無色固體。分離產(chǎn)率66％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.83-2.29(m，4H，CH₂)，2.81(s，3H，CH₃)，3.11(br，1H，CH₂)，3.44(t，J＝12.5Hz，2H，CH₂)，3.95(s，3H，CH₃)，4.07(s，3H，CH₃)，4.26(d，J＝12.5Hz，1H，CH₂)，4.91-4.97(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.50(d，J＝8.0Hz，2H，CH)，7.66(s，1H，CH)，7.84-7.92(m，2H，CH)，8.08-8.16(m，4H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ28.5，29.8，32.3，38.2，38.5，50.4，50.7，51.5，52.3，109.1，121.3，126.0，126.2，126.8，127.9，129.6，129.7，130.0，131.6，132.2，136.4，138.1，141.0，159.1，166.2；高分辨質(zhì)譜C₂₇H₂₈N₆O₃[M+H]⁺計(jì)算值：485.2296；實(shí)測(cè)值：485.2274。

TC649：無色固體。分離產(chǎn)率69％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.36(s，12H，CH₃)，1.85-2.24(m，4H，CH₂)，2.89(s，3H，CH₃)，3.08(br，1H，CH₂)，3.53(br，2H，CH₂)，3.95(s，3H，CH₃)，4.06(s，3H，CH₃)，4.35(br，1H，CH₂)，4.83-4.94(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.40(d，J＝7.0Hz，2H，CH)，7.65(s，1H，CH)，7.80-7.93(m，4H，CH)，8.09-8.17(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ24.8，28.5，29.8，32.3，38.2，38.5，50.4，50.7，51.5，52.3，75.0，84.0，109.4，121.3，126.0，126.2，126.8，127.9，129.6，129.7，130.0，131.6，132.2，134.9，136.4，138.2，141.0，159.1，166.2.

TC653：無色固體。分離產(chǎn)率82％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.82-2.23(m，4H，CH₂)，2.80(s，3H，CH₃)，3.01(br，2H，CH₂)，3.41(t，J＝11Hz，1H，CH₂)，4.06(s，3H，CH₃)，4.24(br，1H，CH₂)，4.80-4.90(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.02-7.07，(m，4H，CH)，7.16(t，J＝7.5Hz，1H，CH)，7.36-7.43(m，4H，CH)，7.59(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.83-7.92(m，2H，CH)，8.08-8.14(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ24.8，31.4，38.3，38.5，50.9，109.2，118.0，119.5，121.4，124.0，126.4，128.0，129.9，131.6，132.3，138.1，156.1，158.6，162.4；高分辨質(zhì)譜C₃₁H₃₀N₆O₂[M+H]⁺計(jì)算值：519.2503；實(shí)測(cè)值：519.2505。

TC654：無色固體。分離產(chǎn)率75％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm) 1.99-2.27(m，4H，CH₂)，3.00(s，3H，CH₃)，4.06(s，3H，CH₃)，5.11(s，2H，CH₂)，6.62(s，1H，CH)，7.01(d，J＝8.5Hz，1H，CH)，7.33-7.48(m，8H，CH)，7.66(s，1H，CH)，7.91-7.97(m，2H，CH)，8.12-8.17(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ27.2，29.3，31.8，38.4，51.0，70.1，109.5，127.5，128.1，128.6，136.4，138.1，147.1，159.8，168.9；高分辨質(zhì)譜C₃₂H₃₂N₆O₂[M+H]⁺計(jì)算值：533.2660；實(shí)測(cè)值：533.2641。

TC658：無色固體。分離產(chǎn)率70％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.77-2.29(m，4H，CH₂)，2.80(s，3H，CH₃)，3.04(br，2H，CH₂)，3.45(t，J＝11.0Hz，1H，CH₂)，4.07(s，3H，CH₃)，4.28-4.32(m，1H，CH₂)，4.91-4.97(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.05-7.11(m，2H，CH)，7.16-7.24(m，2H，CH)，7.29-7.34(m，2H，CH)，7.39-7.45(m，2H，CH)，7.65-7.66(m，1H，CH)，7.85-7.92(m，2H，CH)，8.07-8.16(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ27.6，28.0，28.7，29.2，29.6，31.7，38.3，51.1，109.2，116.2，119.7，121.4，124.2，126.4，128.8，130.0，131.6，132.4，138.2，147.1，155.4，158.0，168.6；高分辨質(zhì)譜C₃₂H₂₉F₃N₆O₂[M+H]⁺計(jì)算值：587.2377；實(shí)測(cè)值：587.2380。

TC659：無色固體。分離產(chǎn)率86％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm) 1.78-2.26(m，4H，CH₂)，2.76(s，3H，CH₃)，3.03(br，2H，CH₂)，3.46(t，J＝12.5Hz，1H，CH₂)，4.06(s，3H，CH₃)，4.24-4.34(m，1H，CH₂)，4.91-4.96(m，1H，CH)，5.13(s，2H，CH₂)，6.60(s，1H，CH)，7.17-7.20(m，1H，CH)，7.27-7.30(m，2H，CH)，7.33-7.48(m，5H，CH)，7.65-7.66(m，1H，CH)，7.85-7.93(m，2H，CH)，8.07-8.16(m，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ27.6，29.6，31.8，38.4，51.0，70.4，109.2，113.2，118.2，127.5，127.6，128.3，128.7，131.7，135.7，138.1，147.1，158.7，168.9；高分辨質(zhì)譜C₃₃H₃₁F₃N₆O₂[M+H]⁺計(jì)算值：601.2533；實(shí)測(cè)值：601.2531。

TC660：無色固體。分離產(chǎn)率92％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm)1.87-2.38(m，4H，CH₂)，2.81(s，3H，CH₃)，3.13(br，1H，CH₂)，3.45(t，J＝12.5Hz，2H，CH₂)，4.06(s，3H，CH₃)，4.14-4.29(m，2H，CH₂)，4.80-4.90(m，1H，CH)，6.61(s，1H，CH)，7.66(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.84-7.94(m，3H，CH)，8.02-8.16(m，4H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ28.4，30.4，32.4，38.5，50.6，53.4，109.2，124.7，125.5，126.4，128.0，131.8，132.3，136.3，138.1，142.0，142.7，158.9，166.7；高分辨質(zhì)譜C₂₅H₂₄N₈O₅[M+H]⁺計(jì)算值：517.1942；實(shí)測(cè)值：517.1954。

TC661：無色固體。分離產(chǎn)率68％.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，δ(ppm) 1.96-2.39(m，4H，CH₂)，2.81(s，3H，CH₃)，3.01(br，1H，CH₂)，3.46(t，J＝12.5Hz，2H，CH₂)，4.07(s，3H，CH₃)，4.14-4.31(m，2H，CH₂)，4.83-4.92(m，1H，CH)，6.61(s，1H，CH)，7.45-7.49(m，1H，CH)，7.54-7.58(m，1H，CH)，7.65-7.69(m，1H，CH)，7.86-7.94(m，2H，CH)，8.09-8.17(m，2H，CH)8.65(d，J＝2.0Hz，2H，CH)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)，δ28.4，32.4，38.5，50.6，52.4，109.2，119.5，121.4，124.7，126.4，127.4，128.4，131.7，131.9，132.3，138.1，142.0，148.4，158.9，165.6；高分辨質(zhì)譜C₂₅H₂₄N₈O₅[M+H]⁺計(jì)算值：517.1942；實(shí)測(cè)值：517.1971。

實(shí)施例2

分別對(duì)實(shí)施例1中合成的各配體進(jìn)行熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)：

1、熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：

SMO蛋白純化：

在HEK293F細(xì)胞(Life，貨號(hào)K1663)中對(duì)SMO蛋白進(jìn)行表達(dá)。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到1.0-1.3x10⁶cells/mL后收集，破碎得到細(xì)胞膜，并懸浮于含有10mM4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(西格瑪奧德里奇，貨號(hào)H3375)，10mM氯化鎂(西格瑪奧德里奇，M4880)，20mM氯化鉀(西格瑪奧德里奇，P9541)pH 7.5的緩沖液中。在上述緩沖液中加入濃度1M的氯化鈉得到高鹽緩沖液，加入濃度200mM的氯化鈉得到低鹽緩沖液。細(xì)胞膜用高鹽緩沖液洗滌(50mL*3次)并離心，再用低鹽緩沖液洗滌(50mL*3次)并離心。加入100mL含有去垢劑(n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷，Anatrace，貨號(hào)D310)的緩沖液，于4℃下混勻3小時(shí)，離心得到上清液，加入700mg TALON IMAC樹脂(Clontech，貨號(hào)635670)，于4℃下混勻12小時(shí)。含有樹脂的溶液過濾除去水相，依次用洗滌液1(50mM 4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)pH 7.5；800mM氯化鈉(西格瑪奧德里奇，S3014)；10％甘油(西格瑪奧德里奇，G5516)，0.5％n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷20mM咪唑(西格瑪奧德里奇，貨號(hào)I5513)，10mM氯化鎂)、洗滌液2(25mM 4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)pH 7.5；500mM氯化鈉；10％甘油，0.03％n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷，40mM Imidazole)各洗滌3次。用提取液(25mM 4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)pH 7.5；300mM氯化鈉；10％甘油，n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷，220mM咪唑)沖洗樹脂得到SMO蛋白的緩沖溶液。

將所得的SMO蛋白(0.2μM)、配體化合物(20μM)與下所示的熒光染料(Biotium，貨號(hào)91010)混合于含有(濃度為0.03％)去垢劑(n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷，Anatrace，貨號(hào)D310)的緩沖溶液(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)，西格瑪奧德里奇，貨號(hào)H3375，使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4)中。樣品于4℃放置30分鐘后，使用Rotor-Gene采集樣品的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)460nm)隨溫度的變化并繪制曲線，得到該樣品的Tm值用于評(píng)估配體對(duì)蛋白熱穩(wěn)定性的影響。

細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)：使用NIH 3T3細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定配體化合物作為SMO受體拮抗劑的活性。信號(hào)使用100nM SAG(Sellect，貨號(hào)S7779)激活。具體步驟如下：轉(zhuǎn)基因有熒光素酶報(bào)告基因NIH3T3的細(xì)胞(Clontech，貨號(hào)631197)在96孔板中培養(yǎng)至6*10⁵個(gè)細(xì)胞/孔，然后加入濃度為10000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0.128nM、0.0256nM、0.00512nM的梯度濃度的配體化合物在37℃共孵育1小時(shí)，加入終濃度為100nM的激活劑SAG，繼續(xù)在37℃共孵育24小時(shí)。加入熒光素報(bào)告系統(tǒng)(Promega，貨號(hào)，貨號(hào)E2920)并使用Envision酶標(biāo)儀(PerkinElmer)對(duì)Gli熒光素酶報(bào)告水平進(jìn)行測(cè)定。平行測(cè)定三組數(shù)據(jù)，根據(jù)下述公式擬合曲線并得到化合物的IC50值。

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))

其中，X代表化合物濃度，Y代表酶標(biāo)儀測(cè)定的熒光讀數(shù)，Top表示曲線的上平臺(tái)值，Bottom代表曲線的下平臺(tái)值。HillSlope代表曲線最大斜率的絕對(duì)值。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表：

上表中的大部分化合物在熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中的Tm值高于不加入配體化合物時(shí)的測(cè)定值(56.0℃)，說明這些化合物能夠通過與SMO蛋白結(jié)合增加其熱穩(wěn)定性。活性實(shí)驗(yàn)中大部分化合物的IC50值在10000nM以下，說明這些化合物是有效的SMO受體抑制劑。

對(duì)于實(shí)施例1中合成的TC114，如圖1B所示，在原有配體的基礎(chǔ)上更進(jìn)一步成為超穩(wěn)定配體(super stabilizing ligand)，如圖1C所示，TC114應(yīng)用于多區(qū)域平滑受體的結(jié)晶學(xué)結(jié)構(gòu)研究，獲得了2.7埃的高分辨率。同時(shí)，如圖1D所示，基于熒光素酶報(bào)告基因的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了TC114大大優(yōu)于原先LY2940680的抑制劑活性。