與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標記R207及其應用的制作方法

本發(fā)明涉及分子生物學及遺傳育種領域，具體地說，涉及一種與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標記R207及其應用。

背景技術：

小麥是我國僅次于水稻的第二大糧食作物，歷年種植面積分別占耕地面積的22％～30％，糧食作物總面積的22％～27％，主要分布在河南、河北、山東、山西、陜西、江蘇、四川、安徽等省份；總產量為1億噸以上，約占糧食作物產量的22％，是我國約一半人口的主食，因此高產小麥品種的選育一直是育種家關注的重點。

小麥糧食產量主要由三大要素構成，產量＝穗數(shù)*穗粒數(shù)*粒重。分蘗是禾本科作物中最重要的組成成分之一，它影響著分蘗的發(fā)生和形成，從而最終影響糧食的產量(Kebrom et al.Grasses provide new insights into regulation of shoot branching.Trends Plant Sci.2013,18:41-48；Hussien et al.Genetics of tillering in rice and barley.Plant Genome.2014,7:1-20)。，同時又是單子葉植物的一種特殊的分枝現(xiàn)象，具有重要的研究意義。

小麥分蘗遺傳研究總體進展相對緩慢，現(xiàn)階段國內外工作主要圍繞分蘗基因QTL的分子標記定位及其遺傳效應開展。部分分蘗突變體由單基因控制，因而一些學者將其作為質量性狀來研究(Richards RA.A tiller inhibition gene in wheat and its affect on plant growth.Austr J Agric Res.1988,39:749-757；Duggan BL,Richards RA,Tsuyuzaki H.Environmental effects on the expression of the tiller inhibition(tin)gene in wheat.Funct Plant Biol,2002,29:45–53)。同時，也有很多學者將分蘗作為多基因控制的數(shù)量性狀來研究(Shaha MM,Gilla KS,Baenziger PS,Yen Y,Kaepplerc SM,Ariyarathne HM.Molecular mapping of loci for agronomic traits on chromosome 3A of bread wheat.Crop Sci.1999,39:1728-1732；謝玥，龍海，侯永翠，鄭有良.小麥寡分蘗材料H461分蘗性狀的遺傳分析.麥類作物學報.2006,26:21-23；王巖.小麥永久F2群體構建及株高和分蘗特性的QTL定位.山東農業(yè)大學碩士學位論文,2009；溫明星.望水白多分蘗、矮稈突變體的鑒定及相關QTL定位.南京農業(yè)大學碩士學位論文,2010；Jinpeng Zhang,Jun Wu,Weihua Liu,Xiang Lu,Xinming Yang,Ainong Gao,Xiuquan Li,Yuqing Lu,Lihui Li.Genetic mapping of a fertile tiller inhibition gene,ftin,in wheat.Mol Breeding.2013,31:441-449)。迄今為止，已報道的分蘗相關主效基因QTL位于1A，2A，3A，6A染色體，微效基因位于5A，3B，7B，1D、5D染色體，其中僅1A和3A上的tin基因研究較深入，完成了精細定位工作。

小麥材料H461相對于小麥品種川農16(國審品種)具有寡分蘗、多穗粒數(shù)、多小穗數(shù)、高千粒重和高穗粒重等特性(侯永翠，鄭有良，蒲至恩，魏育明，李偉.穗數(shù)型小麥新品種川農16與大穗型寡分蘗品系H461遺傳差異研究初報.四川農業(yè)大學學報.2003,21:94-9)，已定位到一個顯著降低分蘗數(shù)量且穩(wěn)定遺傳的基因位于2D染色體長臂上(Wang,Zhiqiang,et al."Identification and validation of novel low-tiller number QTL in common wheat."Theoretical and Applied Genetics 129.3(2016):603-612.)。利用雜合自交家族法，結合表型和基因型成功創(chuàng)制Ltn3近等基因系B95-1/B95-2，近等基因系雜交構建次級F2群體，開發(fā)目標區(qū)間內的多態(tài)性分子標記，進一步縮小基因區(qū)間，尋找共分離的分子標記，促進分蘗基因的圖位克隆，同時為小麥特異分蘗材料的創(chuàng)制及株型育種提供新基因資源，進一步利用分子標記輔助選擇，將增強分蘗預測的準確性，提高株型育種效率，加速實現(xiàn)增加小麥單產的目標。

分子標記輔助選擇，不依賴于表現(xiàn)型選擇，即不受環(huán)境條件、基因間互作、基因型與環(huán)境互作等多種因素的影響，而是直接對基因型進行選擇，因而能大大提高育種效率。競爭性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)，可在廣泛的基因組DNA樣品中，對SNP和特定位點上的Indel進行精準的雙等位基因檢測。這種檢測方法具有操作簡便、特異性好、高通量、快速、檢測成本低、結果準確等優(yōu)勢，并且實現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍的關注。因此，篩選出與分蘗基因共分離的，且適用于熒光定量PCR平臺KASP技術的分子標記，不僅能對小麥分蘗基因進行選擇，有效調控小麥分蘗發(fā)生，塑造合理的分蘗發(fā)生群體，同時提高了選擇通量、速度和準確性，解決了大規(guī)模推廣應用的技術瓶頸，對規(guī)?；牧夹←溣N群體質量和產量具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標記R207及其應用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標記R207，標記R207位于小麥2D染色體長臂上，核苷酸序列如下：5’-GGCATCTACATTCGCGTTCNTGCCTGCAGCGGTCAGTCTGATCACCAG-3’；其中，N為C或T。

本發(fā)明還提供所述分子標記R207在小麥育種中的應用。

本發(fā)明還提供所述分子標記在鑒定寡分蘗小麥品種中的應用。包括以下步驟：

1)提取待測小麥的基因組DNA；

2)以待測小麥的基因組DNA為模板，基于KASP檢測平臺技術設計引物，進行熒光定量PCR擴增；

3)采用熒光檢測儀分析PCR產物，進行基因分型。

其中，步驟2)的引物序列如下：

R207-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATCTACATTCGCGTTCC-3’；

R207-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCATCTACATTCGCGTTCT-3’；

R207-3:5’-CTGGTGATCAGACTGACCGC-3’；

并且，引物R207-1和R207-2的5’端分別連有不同的熒光探針；

所述熒光探針的序列如下：

F探針：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可結合FAM熒光基團)

H探針：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可結合HEX熒光基團)

熒光定量PCR擴增反應體系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去離子水加至總量為10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物R207-1、R207-2和R207-3，體積比為2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，將濃度為100μM的引物R207-1、R207-2和R207-3按2:2:5體積比混合。

熒光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃變性20s，65℃退火延伸60s，循環(huán)10次，每次退火延伸溫度降低1℃；94℃變性20s，57℃退火延伸60s，循環(huán)30次；37℃60s，采集熒光信號。

步驟3)分析PCR產物的具體方法如下：

含有小麥寡分蘗基因Ltn3的小麥品種均出現(xiàn)與小麥H461相同的熒光信號，而不含有小麥寡分蘗基因Ltn3的小麥品種均出現(xiàn)與小麥H461明顯不同的熒光信號。

本發(fā)明還提供一套基于KASP技術檢測所述分子標記R207的引物組合，所述引物組合包括：

R207-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATCTACATTCGCGTTCC-3’；

R207-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCATCTACATTCGCGTTCT-3’；

R207-3:5’-CTGGTGATCAGACTGACCGC-3’；

并且，引物R207-1和R207-2的5’端分別連有不同的熒光探針；

所述熒光探針的序列如下：

F探針：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可結合FAM熒光基團)

H探針：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可結合HEX熒光基團)

本發(fā)明還提供所述引物組合在小麥分子標記輔助育種中的應用。

本發(fā)明還提供一種鑒定小麥寡分蘗基因Ltn3的分子標記的方法，以待測植株樣品的基因組DNA作為模板，用熒光定量PCR引物進行熒光定量PCR擴增，利用擴增結果進行基因型分型，將與近等基因系-寡分蘗植株分為同一類型的植株鑒定為含有小麥寡分蘗基因Ltn3的植株。

本發(fā)明還提供所述分子標記R207在制備轉基因植物中的應用，其中，所述基因為寡分蘗基因Ltn3。

本發(fā)明還提供上述方法在小麥品種改良中的應用。

本發(fā)明首次公開了基于競爭性等位基因特異性PCR(KASP)平臺精確檢測小麥H461寡分蘗基因Ltn3的分子標記R207，其為共顯性標記，檢測準確高效，通量高，擴增方便穩(wěn)定。

本發(fā)明提供的分子標記R207與寡分蘗基因Ltn3共分離，可用于分子標記輔助選擇，檢測結果表明，該分子標記能準確跟蹤所述小麥寡分蘗基因，預測小麥的分蘗特性，進而方便進行分子設計育種。利用本發(fā)明提供的分子標記及檢測方法能夠加強分蘗預測的準確性，提高特異株型育種的成功率，加速實現(xiàn)增加小麥單產的目標。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中小麥寡分蘗基因Ltn3在2D染色體上的位置及與分子標記R207之間的連鎖遺傳圖譜。

圖2為本發(fā)明實施例1中B95-1×B95-2的部分次級F2群體植株用KASP引物做基因型分型的結果。

圖3為本發(fā)明實施例1中次級F2群體的重組子鑒定及基因Ltn3定位情況。

圖4為本發(fā)明實施例2中利用基于KASP設計的引物，對B95-1、B95-2、F1、H461、川農16及川麥107做基因型分型的檢測結果。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1小麥寡分蘗基因Ltn3及分子標記R207的獲得

本發(fā)明與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標記R207是通過以下方法獲得的：

(1)利用近等基因系寡分蘗小麥B95-1作為父本本，以近等基因系多分蘗小麥B95-2為母本本雜交，得到雜種F1，F(xiàn)1代單株自交獲得F2，獲得含有986個單株的次級F2群體。

(2)用CTAB法提取所述的親本，F(xiàn)1植株和次級F2群體的各單株的DNA，從數(shù)據(jù)庫http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index下載獲得目標區(qū)間內scaffold序列信息，設計測序引物對親本B95-1和B95-2進行DNA擴增測序，通過DNAMAN 6.0對測序結果進行比對，尋找差異位點，對差異位點進行KASP分子標記開發(fā)。獲得親本B95-1的帶型記為A，親本B95-2的帶型記為B，F(xiàn)1植株的帶型記為H。

(3)小麥成熟期田間鑒定所述次級F2群體植株的分蘗數(shù)。

(4)利用JoinMap4.0作圖軟件將獲得的所述次級F2群體基因型資料構建小麥分子連鎖圖譜，尋找最優(yōu)的標記數(shù)和標記順序。

(5)設計熒光定量PCR引物，用于后續(xù)篩選。利用DNAMAN 6.0軟件設計熒光定量PCR引物7對(表1)。熒光定量PCR引物設計標準：擴增引物長度18～25bp，擴增產物長度45-60bp，退火溫度57-62℃，GC含量在40％～60％之間。合成引物序列為：

正向引物1：F探針+擴增引物序列

正向引物2：H探針+擴增引物序列

反向引物：擴增引物序列

F探針：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可結合FAM熒光基團)

H探針：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可結合HEX熒光基團)

表1 7對KASP引物序列及擴增片段長度

(6)競爭性等位基因特異性PCR(KASP)分析

a)親本之間多態(tài)性分子標記的篩選：選取上述設計的7對引物，以親本B95-1和B95-2的DNA為模板，進行PCR擴增，共獲得1對效果良好的分子標記引物，命名為R207-1/2/3(核苷酸序列分別如SEQ ID NO:2-4所示)。擴增產物為具有多肽性的分子標記R207，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

b)次級F2群體的KASP分析：用上述步驟獲得的具有多態(tài)性的分子標記R207的PCR引物，擴增親本B95-1、B95-2和次級F2群體植株的DNA，進行基因型鑒定，獲得分子標記數(shù)據(jù)。親本B95-1的類型記為A，擴增片段大小長47bp，單堿基差異位點為C。親本B95-2的類型記為B，擴增片段長47bp，單堿基差異位點為T。次級F2群體株系類型來源于B95-1的記為A，來源于B95-2的記為B，雜合記為H。

c)遺傳連鎖圖譜的構建：根據(jù)分子標記R207的鑒定數(shù)據(jù)，結合已開發(fā)的其他分子標記的基因分型數(shù)據(jù)，用作圖軟件JoinMap 4.0構建遺傳高密度圖譜。并結合次級F2群體分蘗表型數(shù)據(jù)定位寡分蘗基因Ltn3與R207共分離。

小麥寡分蘗基因Ltn3在2D染色體上的位置及與分子標記R207之間的連鎖遺傳圖譜見圖1。

B95-1×B95-2的部分次級F2群體植株用KASP引物做基因型分型的結果見圖2。

次級F2群體的重組子鑒定及基因Ltn3定位情況見圖3。

實施例2與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標記R207的應用

基于KASP檢測平臺技術設計引物，對B95-1、B95-2、F1、H461、川農16及川麥107做基因型分型檢測。

1、提取待測小麥三葉期的葉片基因組DNA；

2、以待測小麥的基因組DNA為模板，基于KASP檢測平臺技術設計引物，進行熒光定量PCR擴增；

3、采用熒光檢測儀分析PCR產物，進行基因分型。

其中，步驟2的引物序列如下：

R207-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATCTACATTCGCGTTCC-3’；

R207-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCATCTACATTCGCGTTCT-3’；

R207-3:5’-CTGGTGATCAGACTGACCGC-3’；

并且，引物R207-1和R207-2的5’端分別連有不同的熒光探針；

所述熒光探針的序列如下：

F探針：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可結合FAM熒光基團)

H探針：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可結合HEX熒光基團)

熒光定量PCR擴增反應體系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去離子水加至總量為10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物R207-1、R207-2和R207-3，體積比為2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，將濃度為100μM的引物R207-1、R207-2和R207-3按2:2:5體積比混合。

熒光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃變性20s，65℃退火延伸60s，循環(huán)10次，每次退火延伸溫度降低1℃；94℃變性20s，57℃退火延伸60s，循環(huán)30次；37℃60s，采集熒光信號。

分析PCR產物的具體方法如下：

含有小麥寡分蘗基因Ltn3的小麥品種均出現(xiàn)與小麥H461相同的熒光信號，而不含有小麥寡分蘗基因Ltn3的小麥品種均出現(xiàn)與小麥H461明顯不同的熒光信號。基因型分型結果見圖4。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110> 四川農業(yè)大學

<120> 與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標記R207及其應用

<130> KHP161119103.5Q

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 小麥

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n為c或t

<400> 1

ggcatctaca ttcgcgttcn tgcctgcagc ggtcagtctg atcaccag 48

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tggcatctac attcgcgttc c 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat tggcatctac attcgcgttc t 41

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctggtgatca gactgaccgc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat t 21