玉米低鎂條件下特異性轉運鎂離子基因ZmMGT10及其應用的制作方法

本發(fā)明涉及植物基因工程領域，具體涉及玉米低鎂條件下特異性轉運鎂離子基因ZmMGT10及其應用。

背景技術：

在擬南芥中MGT家族功能差異顯著，擬南芥中MGT1定位于質膜，MGT2定位于液泡膜，MGT10定位于葉綠體，均為高親和性；MGT3定位于液泡膜，MGT7定位于內質網，均為低親和性；而MGT5定位于線粒體，為雙親和性，MGT7在根中表達，目前還未見報道來自玉米的MGT10基因。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供玉米低鎂條件下特異性轉運鎂離子基因ZmMGT10。

本發(fā)明的再一目的是提供玉米低鎂條件下特異性轉運鎂離子基因ZmMGT10的應用。

根據本發(fā)明的玉米低鎂條件下特異性轉運鎂離子基因ZmMGT10，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO：1

TATGGGGAGGTTATCGGGAAGCGGGTCCAGGAAGCCGCCTCCCTTCCTCTCGCCCTCCTCATCATTCTCCTCCTCGTCGTACTCCAAGCGCTCCCGCACTGTTCGGCGCCTCCCGTCGCTGCCCAGGCCGCCTCTCGCGCCGCCGGCGCCGCACCCCGCTGGGAGGACGAGGAGGAGGAAGGCACCCACCCGGCTGTGGATGAGGATGGATCGGTGGGGCAGGTGCGAGGTGTTCATGACTAACGGGGCCTTCGTCGCGGAACGCTCCGGGGTGCACGCGCGCGACCTGCGCATCGTTGGGCCCCTTCTCTCTCGCTGCCCCGGCATCCTCGCTCGAGAGAAGGCCATGGTAATCAATCTAGAGTTCATAAGAGCTATTGTAACTGCGGACGAAGTCCTGCTGCTGGAACCTCTTGCTCAGGAGGTTATCCCTTTCATCGATAAATTGAGGCGGCATTTTCCATTGAAGAGCCTGGAGGTTGATGTTGGGGCCACACAAGTGGGTAATGTGAATGGCAAGCATGCTAAAACTGGTGCAGAGTGTGAGCTCCCCCTCCCCTTTGAGTTTCAGGTGTTGGAGCTCGCCCTAGAAGCTGTATGCTTGTCATTTCATTCAAGCCTATCTGATCTGAATAGGCACACCATCTTTGTGATGGATGAGTTGACTAAGAATGTGAGCACCAGGAATCTTGAACGTGTTCGAAGTCTGAAAAGAAATCTAACCTCCCTGCTCGCTGGTGTGCAAAAGGTCAGAGATGAAGTAGAGCATCTTTTGGATCATAATGAGAATATGGCACAACTGCACCTATCCAGGAAGCAAATAAAATGTCCGCAGGATGAAATTCTACTGGCTTCTGCTGCTTTAAATAGCAATCTTCCTTCAAAAACAAAGCTGGGTACACCAAATTCTGTTGTTAACCAAGCCATGGGCATTGCTATGACTGCGCCACTGGCCGACAATGTAGGAGACCTAGAGATATTACTTGAATCTTATTTCATGCAGCTGGATGGAATTCGCAACAGAATTATGATGGTCCGAGGATATATTGTTGACACAGAAGACTACATCAACATACAACTTGACAACCAACGCAATGAACTCATTCAGTTCCATCTTGTACTGATCATTGTATCATTTGGCATAGCTATGAACACATTGATAGCTGGAGCGTTTGCCATGAACATGCCTCACAATGGGGAGATGAAGAAGTTTGTAGGCCCGTTTTGGCCATTTGTTGGGGCCACATCATCTTTCTGCTTGTTGGTCAGCGTTGTTTTACTGGGATATGCAAGGGGGAACAGGCTACTTGGCAGTTGA

本發(fā)明提供了ZmMGT10在低鎂濃度下介導植物根對Mg²⁺的吸收來增強植物對低鎂脅迫的抗性。

根據本發(fā)明的具體實施方式，提供了包含上述玉米低鎂條件下特異性轉運鎂離子基因ZmMGT10的重組表達載體。

根據本發(fā)明的具體實施方式，提供了包含上述玉米低鎂條件下特異性轉運鎂離子基因ZmMGT10的重組細胞系。

根據本發(fā)明的具體實施方式，提供了上述玉米低鎂條件下特異性轉運鎂離子基因ZmMGT10的應用，尤其用于增強植物抵抗低鎂脅迫的應用。

根據本發(fā)明的玉米低鎂條件下特異性轉運鎂離子基因ZmMGT10，在低鎂濃度下特異性表達，而低鎂影響了植物的正常生長，因此ZmMGT10基因具有增強植物抵抗低鎂脅迫的能力。

附圖說明

圖1顯示ZmMGT10基因的表達模式，其中，ZmMGT10在鎂供應(+Mg)和鎂缺乏(-Mg)在根莖葉中的表達模式；B.ZmMGT10表達對外界鎂缺乏的響應。

圖2顯示顯示了ZmMGT10功能互補MM281細菌突變株的生長狀況。

圖3顯示野生型材料和轉基因材料低鎂脅迫表型，其中，A.野生型材料和轉基因材料在正常和低鎂條件下的生長表型；B.野生型材料和轉基因材料在正常和低鎂條件下的主根長度；C.野生型材料和轉基因材料在正常和低鎂條件下的生物量；D.野生型材料和轉基因材料在正常和低鎂條件下的葉綠素濃度。

圖4顯示不同外源Mg²⁺處理下野生型材料和轉基因材料在根和梢中的Mg²⁺含量，其中，A.根中Mg²⁺含量B.梢中Mg²⁺含量。

圖5顯示野生型和轉基因植株的Mg²⁺吸收，其中，A.時間依賴的野生型和轉基因植株的Mg²⁺吸收；B.濃度依賴的野生型和轉因植株的Mg²⁺吸收。

具體實施方式

實施例1

1、玉米ZmMGT10基因的的克隆

挑選飽滿的玉米種子消毒并清洗干凈，然后發(fā)芽并培養(yǎng)幼苗。釆用Invitrogen公司生產的Trizol試劑提取RNA，利用Takara公司的第一鏈反轉錄試劑盒(PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit)進行反轉錄合成第一鏈cDNA。以合成的第一鏈cDNA為模板，PCR擴增基因的CDS序列(引物序列：forward：5’-ATGGGGAGGTTATCGGGAAG-3’；reverse：5’-TCAACTGCCAAGTAGCCTGTTC-3’)。克隆目的基因，并測序驗證。

2、玉米ZmMGT10基因的表達模式

圖1顯示了ZmMGT10基因的表達模式，其中，“A”為ZmMGT10在鎂供應即+Mg條件下的表達模式，“B”為鎂缺乏即-Mg調節(jié)下在根莖葉中的表達模式。如圖1的A所示，ZmMGT10基因主要在根中表達，在莖和葉中不表達或超低表達，ZmMGT10基因在根中的表達受外界Mg²⁺缺乏強烈誘導。如圖1的B所示Mg²⁺缺乏上調了ZmMGT10基因的表達，且ZmMGT10的表達量在24h達到峰值，表達量幾乎是對照0h的6倍，隨后ZmMGT10的表達量開始減少。此外，當Mg²⁺缺乏處理24h小時的植株重新恢復Mg²⁺供應24h后，ZmMGT10在根中的表達量幾乎恢復到了對照0h時的水平。圖1所示結果表明，ZmMGT10是一個根特異性表達基因，且其表達響應了早期外界Mg²⁺缺乏。

3、ZmMGT10具有鎂離子轉運能力

為了確定ZmMGT10蛋白是否具有Mg²⁺轉運能力，構建了原核表達載體pTrc99A::ZmMGT10，并將其與pTrc99A空載體、pTrc99A::AtMGT1重組質粒載體分別轉入鼠傷寒沙門氏菌MM281突變菌株中在含不同濃度Mg²⁺的1×N-minimal固體培養(yǎng)基上進行功能互補分析，其中CorA、MgtA/MgtB、MgtE基因失活，不能在低于10mM Mg²⁺條件下生長。圖2顯示了ZmMGT10功能互補MM281細菌突變株的生長狀況。如圖2中的A所示，作為陰性對照的MM281和轉pTrc99A空載體的MM281菌株在低于10mM Mg²⁺的培養(yǎng)基上不能生長，而轉pTrc99A::AtMGT1作為陽性對照的MM281菌株在Mg²⁺濃度低至0.1mM培養(yǎng)基上的生長情況與其他高濃度Mg²⁺條件下的生長情況無明顯差異；轉pTrc99A::ZmMGT10菌株能在低于0.1mM Mg²⁺條件下恢復MM281菌株的生長缺陷，但其恢復能力明顯要弱于AtMGT1。為進一步驗證平板實驗結果，監(jiān)測了MM281、轉pTrc99A空載體、pTrc99A::ZmMGT10和pTrc99A::AtMGT1的MM281在含不同濃度Mg²⁺的1×N-minimal液體培養(yǎng)基中的生長情況。結果如圖2中的B所示，不同菌株在液體培養(yǎng)基中的生長情況與平板培養(yǎng)結果一致。這些結果表明，ZmMGT10是一個鎂離子轉運蛋白，具有轉運鎂離子的能力。

4、過表達ZmMGT10增強了轉基因擬南芥對鎂缺乏的容忍

篩選到轉35S:ZmMGT10基因的擬南芥陽性后，對野生型和T1代轉基因擬南芥進行了低鎂條件下的表型觀察實驗。圖3顯示了野生型材料和轉基因材料低鎂脅迫表型。將在MS培養(yǎng)基和含50mg/L卡那霉素MS培養(yǎng)基上生長兩周的野生型和轉基因擬南芥幼苗轉移到全營養(yǎng)液，培養(yǎng)3天，其中，全營養(yǎng)液含2mM MgSO₄.7H₂O，隨后兩種材料各分為兩組，分別在含2mM MgSO₄.7H₂O(+Mg)和含0.01mM MgSO₄.7H₂O(-Mg)的營養(yǎng)液中培養(yǎng)3周后觀察表型。結果如圖3中的A所示，在正常培養(yǎng)條件下野生型擬南芥植株和轉基因擬南芥植株間沒有明顯的表型差異，而在低鎂條件下，野生型植株的生長略弱于轉基因植物，且野生型植株出現了心葉變黃的典型的植物鎂素缺乏癥狀。此外，在正常生長條件下的野生型和轉基因材料的植株大小略大于低鎂條件下植株的大小，且葉子的顏色也略綠于低鎂條件植株葉子的顏色。對兩種材料的主根長度進一步測量，結果如圖3中的B所示，在低鎂生長條件下，野生型植株的主根長明顯短于轉基因植株的主根長；而在正常生長條件下，野生型植株的主根長和轉基因植株的主根長無明顯差異。此外，在正常生長條件下的兩種材料的主根長均明顯長于低鎂生長條件下兩種材料的主根長。生物量分析顯示，在低鎂生長條件下，野生型植株的鮮重明顯低于轉基因植株的鮮重；而在正常生長條件下，野生型植株的鮮重和轉基因植株的鮮重無明顯差異。如圖3中的C所示，同樣，在正常生長條件下的兩種材料的鮮重均明顯高于低鎂生長條件下兩種材料的鮮重。葉片葉綠素濃度分析顯示，在低鎂生長條件下，野生型植株葉片的葉綠素濃度明顯低于轉基因植株葉片的葉綠素濃度；而在正常生長條件下，野生型植株葉片的葉綠素濃度與轉基因植株葉片的葉綠素濃度間無明顯差異。此外，如圖3中的D所示，在正常生長條件下的兩種材料的葉片葉綠素濃度均高于低鎂生長條件下兩種材料葉片葉綠素濃度。這些結果表明，低鎂影響了植物的正常生長，ZmMGT10基因具有增強植物抵抗低鎂脅迫的能力。

5、過表達ZmMGT10增加轉基因擬南芥低鎂條件下鎂離子積累

為了進一步探索在低鎂條件下ZmMGT10轉基因擬南芥植株具有更強的生長能力是否與它具有更高的Mg²⁺含量有關，檢測了正常生長條件和低鎂生長條件下兩種材料全株、地上部分、根的Mg含量。將在MS培養(yǎng)基和含50mg/L卡那霉素MS培養(yǎng)基上生長兩周的野生型和轉基因擬南芥幼苗轉移到全營養(yǎng)液培養(yǎng)3天，全營養(yǎng)液含2mM MgSO₄.7H₂O，隨后兩種材料各分為兩組，分別在含2mM MgSO₄.7H₂O(+Mg)和含0.01mM MgSO₄.7H₂O(-Mg)的營養(yǎng)液中培養(yǎng)3周后收獲根和梢用于Mg²⁺含量檢測。圖4顯示不同外源Mg²⁺處理下野生型材料和轉基因材料在根和梢中的Mg²⁺含量。如圖4所示，在2mM Mg²⁺生長條件下，野生型和轉基因植株的根和梢中的Mg²⁺含量無明顯差異。然而，當在0.01mM生長條件下，所有植株在根和梢中的Mg²⁺含量均明顯低于正常生長條件下根和梢中的Mg²⁺含量，但轉基因植株根和梢中的Mg²⁺含量均明顯高于野生型植株。這些結果表明，在低鎂生長條件下，ZmMGT10轉基因擬南芥植株具有更強的生長能力與它比野生型植株積累更多的Mg²⁺有關，ZmMGT10介導了低鎂條件下根對外界Mg²⁺的吸收。

6、過表達ZmMGT10增加轉基因擬南芥低鎂下根對鎂離子的吸收

由于植物中的Mg²⁺主要是通過鎂離子轉運蛋白從外界吸收后轉運進植物體內的，而鎂含量測定結果表明，在低鎂生長條件下轉基因材料鎂含量明顯高于野生型材料，說明ZmMGT10在低鎂條件下介導了根對外界Mg²⁺的吸收，轉基因植株比野生型植株有更強的Mg²⁺吸收能力。測試野生型植株和轉基因株系，用于Mg²⁺攝取分析。對于時間依賴的Mg²⁺攝取分析，經Mg²⁺饑餓處理的野生型和轉基因植株在包含0.01mM和2mM MgSO₄.7H₂O營養(yǎng)液中培養(yǎng)10、30、60、120、180、240min，收獲根用于Mg²⁺含量測定。對于濃度依賴的Mg²⁺攝取分析，經Mg²⁺饑餓處理的野生型和轉基因植株在包含0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3mM MgSO₄.7H₂O營養(yǎng)液中培養(yǎng)2h，收獲根用于Mg²⁺含量測定。圖5顯示了野生型和轉基因植株的Mg²⁺吸收。時間依賴的Mg²⁺攝取分析結果如圖5所示，在2mM Mg²⁺生長條件下，野生型植株和轉基因植株具有相似的Mg²⁺積累模式，而在0.01mM Mg²⁺條件下，野生型和轉基因植株Mg²⁺積累量均明顯低于2mM條件下植株的Mg²⁺積累量，但轉基因植株的Mg²⁺積累量明顯高于野生型植株，表明過表達ZmMGT10增強了低鎂條件下擬南芥根對Mg²⁺的吸收。濃度依賴的Mg²⁺攝取分析結果如圖5所示，在低鎂濃度條件下，轉基因植株的Mg²⁺攝取率明顯高于野生型植株，但在高鎂濃度條件下，兩種材料的Mg²⁺攝取率無明顯差異，表明ZmMGT10是在低鎂濃度下介導植物根對Mg²⁺的吸收。所有這些結果表明，ZmMGT10通過在低鎂濃度下介導植物根對Mg²⁺的吸收來增強植物對低鎂脅迫的抗性。

<110> 四川農業(yè)大學

<120> 玉米低鎂條件下特異性轉運鎂離子基因ZmMGT10及其應用

<160> 1

<210> 1

<211> 1318

<212> DNA

<213> 鏈霉菌

<400> 1

tatggggagg ttatcgggaa gcgggtccag gaagccgcct cccttcctct cgccctcctc 60

atcattctcc tcctcgtcgt actccaagcg ctcccgcact gttcggcgcc tcccgtcgct 120

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