基于開環(huán)反應構(gòu)建具有抗菌性能的超支化基因載體的方法與流程

本發(fā)明屬于陽離子基因載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及開環(huán)法構(gòu)建一系列以氨基糖苷類抗生素為基體，其中包括慶大霉素硫酸鹽、妥布霉素、硫酸新霉素抗生素等，具有高效基因轉(zhuǎn)染效率的氨基糖苷類抗生素陽離子基因載體。

背景技術(shù)：

二十年來，基因治療作為一種極具潛能的治療方法引起了科研學者廣泛的關(guān)注，基因治療既將遺傳物質(zhì)直接導入到患者的靶向細胞中，是一種很有前景的治療方法。被廣泛的用于治療一系列遺傳性疾病、人類癌癥和心血管疾病等等。然而，直接注射DNA，RNA等遺傳物質(zhì)，遺傳物質(zhì)很容易被血液中的核酸酶降解，失去治療的效果，所以構(gòu)建安全高效的基因載體保護基因不被核酸酶降解具有重要意義。

基因治療中的重中之重是尋找到合適的基因載體?；蜉d體作為將外源基因?qū)氲郊毎墓ぞ撸淖饔糜袃蓚€：一是負載目的基因到宿主細胞，二是將目的基因在細胞內(nèi)安全地釋放出來，然后細胞內(nèi)表達產(chǎn)生治療蛋白。因而構(gòu)建結(jié)構(gòu)簡單、容易大規(guī)模制備，無免疫排異反應，高基因轉(zhuǎn)染效率的非病毒基因載體亟待科研人員進一步的研究。目前人們廣泛使用的基因載體包括兩類：病毒載體(viral vector)和非病毒載體(non-viral vector)。攜帶治療基因的病毒可以感染正常/腫瘤細胞，從而將治療基因?qū)爰毎?，是一種高效率的基因傳遞系統(tǒng)。病毒基因載體的基因轉(zhuǎn)染效率高，但是其細胞毒性大，會引起機體免疫反應，病毒基因載體的研究具有很大的爭議。由于病毒載體存在以上諸多缺點，人們將更多的目光投向了非病毒載體。非病毒基因載體具有很多優(yōu)點：1.具備靈活多樣的功能；2，簡單可控地合成過程；3，穩(wěn)定且成熟的基因轉(zhuǎn)染效率。具有很高的商業(yè)潛力。其發(fā)展?jié)摿Ψ遣《据d體的研究與開發(fā)起到了推動作用。目前而言陽離子聚合物是人們使用頻率最高的非病毒載體。這種陽離子非病毒性載體可以有效的通過電荷的相互作用絡(luò)合上基因，從而形成帶正電荷納米級的復合體(complex)，從而能夠保護基因穿過細胞膜以防止被核酸酶所降解，從而保證基因的順利表達。

隨著高分子科學的不斷進步，如何將其與現(xiàn)代醫(yī)學、生物學以及工程學等學科更好的相互交融與滲透成為人們現(xiàn)在重點解決的難題。而在基因治療方面，高分子材料已經(jīng)體現(xiàn)出了很高的利用價值。目前，文獻報道過一系列的非病毒陽離子基因載體近三十年來，隨著科研人員對陽離子基因載體研究的不斷深入，他們意識到僅僅構(gòu)建高效、低毒的載體已經(jīng)無法滿足日益多元化的臨床要求，將MRI/CT可視化、抗菌、熒光成像、光熱治療、光動力學等各種不同功能的材料組裝在一起開發(fā)具有多功能的基因載體具有重要的臨床意義。

在基因治療周期內(nèi)，多次注射載體/基因復合物造成創(chuàng)傷引起的細菌感染，影響治療效果，因此，構(gòu)建具有抗菌性能的多功能基因載體對于臨床試驗有重大意義。除此之外，小分子抗菌型基因載體存在不少缺點，比如基因轉(zhuǎn)染效率低，抗菌耐受性，抗菌持續(xù)時間短等。超支化聚合物憑借其抗菌性能好，細胞毒性低，合成制備簡單，不會造成細菌耐藥性等優(yōu)點引起了人們的關(guān)注。

氨基糖苷類抗生素是通過氧橋鍵連接多個氨基糖和環(huán)醇而形成的糖苷類抗生素。其抗菌機理是抑制細菌的蛋白質(zhì)合成。抗生素可作用于細菌蛋白質(zhì)合成的整個過程，通過影響16SrRNA編碼區(qū)(細菌胞內(nèi)的30S核糖體亞單位)A區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)合成的調(diào)控，蛋白質(zhì)初始復合物的形成受到抑制，作用的途徑有兩種：一是細菌蛋白質(zhì)的胞外釋放受到抑制，將細菌殺死；二是受到誘導合成結(jié)構(gòu)錯誤的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)形成的細胞膜易破裂，最終導致細菌死亡。超支化聚合物具有高度枝化的拓撲結(jié)構(gòu)，內(nèi)部空腔，可功能化的端基和簡單的合成步驟等優(yōu)點，使得超支化聚合物廣泛應用于基因載體，藥物載體，蛋白載體，醫(yī)學影像，熒光探針等生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。制備超支化聚合物，一般采用“一鍋法”，合成簡單，提純步驟少，可減小工業(yè)化生產(chǎn)的成本。目前用于基因治療的超支化聚合物大多基于天然產(chǎn)物，比如氨基糖苷類抗生素，蛋白質(zhì)等具有良好的生物相容性和生物可降解性，可以滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種開環(huán)反應構(gòu)建的以氨基糖苷類抗生素為基體的陽離子基因載體。本部分的研究內(nèi)容是以氨基糖苷類抗生素為骨架構(gòu)建具備抗菌性能的基因載體，研究載體的體外體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染，抗菌效果，以及載體負載p53抑瘤基因后在裸鼠體內(nèi)的表達，該類陽離子基因載體具有高的轉(zhuǎn)染率，本身毒性較小，幾乎不會引起免疫反應，同時對革蘭氏陽性、革蘭氏陰性菌具有一定的抑菌性能，合成基本采用“一鍋法”，合成簡單很高的商業(yè)潛能，同時具備投入臨床試驗的可能。

基于開環(huán)反應構(gòu)建具有抗菌性能的超支化基因載體的方法，其特征在于，包括以下步驟：該聚合反應體系包括氨基糖苷類抗生素、有機溶劑、交聯(lián)劑：其中交聯(lián)劑與氨基糖苷類抗生素的質(zhì)量比值在0.1-25：1范圍，優(yōu)選0.1-15:1范圍，更優(yōu)選在0.5-10:1范圍；有機溶劑與氨基糖苷類抗生素的質(zhì)量比值在0.1-200:1范圍，優(yōu)選1-150:1范圍，更優(yōu)選2-100:1范圍。

反應體系所述各組分加入順序為：先將氨基糖苷類抗生素溶于有機溶劑，然后加入交聯(lián)劑，最后加入三乙胺調(diào)節(jié)反應環(huán)境，使聚合更好發(fā)生。

聚合反應溫度0-100℃，優(yōu)選5-80℃，更優(yōu)選10-70℃；該聚合反應時間為100-2000min，優(yōu)選200-1900min，更優(yōu)選300-1700min。

反應完成后加入乙二胺或者乙醇胺，使未反應的環(huán)氧全部反應，加入的乙二胺或乙醇胺的質(zhì)量是交聯(lián)劑的質(zhì)量的1-50倍。

整個反應在無氧環(huán)境下連續(xù)進行。

所述的氨基糖苷類抗生素一般為慶大霉素硫酸鹽、妥布霉素、硫酸新霉素的一種或者幾種。在本發(fā)明的反應體系中，其中慶大霉素硫酸鹽和硫酸新霉素在使用前需要除去硫酸鹽，如采用氫氧化鈣水溶液去除硫酸鹽。

所述的交聯(lián)劑一般為羥乙基二硫雙縮水甘油醚或聚乙二醇二縮水甘油醚。

所述的有機溶劑選自砜類、亞砜類、酰胺類、醇類的一種或者幾種。

所述醇類化合物一般為甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、異丙醇、異丁醇、叔丁醇、異戊醇、正己醇中的一種或者幾種。

所說的砜類選自二甲砜、二乙砜、二丙砜、二丁砜、二苯砜、二芐基砜、甲基苯基砜、環(huán)丁砜中的一種或者幾種。

所述亞砜類選自二甲基亞砜、二乙基亞砜、二丙基亞砜、二丁基亞砜、二戊基亞砜、二己基亞砜中的一種或者幾種。

對于溶于水的一系列產(chǎn)物，一般處理是將其溶于水中，加水量與產(chǎn)物的比例為100-300mL/g，產(chǎn)物溶解后放入不同截留分子量的透析袋中以除去小分子，獲得相應分子量的抗菌抗污材料。透析過程延續(xù)3天，最后將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至除去所有水分即得到一系列基于氨基糖苷類抗生素的多功能基因載體。

反應體系應加入適量的三乙胺為反應提供一個堿性環(huán)境，聚合物單體與三乙胺的質(zhì)量比為(0.5：8)-(5:15)。

羥乙基二硫雙縮水甘油醚的制備：將2-羥乙基二硫化物、氫氧化鈉、四丁基溴化胺混合攪拌均勻，隨后加熱至40℃，滴加環(huán)氧氯丙烷，反應后向反應體系加適量水，用二氯甲烷萃取除去雜質(zhì)鹽得到粗產(chǎn)物。用硅膠柱層析得到淺黃色澄清的羥乙基二硫雙縮水甘油醚。

有益結(jié)果：本發(fā)明利用開環(huán)法法制得分子量大小為5000-10000，分子量分布在1.1-13的聚合物。本發(fā)明利用開環(huán)反應法制得分子量大小為7000-15000，分子量分布在1.2-1.5的聚合物。對于開環(huán)過程中：(1)伯氨環(huán)氧開環(huán)，或通過ED、DED或其中任意兩者的混合等開環(huán)除去未反應完全伯氨基團進行封端得到的一系列抗菌劑聚合物骨架材料均完全開環(huán)。(2)通過開環(huán)得到的其中部分多功能基因載體可降解。(3)通過開環(huán)反應得到的多功能基因載體具有一定的抗菌效果。這類基因載體在HepG2、Hela、C6、COS7、SL、H9C2細胞系中都有較好的轉(zhuǎn)染效率，同時該多功能基因載體可采用“一鍋法”，合成簡單，具有很高的商業(yè)化潛力。

附圖說明

圖1實施例3，4中不同基因載體在HEK 293和Hep G2細胞中的毒性和轉(zhuǎn)染效率測試。

圖2實施例3，4中不同的多功能基因載體對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖和OD圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。

實例1

將2-羥乙基二硫化物(0.39mL，2.87mmol)、氫氧化鈉(395.4mg，9.78mmol)，四丁基溴化胺(7.1mg，0.02mmol)依次加入到50mL三口燒瓶中，攪拌均勻，隨后加熱至40℃。用滴液漏斗將環(huán)氧氯丙烷(0.83mL，10.59mmol)緩慢滴加到上述體系，3h內(nèi)滴完。反應3h后向反應體系加適量水，用二氯甲烷萃取除去雜質(zhì)鹽得到粗產(chǎn)物。用硅膠柱層析(乙酸乙酯：正己烷＝4:1)得到淺黃色澄清的羥乙基二硫雙縮水甘油醚。

實例2

硫酸慶大霉素(547mg，1mmol)，硫酸新霉素(908mg，1mmol)加入到100mL的氫氧化鈣水溶液中，攪拌24h后過濾除去沉淀，沉淀用少量水洗滌。冷凍干燥得到除去硫酸鹽的慶大霉素、新霉素。

實例3

將慶大霉素(449mg，1mmol)或妥布霉素(369mg，1mmol)或新霉素(810mg，1mmol)分別加入到5mL二甲基亞砜，40℃下攪拌至溶解。再將聚乙二醇二縮水甘油醚加入到上述溶液，其中環(huán)氧基的摩爾數(shù)等于氨基的摩爾數(shù)。氮氣鼓泡排氣10min后，加入10mmol的三乙胺，封口膜封口。反應體系在40℃下，氮氣環(huán)境中反應24h。然后將過量的乙二胺加入到上述反應溶液中，60℃下反應1小時，除去未反應的環(huán)氧基團，同時提高聚合物水溶性。停止反應后，將反應溶液用醋酸中和后加水置于截留分子量為1000的透析膜中透析72h。冷凍干燥分別得到絮狀的超支化聚合物HPG，HPT，HPN。

聚合物HPG，HPT，HPN的數(shù)均分子量(Mn)分別為8300，8400，8600，分子量分布指數(shù)(Mw/Mn)分別為1.13，1.12，1.20。

實例4

合成方法如同實3，將交聯(lián)劑乙二醇二縮水甘油醚換成合成的羥乙基二硫雙縮水甘油醚，可分別得到帶雙硫鍵的超支化聚合物SS-HPG，SS-HPT，SS-HPN。

聚合物SS-HPG，SS-HPT，SS-HPN的數(shù)均分子量(Mn)分別為8800，8900，9300，分子量分布指數(shù)(Mw/Mn)分別為1.18，1.17，1.25。