一種酸性磷酸酯酶基因AP5的克隆表達(dá)及應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及一種酸性磷酸酯酶基因(AP5)的克隆表達(dá)，并公開了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列、其酶學(xué)性質(zhì)及在水解磷礦石中的應(yīng)用，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：酸性磷酸酯酶(Acidphosphatase，EC3.1.3.2，AcPase)是能夠水解磷酸單酯鍵斷裂生成Pi和相應(yīng)脂肪酸的一類酶。酸性磷酸酯酶通過催化磷蛋白的水解參與生物磷代謝及其調(diào)節(jié)，在細(xì)胞中是能量轉(zhuǎn)換和信號傳導(dǎo)等生命活動的重要酶類。1991年，Williamson等發(fā)現(xiàn)抗線蟲類番茄的第一個AcPase基因；LiuJ等發(fā)現(xiàn)了由cDNA編碼運輸AcPase的基因；MillerS等報道了編碼的分泌AcPase基因；T.shinano等也發(fā)現(xiàn)了洋蔥鱗片細(xì)胞中由AcPase編碼的PEP磷酸酯酶基因，ZhangC等提純出三葉草根細(xì)胞壁中的四種AcPase同工酶。近些年國內(nèi)外己對一些動植物酸性磷酸醋酶也進(jìn)行了研究，如對蝦，草魚文昌魚，刺參，背角無齒蚌，小麥等；微生物中的研究主要是在大腸桿菌和酵母上；在動物組織細(xì)胞主要集中在珍珠貝，淡水鍋牛，小鼠，公豬的生殖腺，人類前列腺、肝臟、血漿等。AcPase普遍存在于植物中，如根和根的節(jié)結(jié)，塊莖，鱗莖，種子，胚芽鞘，葉子，幼芽和子葉等都有存在，該酶在植物體內(nèi)可以分解有機(jī)磷化合物，促進(jìn)磷的再吸收和利用，體外可以對土壤中有機(jī)磷進(jìn)行分解以供根系吸收。TurnerWL等在香蕉果實中測得的最適pH為5.8，GranjeiroPA等研究蓖麻子AcPase的最適pH是5.5，MiernykJA以玉米胚乳為試材，測得AcPase最適為5.5，最適溫度為50°；GellatlyKS等測定馬鈴薯塊莖的AcPase最適pH是5.8，張劍銘等通過氟化鈉對大豆AcPase進(jìn)行研究，得到的AcPase最適pH為5.6，最適溫度為37℃。費美娟等對小麥葉片AcPase的生化性質(zhì)研究得到其最適pH是6.8，最適作用溫度為45°；董登峰等研究大豆葉片的得到其最適pH4.8，溫度在60°以下都保持有較高酶活。酸性磷酸酯酶通過水解底物生成磷酸鹽，這對大多植物來說是非常必要的，因為磷是植物生長所必須的元素，是植物花芽分化及形態(tài)形成時結(jié)構(gòu)物質(zhì)的必要構(gòu)成，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上采用在花芽分化前增施磷肥可促進(jìn)成花，然而磷素在早期就容易缺乏，且植物無明顯缺素癥狀，使得生產(chǎn)中會出現(xiàn)植物的營養(yǎng)生長不良等現(xiàn)象。對于磷酸鹽吸收受限，細(xì)胞就會通過磷酸酯酶將核酸、磷酸化糖、有機(jī)磷化合物及蛋白質(zhì)等水解，從而使有機(jī)體滿足磷酸鹽的需要。因此，大多植物受到磷營養(yǎng)脅迫時，磷酸酯酶活性增強，作為磷酸酯酶的競爭性抑制在體內(nèi)調(diào)節(jié)磷酸水平至關(guān)重要。磷酸酯酶可水解已代謝的磷酸酯類物質(zhì)，釋放的又可以轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)再次參與細(xì)胞代謝。本發(fā)明從貴州磷礦上生長的植物根際篩選產(chǎn)磷酸酯酶的細(xì)菌，并對其基因組序列進(jìn)行對比分析。并利用大腸桿菌工程菌異源表達(dá)酸性磷酸酯酶基因以驗證其活性，分離純化重組酸性磷酸酯酶酶并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種高活性的酸性磷酸酯酶(AP5)，并利用大腸桿菌工程菌對其進(jìn)行異源表達(dá)，公開了相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)，并對其進(jìn)行了部分應(yīng)用。1菌株本發(fā)明從貴州磷礦上生長的植物根際篩選產(chǎn)磷酸酯酶的細(xì)菌BacillusamyloliquefaciensYP6(YP6,Accession：KP326355.1)。2酸性磷酸酯酶基因(AP5)的克隆表達(dá)提取BacillusamyloliquefaciensYP6的全基因組DNA，設(shè)計酸性磷酸酯酶基因的特異性引物，擴(kuò)增出酸性磷酸酯酶全長編碼框序列，并構(gòu)建重組序列。3酸性磷酸酯酶基因的表達(dá)及純化將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)，菌體破碎后得到粗酶液經(jīng)Ni柱純化后備用。4磷酸酯酶酶學(xué)性質(zhì)以磷酸苯二鈉為底物研究pH對酸性磷酸酯酶活性的影響。以磷酸苯二鈉為底物研究溫度對酸性磷酸酯酶活性的影響。以磷酸苯二鈉為底物研究金屬離子Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Cu2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Zn2+，Ni2+，Co2+對酸性磷酸酯酶活性的影響。底物動力學(xué)參數(shù)，所用底物為磷酸苯二鈉及對硝基磷酸苯二鈉(pNPP)。1)以磷酸苯二鈉為底物酶活測定方法為：檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH＝5.0。0.02mol/L磷酸苯二鈉溶液稱取磷酸苯二鈉2.18g，加入煮沸的400mL蒸餾水中，使其溶解，冷卻后用煮過的冷蒸餾水定容至500mL，再加氯仿2mL，置冰箱保存。鐵氰化鉀溶液稱取鐵氰化鉀2.5g，硼酸17.0g，分別溶于400mL蒸餾水中，二液混合后，加蒸餾水定容至1000mL，置棕色瓶中避光保存。將100μL純化后的酶液加入1mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中40℃保溫5min,再加入已預(yù)熱的磷酸苯二鈉溶液1mL,在40℃下反應(yīng)15min，然后加入鐵氰化鉀溶液3mL，顯色并終止反應(yīng)，在分光光度計510nm下測定，重復(fù)3次。酶活定義：最適條件下，每分鐘催化磷酸苯二鈉轉(zhuǎn)化1μmol產(chǎn)物為一個酶活單位。2)以對硝基磷酸苯二鈉為底物酶活測定方法為：0.25mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH＝5.0)補足蒸餾水至0.8mL，加入0.03mL酶液，40℃預(yù)熱5min，加入0.2mL底物反應(yīng)30min，加入0.5mL1MNaOH終止反應(yīng)，在405nm處測吸光值。酶活定義：最適條件下，每分鐘催化pNPP轉(zhuǎn)化1μmolp-NP為一個酶活單位。5酸性磷酸酯酶在水解磷礦石中的應(yīng)用利用重組菌株發(fā)酵磷礦石粉，測定其解磷能力。具體實施方式下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。一般性說明：實施例所涉及的酶均購自TaKaRa公司，質(zhì)粒試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生物工程有限公司，操作完全按照相應(yīng)說明進(jìn)行。引物合成與質(zhì)粒測序由上海桑尼公司完成。實施例1本實施例為本發(fā)明所述的酸性磷酸酯酶基因的克隆及大腸桿菌工程菌的構(gòu)建1BacillusamyloliquefaciensYP6全基因組抽提將BacillusamyloliquefaciensYP6菌株接種于3mLLB培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，12000r/min離心10min得到菌體，利用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒按步驟得到全基因組備用。2大腸桿菌感受態(tài)制備從LB平板上分別挑取DH5α和BL21(DE3)單菌落,接種于3mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長中后期。將該菌懸液以1:100的比例接種于50mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2.5小時至OD600＝0.5。細(xì)菌培養(yǎng)液冰浴5分鐘后，4℃5000r/min離心5min。用預(yù)冷的去離子水洗滌沉淀，4℃5000r/min離心5min。沉淀加入2ml預(yù)冷的0.05mol/LCaCl2-15％甘油混合溶液，輕吹散，冰浴5分鐘，4℃5000r/min離心min。沉淀加入2mL預(yù)冷的0.05mol/LCaCl2-15％甘油混合溶液，輕吹散，即成為感受態(tài)細(xì)胞懸液。分裝成50μL的小份，貯存于-70℃可保存半年。3PCR擴(kuò)增酸性磷酸酯酶基因1)引物設(shè)計根據(jù)BacillusamyloliquefaciensYP6的16SrDNA，與NCBI中已知的酸性磷酸酯酶基因的對比，設(shè)計引物為：S:5’-GCCGGGATCCATGGATAAGTTGAAAGGCATC-3’；A:5’-GCCGTCTAGATCATGCCAGATCCACCC-3’2)PCR擴(kuò)增擴(kuò)增體系為：PCR反應(yīng)液組成(25μl)PremixTaq(ExTaqVersion2.0)25μlDNA模板1μlPrimerF1μlPrimerR1μl滅菌蒸餾水22μlPCR反應(yīng)條件98℃10s，55℃30s，72℃2min，30個循環(huán)，最后保存于10℃中。PCR產(chǎn)物送華大基因測序后得到該酸性磷酸酯酶基因如SEQIDNO.1所示。3)雙酶切和連接將pColdⅡ質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系為上述反應(yīng)液在37℃反應(yīng)1h后，經(jīng)過核酸膠驗證后進(jìn)行割膠回收，回收產(chǎn)物再次進(jìn)行核酸膠驗證正確后進(jìn)行pColdⅡ質(zhì)粒片段與目的基因的連接。連接體系為：反應(yīng)液在16℃過夜連接12h后，轉(zhuǎn)入感受態(tài)。4)轉(zhuǎn)化1.取DH5α感受態(tài)一管100μl，加入20μl上述連接反應(yīng)液。2.冰浴30min。3.在42℃下反應(yīng)90s，冰浴1min。4.加入LB培養(yǎng)基890ml，37℃下培養(yǎng)1h復(fù)壁。5.在12,000×g離心1min，取出900ml上清倒掉，剩余菌體和培養(yǎng)液混合均勻，涂布含Amp抗性的平板。6.挑選10個單菌落37℃倒置培養(yǎng)，進(jìn)行菌落PCR驗證并送去華大基因進(jìn)行測序。菌落PCR方法如上所述，引物采用pColdⅡ上通用引物pCold-Fprimer和pCold-Rprimer。陽性重組子提取質(zhì)粒導(dǎo)入BL21(DE3)感受態(tài)備用。實施例2本實施例為本發(fā)明所述的重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)1.將10μl重組菌株加入3mlLB培養(yǎng)基，加入3μl氨芐溶液，以空菌(原始菌BL21(DE3))和空載(轉(zhuǎn)入pColdⅡ質(zhì)粒)作對照，37℃，200rpm，培養(yǎng)12h。2.取上述種子液加入含50mlLB的三角瓶，加50μl氨芐溶液，培養(yǎng)2-2.5h，至OD600＝0.4-0.6，搖床調(diào)至15℃，靜置30min。3.每瓶加入50μl0.5mol/L的IPTG20μl，以不加IPTG誘導(dǎo)作對照15℃培養(yǎng)24h。4.將菌液收集，4℃，8000rpm離心10min，棄上清，加入5ml磷酸緩沖液(pH＝7.0)重懸菌體，超聲波破碎，破2s，停3s，30％功率，10min。5.離心取上清，4℃，8000rpm離心10min。6.測酶活及跑膠驗證。將上述得到的粗酶液采用AKTAavant150蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行鎳柱純化，洗脫方法為將A1、A2、B1、B2、四根管路都放到水里，設(shè)置systemflow20ml/min進(jìn)行排氣。然后設(shè)置systemflow1ml/min、flowpath(columnposition3)、deltapressure0.5、Gradient0、insetA1，待水滴均勻流出后裝鎳柱，平衡10min后將A1放入結(jié)合液中，B1放入洗脫液中，再排氣一次，平衡20min，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液B1梯度洗脫目的蛋白，將吸附在柱子上的蛋白洗脫下來手機(jī)有酶活的洗脫液備用。實施例3本實施例為本發(fā)明所述的酸性磷酸酯酶的最適pH及pH穩(wěn)定性。以磷酸苯二鈉為底物，在37℃的條件下，分別測定不同pH(3.0,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0)以及在各個pH下保存1h后的酶活，分別如圖1，圖2所示，可知該酸性磷酸酯酶的最適pH為5.0。實施例4本實施例為本發(fā)明所述的酸性磷酸酯酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性。以磷酸苯二鈉為底物，在pH＝5.0的條件下，分別測定不同溫度(4,20,25,30,35,40,45,50,55,60,70,80℃.)以及在各個溫度下保存1h后的酶活，分別如圖3，圖4所示?？芍撍嵝粤姿狨ッ傅淖钸m溫度為35℃。實施例5本實施例為不同金屬離子(Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Cu2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Zn2+，Ni2+，Co2+)在不同濃度下對該酸性磷酸酯酶的影響，結(jié)果如圖5所示，可知，Mn2+和Zn2+對該酶有明顯的促進(jìn)作用，Mn2+和Fe2+等有明顯的抑制作用。實施例6本實施例為以磷酸苯二鈉和pNPP為底物的動力學(xué)參數(shù)的測定在最適反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度下測定該酸性磷酸酯酶催化不同濃度的磷酸苯二鈉和pNPP的反應(yīng)速率，反應(yīng)體系中含10mMMnSO4，參照Linewear-Burk雙倒數(shù)作圖法，計算Vmax和Km值，進(jìn)而算出Kcat/Km值。如圖6所示，可知在以磷酸苯二鈉和pNPP為底物的條件下，該酸性磷酸酯酶均表現(xiàn)出很高活性。實施例7本實施例為酸性磷酸酯酶AP5水解磷礦石的應(yīng)用重組菌株制成種子液以3％的比例加入含1％磷礦石粉的LB培養(yǎng)基中，30℃，200r/min，發(fā)酵培養(yǎng)3d，取發(fā)酵液離心后上清用鉬酸銨比色法測定其水解能力為73.26ug/mL。附圖說明圖1：最適pH(摘要附圖)圖2：pH穩(wěn)定性圖3：最適溫度圖4：溫度穩(wěn)定性圖5：不同金屬離子對堿性磷酸酯酶活性的影響圖6：以磷酸苯二鈉和pNPP為底物動力學(xué)參數(shù)。SEQIDNO.1ATGGAACTAGTTCAGCAATTAATATCCGATTACGGATATATCGCGATTTTTCTCATGCTGACACTTGGTATTATCGGATTGCCTATTCCGGATGAAGTCATGATGACGCTAGTGGGCTACTTCACGCATTTAAAAGTGCTCAATTATGAGCTCTCCATTCTTATCAGCTTTATCGGAGCGCTCCTGGGGATGATCATCAGCTACTTCATCGGCAGAAAAGCCGGCCGGCCCTTTATTAATAAGTTCGGGAAATGGGTCGGCCTGAAGGAAAAGAGGATGGAGAAAGTAGACAGGTGGATGAAAAAGTACGGGCCGTACACCATTATTTTAGGTTATTTCATCCCCGGCATCAGACACGTGACCTGCTACTTTTCCGGAATCGGCAGAATGGATTTCAAAACCTACCTATGCTTCGCCGCCATCGGAGCGTTTTTATGGTGTTTTATTTTTATTACTATAGGAAGATTCATAGGAGTAATCAATGTTTAASEQIDNO.2MELVQQLISDYGYIAIFLMLTLGIIGLPIPDEVMMTLVGYFTHLKVLNYELSILISFIGALLGMIISYFIGRKAGRPFINKFGKWVGLKEKRMEKVDRWMKKYGPYTIILGYFIPGIRHVTCYFSGIGRMDFKTYLCFAAIGAFLWCFIFITIGRFIGVINV當(dāng)前第1頁1 2 3