一種Teixobactin類似物及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及TEIXOBACTIN類似物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

Teixobactin是2015年美國科學(xué)家通過iChip技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種新型抗菌化合物。該化合物殺死小鼠機(jī)體中某些細(xì)菌的速度與現(xiàn)存抗生素的速度相當(dāng)，而且無毒副作用，安全有效。最關(guān)鍵的是，Teixobactin主要通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁來消滅細(xì)菌，不會誘發(fā)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。然而，通過iChip技術(shù)分離、篩選Teixobactin需要相當(dāng)長的時間，工藝復(fù)雜，迅速開展其相關(guān)藥效學(xué)的評估具有很大的困難。因此發(fā)展一種高效、簡單、快速合成Teixobactin類似物的方法，得到一系列具有優(yōu)良生物活性的Teixobactin結(jié)構(gòu)類似物是本發(fā)明要解決的技術(shù)問題。

在現(xiàn)有技術(shù)1中，Teixobactin是由Kim Lewis研究組通過iChip技術(shù)對未培養(yǎng)的土壤細(xì)菌進(jìn)行原位培養(yǎng)，分離得到的。然而，采用天然產(chǎn)物的分離技術(shù)，其工藝復(fù)雜，需要耗費(fèi)較長的時間，并且不適合快速地開發(fā)相關(guān)的衍生物并考察其藥效學(xué)活性。

在現(xiàn)有技術(shù)2中，李學(xué)臣等將在固相上合成的線性六肽與環(huán)五肽，通過Ser/Thr連接，得到Teixobactin。但該方法涉及液相合成方式，因此合成步驟較多，涉及多種保護(hù)基的脫保護(hù)。

在現(xiàn)有技術(shù)3中，Richard J.Payne等以HMPB-NovaPEG樹脂為固相載體，選擇碳端的D-Thr和氮端的Ala作為環(huán)化位點(diǎn)，先合成FmocSer(tBu)-D-Thr(OH)-Resin,然后在樹枝上進(jìn)行Alloc-Ile-OH與D-Thr的酯化，隨后在Ser的氮端進(jìn)行側(cè)鏈延伸，然后在Ile的氮端依次連接L-allo-End、Ala，最后將線性肽從樹脂上切割下來，進(jìn)行液相關(guān)環(huán)，最終脫保護(hù)，得到Teixobactin。

在現(xiàn)有技術(shù)4中，F(xiàn)ernando Albericio等以2-Cl-Trt樹脂為固相載體，將Teixobactin中的非天然氨基酸L-allo-End用L-Arg替代，選擇碳端的Ala和氮段的Arg作為環(huán)化位點(diǎn)，先合成線性四肽FmocIle-Ser(tBu)-D-Thr(OH)-Ala-Resin，然后在樹枝上進(jìn)行Alloc-Ile-OH與D-Thr的酯化，酯化后脫掉Ile的Alloc保護(hù)基將Alloc-Arg(Pbf)-OH與Ile連接，隨后脫掉側(cè)鏈Ile的Fmoc保護(hù)基對其進(jìn)行延伸，最后將線性肽從樹脂上切割下來，進(jìn)行液相關(guān)環(huán)，最終脫保護(hù)，得到Teixobactin的幾個類似物。

在現(xiàn)有技術(shù)5中，Ishwar Singh等以2-Cl-Trt樹脂為固相載體，將Teixobactin中非天然氨基酸L-allo-End用L-Arg替代，選擇碳端的Ala和氮段的Arg作為環(huán)化位點(diǎn)，先將Teixobactin中成環(huán)的四個氨基酸連接在樹脂上得到TrtArg(Pbf)-Ile-O-D-Thr(NH₂)-Ala-Resin，然后在D-Thr的氮端進(jìn)行側(cè)鏈延伸，最后將線性肽從樹脂上切割下來，進(jìn)行液相關(guān)環(huán)，最終脫保護(hù)，得到Teixobactin的兩個類似物。

然而現(xiàn)有技術(shù)3、4、5中，雖然通過Fmoc-固相合成策略能夠高效地合成直鏈肽，然而這些合成策略中除了使用Fmoc和酸敏感的保護(hù)基外，還使用了Alloc保護(hù)基，合成過程中涉及Alloc保護(hù)的氨基酸的合成，現(xiàn)有技術(shù)5中還涉及保護(hù)基團(tuán)的轉(zhuǎn)變，使合成過程變得復(fù)雜。

在現(xiàn)有技術(shù)6中，James S.Nowick等以2-Cl-Trt樹脂為固相載體，將Teixobactin中非天然氨基酸L-allo-End用L-Arg替代，選擇碳端的Arg和氮段的Ile作為環(huán)化位點(diǎn)，先合成線性10肽BocN-Me-D-Phe-Ile-Ser(tBu)-D-Gln(Trt)-D-allo-Ile-Ile-Ser(tBu)-D-Thr(OH)-Ala-Arg(Pbf)-Resin，然后在樹枝上進(jìn)行Fmoc-Ile-OH與D-Thr的酯化，最后將線性肽從樹脂上切割下來，進(jìn)行液相關(guān)環(huán)，最終脫保護(hù)，得到Teixobactin的兩個類似物。

在現(xiàn)有技術(shù)7中，D.Srinivasa Reddy通過液相合成方法合成了Teixobactin的四環(huán)片段。

現(xiàn)有技術(shù)7中，以液相合成方法合成了Teixobactin的四環(huán)片段，該方法合成步驟多，效率低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種Teixobactin類似物的制備方法。該方法包括以下步驟：(1)通過固相策略合成環(huán)化前體；(2)用醋酸銅/吡啶處理樹脂，濾除樹脂后，粗產(chǎn)物用半制備液相色譜儀純化，得到環(huán)化體；(3)在溶液中進(jìn)行脫保護(hù)；(4)蒸除溶劑，用半制備液相色譜儀純化，收集產(chǎn)物，冷凍干燥。

具體地，本發(fā)明提供了一種Teixobactin類似物的制備方法，其包括以下步驟：

1)在具有氨基的基團(tuán)或肼基團(tuán)的固相合成樹脂上依次偶聯(lián)6-12個(優(yōu)選7、8、9、10或11個)氨基酸，得到直鏈肽AA₁-AA₂-……-AA_n-1-AA_n-固相合成樹脂；其中，AA_n-1選自側(cè)鏈具有羥基的氨基酸；

2)AA_n-1的側(cè)鏈上縮合偶聯(lián)2個氨基酸，得到前體AA₁-AA₂-……-AA_n-1(OCOAA_i-AA_ii)-AA_n-固相合成樹脂；

3)裂解固相合成樹脂，并將AA_ii與AA_n進(jìn)行縮合偶聯(lián)，獲得環(huán)合產(chǎn)物；

可選地，4)脫除環(huán)合產(chǎn)物上的側(cè)鏈保護(hù)基。

進(jìn)一步地，步驟1)中的偶聯(lián)包括以下步驟：

步驟A)脫除N末端氨基酸或固相合成樹脂上的N基保護(hù)基；

步驟B)縮合偶聯(lián)氨基酸；

可選地，步驟C)檢測反應(yīng)是否完全。

進(jìn)一步地，步驟1)中偶聯(lián)的氨基酸除AA_n-1外，其余氨基酸為側(cè)鏈被保護(hù)氨基酸。

本發(fā)明所用的N基保護(hù)基選自Fmoc、Z、Boc、Alloc中的一種或多種；N基保護(hù)基的脫除試劑選自弱堿性試劑，優(yōu)選選自哌啶、乙二胺、嗎啡啉中的一種或多種。

進(jìn)一步地，步驟C)中檢測反應(yīng)完全的方法選自四氯苯醌法、茚三酮法、三硝基苯磺酸法中的一種或多種的組合。

本發(fā)明中氨基酸縮合偶聯(lián)形成酰胺鍵所用的偶聯(lián)活化劑選自HATU、DCC、DIC、HBTU、HOAt、HOBt、PyBOP、BTC中的一種或多種組合，將氨基酸轉(zhuǎn)化成活潑中間體。

本發(fā)明所用的固相合成樹脂選自肼樹脂、TCP樹脂以及切除樹脂后末端為羧基的樹脂。

進(jìn)一步地，步驟2)中AA_i的羧基與AA_n-1的側(cè)鏈羥基形成酯鍵。

進(jìn)一步地，步驟2)中形成酯鍵的縮合劑選自DCC、DIC、HATU、HBTU、HOAt、HOBt、PyBOP、BTC中的一種或多種組合。

進(jìn)一步地，步驟3)環(huán)化反應(yīng)中AA_ii的氨基與A_n的羧基進(jìn)行環(huán)化偶聯(lián)形成酰胺鍵。

進(jìn)一步地，步驟3)的環(huán)化方法為醋酸銅法、NBS法或空氣加熱法。

優(yōu)選地，步驟3)的環(huán)化條件選自吡啶/醋酸銅。更優(yōu)選在待環(huán)合物中加入無水DMF、吡啶和醋酸銅，共同反應(yīng)至反應(yīng)完全。

更優(yōu)選地，環(huán)化反應(yīng)完成后還包括將環(huán)化產(chǎn)物純化的步驟。

步驟4)中，選擇本領(lǐng)域常規(guī)的脫除氨基酸側(cè)鏈保護(hù)的條件進(jìn)行側(cè)鏈保護(hù)基的脫除，優(yōu)選為TFA、TIS、苯酚中的一種或多種的溶液；更優(yōu)選為TFA/TIS/H₂O，(v∶v∶v，95/2.5/2.5)。

優(yōu)選地，步驟1)中AA₁縮合至直鏈肽后不脫除N基保護(hù)基。

進(jìn)一步地，AA₁選自D-N-Me-Phe，或D-N-Me₂-Phe。步驟1)中AA₁偶聯(lián)的方法為縮合偶聯(lián)Fmoc-D-N-Me-Phe-OH，隨后脫掉Fmoc，所得產(chǎn)物在CH₃CN/H₂O(3∶1)中溶脹后，加入NaBH₃CN溶液，隨后加入甲醛溶液，反應(yīng)液的pH調(diào)至5-7，至反應(yīng)完全；或

AA₁偶聯(lián)的方法為縮合偶聯(lián)Boc-D-N-Me-Phe-OH，不脫除Boc保護(hù)直接進(jìn)入步驟2)，

本發(fā)明所采用的氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、組氨酸、酪氨酸、胱氨酸、賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、別異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、N-Me-Phe、N-Me_2-Phe。優(yōu)選地，上述氨基酸為L構(gòu)型或D構(gòu)型。

本發(fā)明另一方面提供了一種Teixobactin類似物，其結(jié)構(gòu)如式I或2所示。

其中，A選自-N(CH₃)₂、-NHCH₃或-NH₂；

R₁、R₄、R₇或R₁₀獨(dú)立地選自-H、-CH₃、-CH-(CH₃)₂、-CH₂-CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)-CH₂-CH₃、-CH₂-C₆H₅、-CH₂-C₆H₄-OH、-CH₂-COOH、-CH₂-CONH₂、-(CH₂)₂-COOH、-(CH₂)₂-CONH₂、(CH₂)₄-NH₂、-(CH₂)-S-CH₃、-CH₂-OH、CH(CH₃)-OH、CH₂-SH、

優(yōu)選地，R1選自-CH₂-C₆H₅，-CH₂-C₆H₄-OH、-CH₂-CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)-CH₂-CH₃中的一種，

R₄選自-CH₂-CONH₂、-(CH₂)₂-CONH₂、(CH₂)₄-NH₂、中的一種，

R₇選自-CH₂-OH、-H、-CH₃、-CH₂-C₆H₄-OH、-CH₂-C₆H₄-OH中的一種，

R₁₀選自-(CH₂)₂-CONH₂、-CH₂-CONH₂、(CH₂)₄-NH₂、中的一種。

更優(yōu)選為如式1a-1i所示。

本發(fā)明再一個方面提供了前述所示Teixobactin類似物在抑制微生物的藥物中的用途；所述微生物優(yōu)選為細(xì)菌、真菌或病毒；更優(yōu)選為細(xì)菌。

本發(fā)明能夠以簡單廉價的氨基酸為原料，簡單、快速的制備該類化合物，并且采用肼樹脂作為固相載體，能夠在樹脂上直接關(guān)環(huán)得到環(huán)化產(chǎn)物，減少合成步驟；并且該方法能夠用于放大生產(chǎn)，提供足量的化合物以供相關(guān)的藥效學(xué)、藥代學(xué)研究，以及未來在抗菌藥物方面的應(yīng)用。

附圖說明

圖1：Teixobactin和Arg₁₀-teixobactin(1a)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2：Arg₁₀-teixobactin(1a)的¹H-NMR圖；

圖3：Arg₁₀-teixobactin(1a)的HRMS圖；

圖4：Lys₁₀-teixobactin(1b)的¹H-NMR圖；

圖5：Lys₁₀-teixobactin(1b)的HRMS圖；

圖6：His₁₀-teixobactin(1c)的¹H-NMR圖；

圖7：His₁₀-teixobactin(1c)的HRMS圖；

圖8：Ala₇-Arg₁₀-teixobactin(1d)的¹H-NMR圖；

圖9：Ala₇-Arg₁₀-teixobactin(1d)的HRMS圖；

圖10：D-Asn₄-Arg₁₀-teixobactin(1e)的¹H-NMR圖；

圖11：D-Asn₄-Arg₁₀-teixobactin(1e)的HRMS圖；

圖12：D-Arg₄-Arg₁₀-teixobactin(1f)的¹H-NMR圖；

圖13：D-Arg₄-Arg₁₀-teixobactin(1f)的HRMS圖；

圖14：D-Phe₁-Arg₁₀-teixobactin(1g)的¹H-NMR圖；

圖15：D-Phe₁-Arg₁₀-teixobactin(1g)的HRMS圖；

圖16：D-Me₂Phe₁-Arg_10-teixobactin(1h)的¹H-NMR圖；

圖17：D-Me₂Phe₁-Arg₁₀-teixobactin(1h)的HRMS圖；

圖18：D-Tyr₁-Arg₁₀-teixobactin(1i)的¹H-NMR圖；

圖19：D-Tyr₁-Arg₁₀-teixobactin(1i)的HRMS圖。

具體實施方式

實施例1化合物1a的制備方法

(1)直鏈肽的制備：

于一個50mL的固相反應(yīng)器中加入肼樹脂(0.61mmol/g，800mg，0.488mmol)及CH₂Cl₂(3ml)，溶脹樹脂30min。抽除CH₂Cl₂，用20％哌啶/DMF溶液(3ml)脫除Fmoc保護(hù)基，10min后，用DMF(4x3mL)洗滌樹脂，再用無水DMF(2x3mL)洗滌樹脂，備用。同時將Fmoc-Ala-OH((76mg,0.244mmol)和HATU(91mg,0.23mmol)溶于無水DMF(2ml)，向該溶液中加入DIEA(120μL,0.732mmol)，混勻，將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到脫除Fmoc的肼樹脂中，N₂鼓泡混勻，縮合反應(yīng)2h。抽除反應(yīng)液，用DMF(4x3mL)洗滌樹脂，再用無水DMF(3mL)洗滌樹脂。向樹脂中加入特戊酸酐(186μL,0.96mmol)和DIEA(500μL,2.88mmol)的DMF(2mL)溶液，反應(yīng)15min，抽除反應(yīng)液，用DMF(4x3mL)洗滌樹脂，得到樹脂的取代度為0.30mmol/g(800mg，0.24mmol，1eq.)。

隨后以縮合方式(步驟A-D)依次偶聯(lián)D-Thr、Ser(tBu)、Ile、D-allo-Ile、D-Gln(Trt)、Ser(tBu)、Ile、Boc-D-N-Me-Phe，獲得直鏈肽：Boc-D-N-Me-Phe-Ile-Ser(tBu)-D-Gln(Trt)–D-alle-Ile-Ser(tBu)-D-Thr-Ala固相合成樹脂。

步驟A：Fmoc脫保護(hù)

20％哌啶/DMF溶液(3ml)加入樹脂中，鼓氣5min，抽去溶劑，再加入20％哌啶/DMF溶液(3ml)加入樹，鼓氣5min，抽去溶劑，用DMF(4x3mL)洗滌樹脂，再用無水DMF(2x3mL)洗滌樹脂。

步驟B：氨基酸的偶聯(lián)

Fmoc-Xaa-OH(或Boc-D-N-Me-Phe-OH)(4.0eq.)和HATU(4.0eq.)溶于無水DMF(2ml)，向該溶液中加入DIEA(12eq.)，混勻，將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到脫除Fmoc的肼樹脂中，N₂鼓泡混勻，縮合反應(yīng)0.5h(茚三酮試劑檢測至反應(yīng)完全)。抽除反應(yīng)液，用DMF(4x3mL)洗滌樹脂。

步驟C：茚三酮檢測

偶聯(lián)反應(yīng)時，取出少量樹脂，DMF洗兩遍，加入兩滴茚三酮檢測液(茚三酮15g，乙酸3ml，正丁醇100ml)，90℃加熱3min，樹脂不發(fā)生顏色變化表明反應(yīng)完全。樹脂變藍(lán)表明存在初級氨。

步驟D：四氯苯醌檢測

取出少量樹脂，DMF洗兩遍，加入兩滴2％乙醛/DMF溶液和兩滴2％四氯苯醌/DMF溶液，室溫保持5min，樹脂由綠變藍(lán)表明存在二級氨。

(2)前體的制備：

Fmoc-Ile-OH與步驟1所得直鏈肽酯化：將Fmoc-Ile-OH(20eq.)溶于CH₂Cl₂/DMF(2ml,v/v:1∶1)，加入DCC(10eq.)，冰浴下攪拌1h，然后在室溫攪拌反應(yīng)1h。將直鏈肽2轉(zhuǎn)入EP管中，將反應(yīng)液離心去除沉淀，將上清加入到直鏈肽2中，加入DMAP(10eq.)，振蕩反應(yīng)，縮合反應(yīng)2h。抽除反應(yīng)液，用DMF(4x3mL)洗滌樹脂,再用無水DMF(2x3mL)洗滌樹脂。該過程重復(fù)一次。獲得Boc-D-N-Me-Phe-Ile-Ser(tBu)-D-Gln(Trt)-D-alle-Ile-Ser(tBu)-D-Thr(O-CO-Ile-N-Fmoc)-Ala固相合成樹脂。

酯化后，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH(4.0eq.)和HATU(4.0eq.)溶于無水DMF(2ml)，向該溶液中加入DIEA(12eq.)，混勻，將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到前步獲得的脫除Fmoc的Boc-D-N-Me-Phe-Ile-Ser(tBu)-D-Gln(Trt)-D-alle-Ile-Ser(tBu)-D-Thr(O-CO-Ile-NH₂)-Ala固相合成樹脂，N₂鼓泡混勻，縮合反應(yīng)0.5h(茚三酮試劑檢測至反應(yīng)完全)。抽除反應(yīng)液，用DMF(4x3mL)洗滌樹脂，獲得前體3。

(3)環(huán)化

用CH₂Cl₂(2x3ml)洗滌樹脂，抽除CH₂Cl₂，樹脂中加入無水DMF，吡啶，醋酸銅，過夜震蕩，然后用半制備型HPLC純化，收集產(chǎn)物，冷凍干燥，得到環(huán)化產(chǎn)物。

(4)終產(chǎn)物Arg₁₀-teixobactin的制備

將TFA/TIS/H₂O，95/2.5/2.5加入得到的環(huán)化產(chǎn)物中，攪拌1h，然后用半制備型HPLC純化，收集產(chǎn)物，冷凍干燥，得到化合物1a(Arg₁₀-teixobactin)。

¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ0.52-0.66(m,6H),0.66-0.92(m,19H),0.99-1.23(m,7H),1.24-1.60(m,9H),1.60-1.96(m,7H),2.01-2.14(m,2H),2.46(s,3H),2.90-3.01(m,1H),3.05-3.20(m,4H),3.50-3.80(m,4H),3.89-3.98(m,1H),3.98-4.07(m,1H),4.10-4.24(m,3H),4.24-4.44(m,5H),4.52-4.65(s,1H),4.92-5.08(m,1H),5.20-5.43(m,2H),6.71-6.86(s,1H),7.13-7.38(m,5H),7.50-7.80(m,6H),7.82-8.15(m,5H),8.40-8.55(m,2H),8.89-9.17(m,2H)ppm；

HRMS(ESI)m/z:calcd for C₅₈H₉₈N₁₅O₁₅[M+H]⁺1244.7367,found 1244.7368.

實施例2化合物1b的制備方法

實施例2的制備方法與實施例1相同，區(qū)別僅在于在第2步中，以Fmoc-Lys(Boc)-OH替換Fmoc-Arg(Pbf)-OH。其他步驟相同。

Lys₁₀-teixobactin(1b):¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ0.52-0.64(m,6H),0.68-0.97(m,19H),0.97-1.20(m,7H),1.20-1.47(m,8H),1.47-1.95(m,10H),1.95-2.19(m,2H),2.46(s,3H),2.62-2.89(m,2H),2.89-3.01(m,1H),3.02-3.18(m,1H),3.49-3.78(m,4H),3.87-4.08(m,2H),4.08-4.50(m,9H),4.50-4.70(s,1H),4.87-5.13(s,1H),5.20-5.45(m,2H),6.70-6.88(s,1H),7.11-7.38(m,5H),7.50-7.85(m,6H),7.88-8.20(m,5H),8.30-8.59(m,2H),8.92-9.30(m,2H)ppm；HRMS(ESI)m/z:calcd for C₅₈H₉₈N₁₃O₁₅[M+H]⁺1216.7305,found 1216.7280.

實施例3化合物1c的制備方法

實施例3的制備方法與實施例1相同，區(qū)別僅在于在第2步中，以Fmoc-His(Trt)-OH替換Fmoc-Arg(Pbf)-OH。其他步驟相同。

His₁₀-teixobactin(1c):¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ0.50-0.69(m,6H),0.69-0.91(m,16H),0.95-1.35(m,11H),1.35-1.59(m,3H),1.61-2.00(m,5H),1.95-2.20(m,2H),2.46(s,3H),2.90-3.20(m,4H),3.49-3.77(m,5H),3.82-3.92(m,1H),3.95-4.03(m,1H),4.09-4.28(m,3H),4.28-4.43(m,3H),4.51-4.78(m,2H),4.90-5.10(m,1H),5.15-5.40(m,2H),6.71-6.85(m,1H),7.15-7.37(m,5H),7.70-7.90(m,2H),7.90-8.19(m,5H),8.32-8.57(m,2H),8.87-8.79(s,1H)ppm；HRMS(ESI)m/z:calcd for C₅₈H₉₂N₁₄O₁₅[M+H]⁺1225.6945,found 1225.6944.

實施例4化合物1d的制備方法

實施例4的制備方法與實施例1相同，區(qū)別僅在于在第1步中，將第一個偶聯(lián)的Fmoc-Ser(tBu)-OH替換為Fmoc-Ala-OH。其他步驟相同。

Ala₇-Arg₁₀-teixobactin(1d):¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ0.65-0.88(m,7H),0.88-1.05(m,16H),1.05-1.42(m,11H),1.40-1.76(m,12H),1.76-2.24(m,9H),2.27-2.39(m,2H),2.69(s,3H),3.05-3.15(m,1H),3.17-3.30(m,3H),3.70-3.87(m,2H),4.00-4.34(m,8H),4.37-4.47(m,2H),4.49-4.60(m,1H),4.71-4.85(m,1H),5.52-5.62(m,1H),7.73-7.61(m,5H),8.09-8.30(m,3H),8.35-8.54(m,3H)ppm；HRMS(ESI)m/z:calcd for C₅₈H₉₈N₁₅O₁₁₄[M+H]⁺1228.7418,found 1228.7411.

實施例5化合物1e的制備方法

實施例5的制備方法與實施例1相同，區(qū)別僅在于在第1步中，以Fmoc-D-Asn(Trt)-OH替換Fmoc-D-Gln(Trt)-OH。其他步驟相同。

D-Asn₄-Arg₁₀-teixobactin(1e):¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ0.58-0.67(m,7H),0.67-0.90(m,21H),0.99-1.20(m,8H),1.20-1.30(m,2H),1.30-1.60(m,11H),1.65-1.89(m,5H),2.30-2.62(m,10H),2.85-3.02(m,1H),3.02-3.21(m,4H),3.48-3.62(m,2H),3.62-3.79(m,2H),3.85-4.00(m,1H),4.00-4.10(m,1H),4.10-4.26(m,3H),4.26-4.40(m,4H),4.50-4.67(m,1H),4.82-5.10(s,1H),5.18-5.40(m,2H),6.75-6.69(s,2H),7.19-7.37(m,5H),7.40-7.59(m,2H),7.60-7.69(m,2H),7.69-7.80(m,1H),7.95-8.30(m,4H),8.35-8.60(m,2H),8.90-9.25(m,2H)ppm；HRMS(ESI)m/z:calcd for C₅₇H₉₆N₁₅O₁₅[M+H]⁺1230.7210,found 1230.7219.

實施例6化合物1f的制備方法

實施例6的制備方法與實施例1相同，區(qū)別僅在于在第1步中，以Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH替換Fmoc-D-Gln(Trt)-OH。其他步驟相同。

D-Arg4-Arg10-teixobactin(1f):¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ0.52-0.69(m,6H),0.74-0.91(m,19H),0.95-1.20(m,7H),1.25-1.59(m,12H),1.59-1.73(m,3H),1.73-1.90(m,3H),2.46(s,3H),2.90-3.00(m,1H),3.00-3.20(m,5H),3.50-3.62(m,2H),3.62-3.80(m,2H),3.83-3.99(m,1H),3.99-4.10(m,1H),4.10-4.42(m,8H),4.55-4.65(m,1H),4.95-5.07(br s,1H),5.20-5.45(m,2H),6.73-7.11(m,4H),7.11-7.38(m,5H),7.50-7.66(m,2H),7.70-7.82(m,2H),7.90-8.05(m,2H),8.05-8.55(m,3H),8.92-9.25(m,1H)ppm；HRMS(ESI)m/z:calcd for C₅₉H₁₀₂N₁₇O₁₄[M+H]⁺1272.7792,found 1272.7782.

實施例7化合物1g的制備方法

實施例7的制備方法與實施例1相同，區(qū)別僅在于在第1步中，以Boc-D-Phe-OH替換Boc-D-N-Me-Phe-OH。其他步驟相同。

D-Phe₁-Arg₁₀-teixobactin(1g):¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ0.60-0.80(m,23H),1.00-1.55(m,18H),1.55-1.91(m,9H),1.95-2.16(m,3H),2.87-3.20(m,6H),3.50-3.83(m,8H),3.90-4.07(m,2H),4.11-4.40(m,8H),4.50-4.68(s,1H),4.97-5.08(m,1H),5.19-5.40(m,2H),6.74-6.90(s,2H),7.20-7.40(m,6H),7.54-7.85(m,4H),7.88-8.30(m,8H),8.38-8.48(s,1H),8.50-8.60(d,1H)pm；HRMS(ESI)m/z:calcd for C₅₇H₉₆N₁₅O₁₅[M+H]⁺1230.7210,found 1230.7190.

實施例8化合物1h的制備方法

實施例8的制備方法與實施例1相同，區(qū)別在于在第1步中，以Fmoc-D-N-Me-Phe-OH替換Boc-D-N-Me-Phe-OH。Fmoc-D-N-Me-Phe-OH偶聯(lián)至樹脂后，脫除Fmoc，直肽鏈D-N-Me-Phe-Ile-Ser(tBu)-D-Gln(Trt)–D-alle-Ile-Ser(tBu)-D-Thr(OH)-Ala-固相合成樹脂在CH₃CN/H₂O(3∶1)中溶脹15min,抽去溶劑，加入NaBH₃CN(302mg，4.8mmol,20eq.)的CH₃CN/H₂O溶液(3∶1，2ml),隨后加入30％的甲醛溶液(1.5ml，12mmol，50eq.)，反應(yīng)液的pH至用乙酸調(diào)至5-7，反應(yīng)1-2h，直至四氯苯醌檢測呈陰性，得到D-N-Me₂-Phe-Ile-Ser(tBu)–D-Gln(Trt)–D-alle-Ile-Ser(tBu)-D-Thr(OH)-Ala-固相合成樹脂。其余步驟與制備1a的方法相同。

D-Me₂Phe₁-Arg₁₀-teixobactin(1h):¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ0.42-0.70(m,7H),0.70-0.98(m,20H),1.00-1.20(m,8H),1.20-1.55(m,2H),1.55-1.90(m,3H),1.95-2.17(m,3H),2.67-3.04(m,2H),3.04-3.20(m,4H),3.47-3.80(m,10H),3.88-4.09(m,1H),4.09-4.40(m,4H),4.50-4.66(s,2H),4.90-5.04(s,2H),5.15-5.41(m,1H),6.70-6.95(s,1H),7.10-7.37(m,3H),7.50-7.81(m,4H),7.84-8.18(m,1H),8.32-8.58(s,1H),10.03-10.32(d,2H)ppm；HRMS(ESI)m/z:calcd for C₅₉H₁₀₀N₁₅O₁₅[M+H]⁺1258.7523,found 1258.7512.

實施例9化合物1i的制備方法

實施例9的制備方法與實施例1相同，區(qū)別僅在于在第1步中，將偶聯(lián)Boc-D-N-Me-Phe的步驟替換為偶聯(lián)Boc-D-Tyr(tBu)-OH，其他步驟相同。

D-Tyr₁-Arg₁₀-teixobactin(1i):¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ0.70-0.95(m,24H),1.02-1.20(m,6H),1.20-1.56(m,11H),1.56-1.95(m,9H),1.96-2.17(m,3H),2.73-2.89(m,1.5H),2.89-3.00(m,1.5H),3.06-3.20(m,3H),3.50-3.80(m,5H),3.90-4.15(m,3H),4.15-4.23(m,1H),4.23-4.42(m,6H),4.50-4.65(s,1H),4.92-5.08(s,1H),5.15-5.40(m,2H),6.63-6.78(d,2H),6.78-6.84(s,1H),7.03-7.12(d,3H),7.20-7.30(s,2H),7.55-7.83(m,5H),7.90-8.15(m,7H),8.15-8.29(d,1H),8.38-8.49(s,1H),8.49-8.57(d,1H),9.31-9.40(s,1H)ppm；HRMS(ESI)m/z:calcd for C₅₇H₉₆N₁₅O₁₆[M+H]⁺1246.7159,found 1246.7161.

實施例10抑菌試驗

以Meropenem對革蘭氏陽性菌Bacillus subtilis ATCC 6633的抑制活性作為陽性對照(最小抑制濃度為0.25μg/ml)，Teixobactin類似物Arg₁₀-teixobactin(1a)、Lys₁₀-teixobactin(1b)、His₁₀-teixobactin(1c)、Ala₇-Arg₁₀-teixobactin(1d)、D-Asn₄-Arg₁₀-teixobactin(1e)、D-Arg₄-Arg₁₀-teixobactin(1f)、D-Phe₁-Arg₁₀-teixobactin(1g)、D-Me₂Phe₁-Arg₁₀-teixobactin(1h)對革蘭氏陽性菌Staphylococcus aureus ATCC 29213的最小抑制濃度分別為2，2，8，32，2，2，2，32μg/ml，對Bacillus subtilis ATCC 6633的最小抑制濃度分別為0.25，0.5，2，8、0.5、1、0.5、8μg/ml。而這些類似物對革蘭氏陰性菌Escherichiacoli ATCC 25922幾乎沒有抑制活性。而D-Tyr₁-Arg₁₀-teixobactin(1i)對革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌均沒有抑制活性。