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一種金線蓮莖腐病菌分子檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法與流程

文檔序號(hào):11145841閱讀:655來源:國(guó)知局
一種金線蓮莖腐病菌分子檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法與制造工藝

本發(fā)明涉及一種金線蓮莖腐病菌分子檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法,專用于金線蓮莖腐病菌高靈敏度快速分子檢測(cè),克服了傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法繁雜且準(zhǔn)確性低的缺點(diǎn),屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)、鑒定及防治技術(shù)的領(lǐng)域。



背景技術(shù):

金線蓮又稱金線蘭,蘭科開唇蘭等,屬多年生草本植物,珍稀民間中草藥,素有“藥王”“金草”“神藥”等美稱,具有清熱退火、滋養(yǎng)強(qiáng)壯、潤(rùn)肺保肝及消腫解毒等功效,已廣泛應(yīng)用于高血壓、糖尿病、腎病、腫瘤等的治療和保健等方面。野生金線蓮對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻,繁殖率低,生長(zhǎng)緩慢,且由于其獨(dú)有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,致使人工過度采挖,已面臨滅絕的境地。目前金線蓮主要通過人工栽培,但在栽培過程中病害問題也日漸突顯。

最近,在福建省多個(gè)金線蓮種植地出現(xiàn)了莖腐病病樣,該病對(duì)金線蓮不同生長(zhǎng)期皆可造成危害,發(fā)病時(shí)植株莖基部先出現(xiàn)黃褐色水漬狀病斑,病斑擴(kuò)大至繞莖周,病部組織腐爛干枯縊縮呈線狀。該病蔓延迅速,病情越來越嚴(yán)重,幼苗迅速倒伏死亡,出現(xiàn)大面積猝倒,嚴(yán)重威脅金線蓮的健康生產(chǎn)。通過對(duì)病樣采集、病菌分離鑒定,柯赫氏法則驗(yàn)證,最終確定金線蓮莖腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。

目前對(duì)金線蓮莖腐病的鑒定大多仍沿用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。傳統(tǒng)的病原菌鑒定技術(shù)是在分離培養(yǎng)獲得相應(yīng)病原物的基礎(chǔ)上,通過形態(tài)學(xué)觀察和柯赫氏法則來判斷病原物的種類。整個(gè)過程常常需要耗費(fèi)大量的勞動(dòng)力和時(shí)間,一般需要幾天才能完成,而且要求操作者具備專業(yè)的病原菌分離、形態(tài)學(xué)鑒定知識(shí)和豐富的經(jīng)驗(yàn),因此以病原菌形態(tài)學(xué)特征為判斷基礎(chǔ)的傳統(tǒng)病原菌診斷方法,因其耗時(shí)長(zhǎng),效率低,難以滿足對(duì)金線蓮莖腐病診斷的實(shí)際需要,因其很容易錯(cuò)過病害防治的最佳時(shí)期。

近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,以PCR技術(shù)為代表的分子檢測(cè)方法得到了迅速的發(fā)展和應(yīng)用,尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用在很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足。這類方法普遍具有快速、準(zhǔn)確、靈敏且不需要進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)的特點(diǎn),在控制植物病害的傳播、成災(zāi)中已經(jīng)開始發(fā)揮重要作用。因此,建立一套快速、靈敏、準(zhǔn)確的金線蓮莖腐病菌檢測(cè)診斷技術(shù)不僅非常必要,而且十分迫切。

核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列是由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成,在微生物基因組中以多拷貝出現(xiàn),具有種的特異性,因此該序列成為在種的水平鑒定病原菌極好的目標(biāo)。為此,我們利用真菌通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增金線蓮莖腐病菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)并進(jìn)行克隆測(cè)序,通過序列比對(duì),設(shè)計(jì)出一對(duì)金線蓮莖腐病菌特異性引物,建立金線蓮莖腐病菌快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的監(jiān)測(cè)技術(shù)體系。此技術(shù)可應(yīng)用于金線蓮莖腐病菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測(cè),對(duì)于確定病害防治最佳時(shí)期具有重要的作用,為防治策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中金線蓮莖腐病菌傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)操作者的實(shí)驗(yàn)技能和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)有很高的要求,且十分耗時(shí),無法達(dá)到快速檢驗(yàn)的問題,提供金線蓮莖腐病菌的特異分子檢測(cè)引物以及結(jié)果可靠、易于操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高的金線蓮莖腐病菌的快速分子檢測(cè)體系和程序。該方法可用于金線蓮莖腐病菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測(cè),對(duì)確定病害防治最佳時(shí)期具有十分重要的意義。

為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:

1.根據(jù)金線蓮莖腐病菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了對(duì)金線蓮莖腐病菌具有特異擴(kuò)增作用的一對(duì)PCR引物,序列如下:

ITS403f:5’-CCCAACCCCTGTGACATAC-3’;

ITS403r:5’-ATTACCAGTAACGAGGGTT-3’。

2. 金線蓮莖腐病菌快速檢測(cè)體系的建立

(1)金線蓮莖腐病菌特異PCR快速檢測(cè)體系的建立

所述PCR反應(yīng)體系25.0 μl,包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL,10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL, DNA模板25ng,不足部分由dd H2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3min;94℃變性1min,58℃退火30sec ,72℃延伸1min,共25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

(2)金線蓮莖腐病菌巢式PCR快速檢測(cè)體系的建立

以真菌通用引物(ITS1/ ITS4)進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系25.0 μL,包括2×TaqPCR Master Mix12.5μL,10 μmol/L的引物((ITS1/ ITS4)各0.2 μL, DNA模板25ng,不足部分由dd H2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3min,94℃變性1min,55℃退火30 sec ,72℃延伸1min,共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。

分別取1 μL第一輪PCR產(chǎn)物做為DNA模板,用引物(ITS403f / ITS403r)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25.0 μl,包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL,10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL,25ng DNA模板1 μL,不足部分由dd H2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3min;94℃變性1min,58℃退火30sec ,72℃延伸1min,共25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)是金線蓮莖腐病菌的高效特異擴(kuò)增的引物序列及其擴(kuò)增方法。為了檢測(cè)金線蓮莖腐病菌特異引物準(zhǔn)確性,本發(fā)明以我國(guó)福建、浙江、江西、臺(tái)灣等省的18株金線蓮莖腐病菌和其它25種真菌為供試材料,采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA,具體方法如下:

取50mg 冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中,加入900μl 2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取液(2% CTAB;100 m mol/L Tris-HCl, PH 8.0;20mmol/L EDTA,pH8.0;1.4 mol/L NaCl)和90μl 10% SDS(十二烷基苯磺酸鈉)后振蕩混勻,于55~60℃水浴1.5 h,每10 min顛倒混勻一次,水浴1.5h后離心(12,000rpm)8min,取上清液加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(體積比25:24:1),顛倒使充分混勻,12,000rpm離心12 min,取上清液(水相),加入等體積氯仿/異戊醇(體積比24:1),顛倒使充分混勻,12,000rpm離心5min,吸上清,加0.1體積的3mol/L NaAC溶液和2倍體積的冰無水乙醇, 置-20℃冰箱中沉淀30 min以上,12,000rpm離心5 min,輕輕地倒去上清液,加入700μl冰70%乙醇進(jìn)行洗滌(稍離心,傾掉上清),在超凈工作臺(tái)上自然晾干無酒精味后用1×TE(10mmol/LTris-HCL,0.1mmol/LEDTA,pH8.0)溶液進(jìn)行溶解,得到DNA溶液,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度并稀釋至25ng/μL待用。

經(jīng)對(duì)供試25種真菌和18株金線蓮莖腐病菌的特異性進(jìn)行PCR驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系25.0μL,包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL,10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL, DNA模板25ng,不足部分由dd H2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3min;94℃變性1min,58℃退火30sec ,72℃延伸1min,共25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。此特異引物在金線蓮莖腐病菌中特異性地?cái)U(kuò)增出403bp的產(chǎn)物。這說明該引物可被用于發(fā)病植株中金線蓮莖腐病菌快速可靠的檢測(cè)和鑒定。

本發(fā)明有益效果:本發(fā)明方法適用于植株中金線蓮莖腐病菌的快速可靠的檢測(cè)和鑒定,對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中金線蓮莖腐病菌引起的病害防治具有重要的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和積極效果:

1、特異性強(qiáng):本發(fā)明檢測(cè)方法是根據(jù)ITS序列由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了一對(duì)金線蓮莖腐病菌特異引物進(jìn)行檢測(cè)。已經(jīng)對(duì)來自我國(guó)福建、浙江、江西、臺(tái)灣等省的金線蓮莖腐病菌和其它25種不同真菌進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果具有很強(qiáng)的特異性。

2、靈敏度高:巢式PCR對(duì)金線蓮莖腐病菌的檢測(cè)靈敏度在DNA水平上可達(dá)到10fg/25 μL,具有很高的靈敏性。

3、實(shí)用性好:本發(fā)明所設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,可用于金線蓮莖腐病菌的高靈敏度快速檢測(cè),因此本方法的實(shí)用性強(qiáng),可滿足金線蓮莖腐病菌進(jìn)行快速可靠的檢測(cè)和鑒定的需要。

4、操作簡(jiǎn)便快速:應(yīng)用本發(fā)明方法,對(duì)帶金線蓮莖腐病菌的植株進(jìn)行病菌DNA提取、PCR擴(kuò)增和常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳后即可判定結(jié)果,無需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切,整個(gè)檢測(cè)過程可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所要檢測(cè)的金線蓮莖腐病菌的特異PCR擴(kuò)增圖

圖中:M為DL2000 DNA Marker;1為陰性對(duì)照;2-5為尖孢鐮刀菌;6:黃色鐮刀菌;7:燕麥鐮刀菌;8:雪腐鐮刀菌;9:禾谷鐮刀菌;10:炭疽病菌。

圖2為本發(fā)明金線蓮莖腐病菌的靈敏性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果圖

圖中:M為DL2000 DNA Marker ;1為陰性對(duì)照;2-9分別為1 ng/μL,

100pg/μL,10 pg/μL,1 pg/μL,100 fg/μL,10 fg/μL,1 fg/μL,100 ag/μL的不同濃度金線蓮莖腐病菌DNA。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括金線蓮莖腐病菌的特異檢測(cè)引物,所設(shè)計(jì)的引物及其序列為(ITS403f:5’-CCCAACCCCTGTGACATAC-3’和ITS403r:5’-ATTACCAGTAACGAGGGTT-3’)。利用該引物可從金線蓮莖腐病菌中特異擴(kuò)增出403bp的產(chǎn)物。

實(shí)施例1:引物對(duì)金線蓮莖腐病菌的特異性擴(kuò)增

1.金線蓮莖腐病菌的特異檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系25.0 μl,包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL,10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL, DNA模板25ng,不足部分由dd H2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3min;94℃變性1min,58℃退火30sec ,72℃延伸1min,共25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

2.檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)的特異性:除了來自我國(guó)福建、浙江、江西、臺(tái)灣等省等省的金線蓮莖腐病菌DNA可特異地?cái)U(kuò)增出403bp的產(chǎn)物外,檢測(cè)了25種其他真菌DNA均未能擴(kuò)增出任何產(chǎn)物,具有很強(qiáng)的特異性。

實(shí)施例2:引物對(duì)金線蓮莖腐病菌的靈敏度檢測(cè)

1.DNA濃度稀釋:提取的金線蓮莖腐病菌基因組DNA,經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定濃度后,采用系列濃度稀釋。

2.金線蓮莖腐病菌的靈敏度檢測(cè)

采用10倍濃度系列稀釋法將提取的金線蓮莖腐病菌DNA依次稀釋成,1 ng/μL,100 pg/μL,10 pg/μL,1 pg/μL,100 fg/μL,10 fg/μL,1 fg/μL,100 ag/μL共8個(gè)不同濃度梯度,采用巢式PCR對(duì)引物的靈敏度進(jìn)行測(cè)定。

分別取1μL不同濃度的金線蓮莖腐病菌基因組DNA為模板,以真菌通用引物(ITS1/ITS4)進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系25.0 μL,包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL,10 μmol/L 的引物((ITS1/ ITS4)各0.2 μL, DNA模板25ng,不足部分由dd H2O補(bǔ)足。

PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3min,94℃變性1min,55℃退火30 sec ,72℃延伸1min,共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。分別取1 μL第一輪PCR產(chǎn)物做為DNA模板,用引物(ITS403f / ITS403r)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25.0 μl,包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL,10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL, DNA模板25ng,不足部分由dd H2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3min;94℃變性1min,58℃退火30sec ,72℃延伸1min,共25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

3.檢測(cè)結(jié)果:

在25.0μL反應(yīng)體系中,金線蓮莖腐病菌基因組DNA可獲得明顯擴(kuò)增條帶,檢測(cè)靈敏度可達(dá)10 fg/25μL。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 一種金線蓮莖腐病菌分子檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法

<130> 2

<160> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cccaacccct gtgacatac 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attaccagta acgagggtt 19

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