用于防治水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白基因及引物和應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及一種用于防治水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白基因及引物和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻(Oryza sativa L.)是世界主要糧食作物之一，是世界上三分之一人類的主食。水稻干尖線蟲(Aphelenchoides besseyi Christie)引起的水稻干尖線蟲病，使水稻在世界范圍內(nèi)每年減產(chǎn)10％～70％，造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，對水稻干尖線蟲的防治措施，主要是加強檢疫，以及播種前用溫湯或藥劑浸種，但浸種后水稻發(fā)芽勢常有降低趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，水稻栽培過程中，施肥施藥等工作對土壤環(huán)境滲透壓造成了重要影響。大部分生物在高滲透壓下無法存活，而水稻干尖線蟲可通過進入變滲隱生狀態(tài)，在高滲透壓環(huán)境下存活，當環(huán)境適宜時，又恢復(fù)正常代謝，使浸種防治與農(nóng)藥防治效果降低，增加防治水稻干尖線蟲的難度。對水稻干尖線蟲應(yīng)對高滲透壓脅迫時的生理機制進行研究，可為防治水稻干尖線蟲提供新思路，避免因化學藥劑的過量使用造成環(huán)境污染。

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)具有抗氧化、抗旱、耐熱等能力，在生物抗逆中起著重要的作用。Trx廣泛存在于各種生物體內(nèi)，有使巰基和二硫化物相互轉(zhuǎn)換的功能，為一系列生理反應(yīng)提供氧化還原對，維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的還原狀態(tài)，使其正常發(fā)揮功能，對保持生物體內(nèi)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)具有重要的作用。在水稻干尖線蟲抵抗高滲透壓脅迫過程中，Trx起重要輔助作用。目前，國內(nèi)外對植物寄生線蟲Trx的研究較少。鑒于Trx對生物抵抗非生物逆境脅迫的重要作用，擬克隆水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白基因(thioredoxin like protein，Trxl)，通過基因沉默技術(shù)，探究Trxl基因沉默后水稻干尖線蟲在高滲透壓條件下的存活情況，為防治水稻干尖線蟲提供新思路。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于以上不足之處，本發(fā)明提供一種用于防治水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白基因及引物和應(yīng)用。

本發(fā)明所采用的技術(shù)如下：一種用于防治水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白基因，其序列如序列表SEQ No.1所示。

本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：

1、一種用于構(gòu)建水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白基因的引物組，如下：

上游引物Ab-Trxl-F：如序列表SEQ No.2所示，

下游引物Ab-Trxl-R：如序列表SEQ No.3所示。

2、一種用于構(gòu)建水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白基因dsRNA的引物組，如下：

合成正義鏈RNA上游引物Ab-Trxl-TTF：如序列表SEQ No.4所示，

合成正義鏈RNA下游引物Ab-Trxl-iR：如序列表SEQ No.5所示，

合成反義鏈RNA上游引物Ab-Trxl-iF：如序列表SEQ No.6所示，

合成反義鏈RNA下游引物Ab-Trxl-T7R：如序列表SEQ No.7所示。

3、一種用于水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白酶基因Q-PCR檢測的引物組，如下：

上游引物Ab-Trxl-qF：如序列表SEQ No.8所示，

下游引物Ab-Trxl-qR：如序列表SEQ No.9所示。

4、如上所述的一種水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白基因在防治水稻干尖線蟲中的應(yīng)用。

本發(fā)明的類硫氧還蛋白基因在水稻干尖線蟲受高滲透壓脅迫后表達上調(diào)，表明該基因在水稻干尖線蟲抗高滲透壓脅迫過程中起作用。通過對該基因的研究，為研究水稻干尖線蟲應(yīng)對高滲透壓脅迫的生理機制建立基礎(chǔ)，可為防治水稻干尖線蟲提供新思路，避免因化學藥劑的過量使用造成環(huán)境污染。在防治水稻干尖線蟲中具有重要的生物學意義和潛在的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為實施例1中Q-PCR技術(shù)檢驗高滲透壓脅迫后Ab-Trxl相對表達量變化圖；

圖2為實施例1中Q-PCR技術(shù)檢驗Ab-Trxl基因沉默效果圖；

圖3為實施例1中分別對水稻干尖線蟲進行Ab-Trxl基因沉默處理與對照處理后，進行高滲透壓脅迫時水稻干尖線蟲存活數(shù)對比圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供的用于防治水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白基因來源于水稻干尖線蟲，該類硫氧還蛋白基因命名為Ab-Trxl，長度為1,148bp，其基因序列如SEQ No.1所示，具有典型的Trxl結(jié)構(gòu)域。

實施例1：

防治水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白基因的獲得及其功能驗證。

(一)RNA抽提及cDNA合成：

DEPC處理水清洗線蟲(雌蟲：雄蟲：幼蟲＝4:2:1)，離心去上清后，液氮處理下研磨。取研磨粉末，應(yīng)用TRIzol法(Invitrogen，cat.No.15596-026)提取水稻干尖線蟲總RNA，DEPC處理水溶解。應(yīng)用AMV反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega，cat.No.A3500)，以O(shè)ligo(dT)₁₈為引物進行第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄，隨機引物法合成第二鏈cDNA。反應(yīng)過程根據(jù)試驗手冊進行。

(二)水稻干尖線蟲類硫氧還蛋白基因完整閱讀框克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果合成水稻干尖線蟲類硫氧還蛋白基因引物組，

Ab-Trxl-F:5`-TTC GAC AAA CTC TAT CCA GC-3`，

Ab-Trxl-R：5`-TGA AAT TCC ATT TGA TGG CG-3`。

以水稻干尖線蟲第二鏈cDNA為模板進行完整閱讀框序列的PCR擴增(TaKaRa r-Taq酶25μL反應(yīng)體系：94℃30s，58℃1min，72℃1min，進行35個循環(huán))，擴增產(chǎn)物送生物公司測序驗證，所得序列命名為Ab-Trxl。

(三)熒光定量Q-PCR驗證

選取高滲透壓(飽和MgSO₄·7H₂O溶液)處理4h、12h、24h、48h和96h后水稻干尖線蟲，液氮下研磨并采用TRIzol法提取總RNA。應(yīng)用GoTaq 2-Step RT-qPCR System(Promega A6010)試劑盒進行第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)測序結(jié)果合成水稻干尖線蟲類硫氧還蛋白基因Q-PCR驗證引物組，

Ab-Trxl-qF：5`-TGA CCG ATG AAG CAA ATA CCA-3`，

Ab-Trxl-qR：5`-TCG ACG AGC TCA ACA CTT AC-3`。

水稻干尖線蟲28s RNA作為內(nèi)參基因，

Ab-28s-qF：5`-TAC GAT CGG TGT TCG TTG C-3`，

Ab-28s-qR：5`-CTC ACA TCG TCG ACA TCC AA-3`。

應(yīng)用Stratagene Mx3000P qPCR system(Agilent,USA)和GoTaq 2-Step RT-qPCR System試劑盒進行Q-PCR擴增。使用2步法PCR，第一步：預(yù)變性95℃3min。第二步：95℃30s，58℃1min，72℃30s共40個循環(huán)。融解曲線測定從55℃到95℃。對Q-PCR擴增采用相對定量法計算次重復(fù)試驗初始模板量比值，兩配對樣本t檢驗p<0.01，差異顯著。結(jié)果如圖1所示，Ab-Trxl在高滲透壓脅迫后4h、12h、24h、48h、72h和96h時均有顯著上調(diào)，證實Ab-Trxl在高滲透壓脅迫中起到一定作用。

(四)Ab-Trxl基因沉默

以水稻干尖線蟲cDNA為模板，應(yīng)用引物組：

Ab-Trxl-T7F：5`-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACA AGT GCA TTT TGG AGC G-3`，

Ab-Trxl-iR：5`-ACA AAC GAT TTG ATG TCC GC-3`

進行PCR擴增生產(chǎn)正義鏈模板。

應(yīng)用引物組：

Ab-Trxl-iF：5`-AAC AAG TGC ATT TTG GAG CG-3`，

Ab-Trxl-T7R：5`-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG ACA AAC GAT TTG ATG TCC GC-3`

進行PCR擴增生產(chǎn)反義鏈模板。應(yīng)用RNAi試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成正義鏈與反義鏈RNA，經(jīng)退火生產(chǎn)dsRNA。

蒸餾水稀釋dsRNA濃度至3mg/mL，采用dsRNA喂飼法處理線蟲12h，以蒸餾水為對照。處理后一部分線蟲用于提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用引物Ab-Trxl-qF和Ab-Trxl-qR進行Q-PCR擴增，應(yīng)用水稻干尖線蟲28s rRNA基因引物Ab-28s-qF和Ab-28s-qR進行Q-PCR擴增作為對照，驗證RNAi效果。結(jié)果如圖2所示，RNAi后Ab-Trxl表達量顯著下降。另一部分線蟲用于高滲透壓處理1d～6d后線蟲存活數(shù)測定，每個處理隨機選取100條蟲進行觀察，重復(fù)三次。結(jié)果如圖3所示，水稻干尖線蟲存活數(shù)顯著下降。說明水稻干尖線蟲類硫氧還蛋白基因沉默，對該線蟲抗高滲透壓能力起到顯著影響，可用于該線蟲病害防治。

<110> 東北林業(yè)大學

<120> 用于防治水稻干尖線蟲的類硫氧還蛋白基因及引物和應(yīng)用

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<210> 1

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<212> DNA

<213> Ab-Trxl

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gtaaaagtaa cgatcagtgt gaagatgtct gaatcgcgtt caaatcacga atcagatctc 60

aaaagtttgc gttttcaaac acgttctaaa gtggttgtga aagcggccga agttccagaa 120

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<212> DNA

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