聚吡咯?殼聚糖復(fù)合導(dǎo)電薄膜的制備方法與流程

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及一種熒光成像的膜材。

背景技術(shù)：

復(fù)合材料目前主要是指復(fù)合型導(dǎo)電高分子材料，是將聚合物與各種導(dǎo)電物質(zhì)通過(guò)一定的復(fù)合方式構(gòu)成。長(zhǎng)期以來(lái)，高分子材料通常是作為絕緣材料被應(yīng)用。然而，在用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的復(fù)合材料中，尤其是在細(xì)胞學(xué)方面研究中所用到的復(fù)合材料往往需要材料本身具有一定的導(dǎo)電性。眾所周知，生物電是生命功能的本質(zhì)，也是人體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，人體的任何一種生命活動(dòng)無(wú)不和生物電密切相關(guān)。然而，細(xì)胞作為生物體的基本單位，也是生物電的基本單位，因此，在細(xì)胞水平上研究與生物電相關(guān)的復(fù)合材料，在一定程度上，就需要復(fù)合材料具有一定的導(dǎo)電性。熒光成像即熒光物質(zhì)被特定外界能量激發(fā)，引起其電子向高能軌道躍遷，并最終釋放能量回歸基態(tài)的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生可被檢測(cè)的熒光信號(hào)。熒光成像技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，是觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命的有力工具。常將熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)與熒光顯微技術(shù)結(jié)合起來(lái)，定時(shí)、定量、定位地觀測(cè)活細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶活性變化?；罴?xì)胞中核酸的定位信息采集及定量檢測(cè)與活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的顯微熒光成像分析也是熒光成像技術(shù)的應(yīng)用。

殼聚糖是甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，屬于半合成有機(jī)高分子，是甲殼素最基本、最重要的衍生物。殼聚糖具有良好的生物相容性、可降解性、價(jià)格低廉、來(lái)源豐富、且為可再生資源，是生物醫(yī)學(xué)研究中非常重要的天然生物高分子材料。傳統(tǒng)導(dǎo)電材料一般呈黑色，厚度較厚，透光性差，不能用于細(xì)胞熒光成像實(shí)驗(yàn)。

現(xiàn)有技術(shù)中，有人提供了一種殼聚糖基復(fù)合材料的制備方法，其方法中先用醋酸溶解殼聚糖，再采用氫氧化鈉作為凝固液，干燥得殼聚糖材料，再將殼聚糖材料浸泡吡咯中，最后在氧化劑中氧化。按照以上方法制備殼聚糖基復(fù)合材料薄膜，由于采用氫氧化鈉作為凝固液，殼聚糖干燥后呈粒狀，后續(xù)浸泡吡咯時(shí)，與吡咯不能充分混勻，最終得到的成品中含有殼聚糖中心顆粒，在其表面包覆有一層聚吡咯，由于殼聚糖被包覆，這種薄膜的生物相容性很差，并不能作為細(xì)胞生長(zhǎng)的理想載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種可用于細(xì)胞熒光成像的聚吡咯-殼聚糖復(fù)合導(dǎo)電薄膜的制備方法。

技術(shù)方案如下：

一種聚吡咯-殼聚糖復(fù)合導(dǎo)電薄膜的制備方法，其關(guān)鍵在于包括以下步驟：

步驟一、配制殼聚糖的醋酸溶液；

步驟二、在避光條件下，按質(zhì)量比M(吡咯)：M(殼聚糖)＝1：4-6的比例，向殼聚糖的醋酸溶液中加入吡咯，得吡咯-殼聚糖溶液；

步驟三、按摩爾比n(吡咯)：n(無(wú)水氯化鐵)＝1：3-5的比例，向所述吡咯-殼聚糖溶液中加入無(wú)水氯化鐵；

步驟四、制膜。

作為優(yōu)選，上述步驟一中，所述殼聚糖的醋酸溶液的配置方法為：首先配置1％的醋酸水溶液，再用該醋酸水溶液配置2％的殼聚糖的醋酸溶液，最后將該殼聚糖的醋酸溶液于50℃攪拌直至溶解。

上述步驟二中，在所述殼聚糖的醋酸溶液冷卻至室溫后，再向所述殼聚糖的醋酸溶液中加入所述吡咯，攪拌1.5-3h。

上述步驟三中，加入無(wú)水氯化鐵后，攪拌20-30h，氧化得到成膜液。

上述步驟四中，取所述成膜液，滴加在帶有玻璃片的培養(yǎng)皿中，將所述培養(yǎng)皿放在勻膠機(jī)中制膜。

上述步驟二中，所述吡咯和殼聚糖的質(zhì)量比為1：5。

上述步驟三中，所述吡咯和無(wú)水氯化鐵的摩爾比為1：4。

上述步驟三中，將所述無(wú)水氯化鐵用1％的所述醋酸水溶液溶解后，再加入所述吡咯-殼聚糖溶液。

附圖說(shuō)明

圖1為過(guò)夜培養(yǎng)(≥10h)后，用熒光標(biāo)記的活細(xì)胞的狀態(tài)圖；

圖2為過(guò)夜培養(yǎng)(≥10h)后，未進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞狀態(tài)圖；

圖3為放大1000倍的電鏡圖；

圖4為放大5000倍的電鏡圖。

具體實(shí)施方式

一、下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：

一種聚吡咯-殼聚糖復(fù)合導(dǎo)電薄膜的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、按以下方法配制殼聚糖的醋酸溶液；

首先配置1％的醋酸水溶液，再用該醋酸水溶液配置2％的殼聚糖的醋酸溶液，最后將該殼聚糖的醋酸溶液于50℃，用磁力攪拌器攪拌直至溶解。

步驟二、在所述殼聚糖的醋酸溶液冷卻至室溫后，在避光條件下，按質(zhì)量比M(吡咯)：M(殼聚糖)＝1：4的比例，向殼聚糖的醋酸溶液中加入吡咯，攪拌1.5h，得吡咯-殼聚糖溶液。

步驟三、按摩爾比n(吡咯)：n(無(wú)水氯化鐵)＝1：3的比例，向所述吡咯-殼聚糖溶液中加入無(wú)水氯化鐵攪拌20h，氧化得到成膜液。

步驟四、取所述成膜液，滴加在帶有玻璃片的培養(yǎng)皿中，將所述培養(yǎng)皿放在勻膠機(jī)中制膜。

實(shí)施例2：

一種聚吡咯-殼聚糖復(fù)合導(dǎo)電薄膜的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、按以下方法配制殼聚糖的醋酸溶液；

首先配置1％的醋酸水溶液，再用該醋酸水溶液配置2％的殼聚糖的醋酸溶液，最后將該殼聚糖的醋酸溶液于50℃，用磁力攪拌器攪拌直至溶解。

步驟二、在所述殼聚糖的醋酸溶液冷卻至室溫后，在避光條件下，按質(zhì)量比M(吡咯)：M(殼聚糖)＝1：5的比例，向殼聚糖的醋酸溶液中加入吡咯，攪拌2h，得吡咯-殼聚糖溶液。

步驟三、按摩爾比n(吡咯)：n(無(wú)水氯化鐵)＝1：4的比例，向所述吡咯-殼聚糖溶液中加入無(wú)水氯化鐵攪拌24h，氧化得到成膜液。

步驟四、取所述成膜液，滴加在帶有玻璃片的培養(yǎng)皿中，將所述培養(yǎng)皿放在勻膠機(jī)中制膜。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例與實(shí)施例1和實(shí)施例2的不同在于：

所述步驟二中，按質(zhì)量比M(吡咯)：M(殼聚糖)＝1：6的比例，向殼聚糖的醋酸溶液中加入吡咯，攪拌3h，得吡咯-殼聚糖溶液。

所述步驟三中，按摩爾比n(吡咯)：n(無(wú)水氯化鐵)＝1：5的比例，向所述吡咯-殼聚糖溶液中加入無(wú)水氯化鐵攪拌30h，氧化得到成膜液。

實(shí)施例4：

一種聚吡咯-殼聚糖復(fù)合導(dǎo)電薄膜的制備方法，包括以下步驟：

首先，配置1％的醋酸水溶液；

其次，在錐形瓶中，取15ml，1％的醋酸水溶液溶解0.4g殼聚糖，于溫度為50℃的條件下，用磁力攪拌器攪拌，直至溶解，冷卻至室溫；

再次，在避光條件下，向錐形瓶中加入83ul，密度為0.96g/ml的吡咯，攪拌2h；

最后，取5ml，1％的所述醋酸水溶液充分溶解0.78g無(wú)水氯化鐵，將氯化鐵溶液逐滴加入錐形瓶中，

保持?jǐn)嚢?4h，得到成膜液。

步驟四、取所述成膜液，滴加在帶有玻璃片的培養(yǎng)皿中，將所述培養(yǎng)皿放在勻膠機(jī)中制膜。

勻膠機(jī)制膜工藝如下：

吸取少量的溶液，滴加在帶有玻璃片的培養(yǎng)皿中，將整個(gè)培養(yǎng)皿放在勻膠機(jī)內(nèi)，設(shè)置t1＝9s，t2＝30s；v＝200r/s，v2＝3200r/s，抽真空操作時(shí)間約為半分鐘，結(jié)束后按下開(kāi)始按鈕，液體將均勻地展開(kāi)形成一張薄膜。該操作可以通過(guò)調(diào)整液體的用量、勻膠機(jī)的時(shí)間及轉(zhuǎn)速等實(shí)驗(yàn)變量來(lái)控制膜的厚度，實(shí)驗(yàn)要求膜的厚度盡可能地薄，薄膜在室溫(25℃～30℃)條件下自然干燥過(guò)夜。使用前用無(wú)水乙醇和去離子水交替清洗3次，每次浸泡5分鐘，得到試驗(yàn)導(dǎo)電薄膜，即可用于細(xì)胞培養(yǎng)。

二、下面結(jié)合試驗(yàn)和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

對(duì)實(shí)施例4得到的試驗(yàn)導(dǎo)電薄膜進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如下：

2.1電導(dǎo)率的測(cè)定，采用四探針?lè)y(cè)得試驗(yàn)導(dǎo)電薄膜的電導(dǎo)率為0.51mS/cm。說(shuō)明試驗(yàn)導(dǎo)電薄膜具有良好的導(dǎo)電性。

2.2生物相容性測(cè)定，以試驗(yàn)導(dǎo)電薄膜作為細(xì)胞生長(zhǎng)的載體，隔夜(＞10h)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞狀態(tài)，結(jié)果如圖1和圖2所示；

圖1為過(guò)夜培養(yǎng)后，用熒光標(biāo)記的活細(xì)胞的狀態(tài)圖；

圖2為過(guò)夜培養(yǎng)后，未進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞狀態(tài)圖；

圖1中，白色透光區(qū)域及其周圍的輪廓即為活細(xì)胞；

圖2中，深色線條及其圍成的區(qū)域即為活細(xì)胞。

從圖1和圖2可以看出，細(xì)胞在試驗(yàn)導(dǎo)電薄膜上生長(zhǎng)情況良好，較長(zhǎng)時(shí)間之后，細(xì)胞仍有較高的存活率，說(shuō)明試驗(yàn)導(dǎo)電薄膜具有良好的生物相容性。

2.3電鏡觀察試驗(yàn)導(dǎo)電薄膜的表面狀態(tài)，圖3為放大1000倍時(shí)電鏡圖，圖4為放大5000倍時(shí)電鏡圖。

從圖3和圖4可以看出，試驗(yàn)導(dǎo)電薄膜表面均勻，平整。

有益效果：采用本發(fā)明方法制備的導(dǎo)電復(fù)合膜不僅給熒光分子制造了良好的微環(huán)境使其不易影響熒光壽命，且具有較好的延展性和透明度。作為熒光成像技術(shù)的載體達(dá)到無(wú)毒、無(wú)刺激性、免疫抗原性小、良好的生物相容性等基本標(biāo)準(zhǔn)。此外，本發(fā)明對(duì)熒光成像技術(shù)中的受體蛋白對(duì)熒光物質(zhì)的量子效率有所提高。制備簡(jiǎn)單，原料廉價(jià)，具有良好的生物活性和導(dǎo)電性。將其作為帶有熒光的細(xì)胞的生長(zhǎng)載體，實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞得以存活且觀察到細(xì)胞體內(nèi)的熒光有連續(xù)的變化現(xiàn)象。

最后需要說(shuō)明的是，上述描述僅僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不違背本發(fā)明宗旨及權(quán)利要求的前提下，可以做出多種類似的表示，這樣的變換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。