基因甲基化檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及基因的甲基化檢測(cè)。

背景技術(shù)：

本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種能夠提高基因甲基化檢測(cè)靈敏度的方法及其試劑盒。DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它是腫瘤發(fā)生的一個(gè)早期事件，由于CPG島的高度甲基化早于腫瘤增生，故檢測(cè)某些DNA位點(diǎn)的甲基化可以作為腫瘤標(biāo)志物，是腫瘤早期輔助診斷、患病預(yù)測(cè)及療效評(píng)估的一個(gè)潛在指標(biāo)。DNA甲基化分析通常需要對(duì)DNA進(jìn)行高溫硫化轉(zhuǎn)化修飾。高溫硫化轉(zhuǎn)化后，雙鏈DNA會(huì)解離成兩條不互補(bǔ)的單鏈。目前在現(xiàn)有的甲基化檢測(cè)技術(shù)中還沒有同時(shí)檢測(cè)同一基因兩條單鏈的甲基化總體水平的先例，現(xiàn)有的基因甲基化檢測(cè)技術(shù)都是針對(duì)一條單鏈進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而檢測(cè)基因甲基化情況。在某類腫瘤檢測(cè)中，DNA甲基化的程度不是很明顯，單鏈檢測(cè)基因甲基化的靈敏度較低，必須采用定量法才可確定基因甲基化的程度，進(jìn)而區(qū)分癌與非癌。定量法分析較為麻煩復(fù)雜，遠(yuǎn)不如定性法分析簡(jiǎn)單。單鏈檢測(cè)基因甲基化沒有充分考慮基因兩條鏈甲基化的總體水平。例如申請(qǐng)?zhí)枮?01610264899.7《一種人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法》。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明其中一個(gè)目的在于提高基因甲基化檢測(cè)靈敏度，能夠充分檢測(cè)基因兩條鏈的甲基化總水平。以內(nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)衡量本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性和有效性。

本發(fā)明提供了一種基因甲基化檢測(cè)方法，該方法首先針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)目的基因甲基化正義鏈的引物對(duì)和目的基因甲基化反義鏈的引物對(duì)，以及設(shè)計(jì)檢測(cè)目的基因甲基化的正、反義鏈的兩條探針，目的基因甲基化正義鏈的引物對(duì)為目的基因甲基化正義鏈的正向引物和目的基因甲基化正義鏈的反向引物，目的基因甲基化反義鏈的引物對(duì)為目的基因甲基化反義鏈的正向引物和目的基因甲基化反義鏈的反向引物，目的基因甲基化的正、反義鏈的兩條探針分別為目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針。由于該方法考慮基因兩條鏈甲基化的情況設(shè)計(jì)相關(guān)引物和探針，使用設(shè)計(jì)的引物和探針可以檢測(cè)目的基因甲基化的整體水平。以內(nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)衡量本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性和有效性。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)方法，目的基因?yàn)閟eptin9基因，所述septin9甲基化位點(diǎn)為啟動(dòng)子區(qū)的CpG島，序列為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-670～-555bp區(qū)；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)方法，

目的基因septin9甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’

目的基因septin9甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’

目的基因septin9甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’

目的基因septin9甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)方法，

目的基因septin9甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’

目的基因septin9甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)方法，目的基因septin9甲基化正義鏈探針、目的基因septin9甲基化反義鏈探針5'端報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，目的基因septin9甲基化正義鏈探針、目的基因septin9甲基化反義鏈探針3'端的猝滅基團(tuán)為BHQ1。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)方法，使用內(nèi)參基因甲基化的引物對(duì)和內(nèi)參基因甲基化探針，內(nèi)參基因?yàn)锳CTB，

內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

內(nèi)參基因甲基化探針序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)方法，方法步驟為：

A、從待測(cè)樣本中提取DNA，

B、對(duì)提取的DNA進(jìn)行硫化轉(zhuǎn)化修飾，

C、對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行純化，得到樣本模板，

D、將所述目的基因甲基化正義鏈的正向引物、目的基因甲基化正義鏈的反向引物、目的基因甲基化反義鏈的正向引物序、所述目的基因甲基化反義鏈的反向引物、目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針、內(nèi)參基因甲基化的引物對(duì)和內(nèi)參基因甲基化探針以及所述樣本模板同時(shí)加到同一孔中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，

E、計(jì)算目的基因正、反義雙鏈熒光累積法中septin9基因CP值；以內(nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)衡量本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性和有效性。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)方法，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的終濃度組成為：1～10×PCR緩沖液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM目的基因甲基化正義鏈的引物對(duì)、0.1～1uM目的基因甲基化反義鏈的引物對(duì)、0.05～2ng/ul模板DNA、0.1～1uM目的基因甲基化正義鏈探針、0.1～1uM目的基因甲基化反義鏈探針、0.01～0.10U/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化鎂，0.1～1uM內(nèi)參基因甲基化引物對(duì)，0.1～1uM內(nèi)參基因甲基化探針。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)方法，目的基因?yàn)镠OXA9基因，

目的基因HOXA9甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.10：

5’-TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-3’

目的基因HOXA9甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.11：

5’-AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG-3’

目的基因HOXA9甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.12：

5’-CGTTCGCGTTTTTATTGGTC-3’

目的基因HOXA9甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.13：

5’-CGAACCATTAATAACGTACGAA-3’

目的基因HOXA9甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.14：

5’-AAATTACCGACGCCCGCG-3’

目的基因HOXA9甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.15：

5’-AAACGAACACGTAACGCG-3’；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種直腸癌檢測(cè)方法，使用上述的基因甲基化檢測(cè)方法檢測(cè)目的基因甲基化程度判斷是否患有直腸癌；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)試劑盒，包含目的基因甲基化正義鏈的正向引物、目的基因甲基化正義鏈的反向引物、目的基因甲基化反義鏈的正向引物、目的基因甲基化反義鏈的反向引物、目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)試劑盒，

目的基因甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’，

所述目的基因甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’，

所述目的基因甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’，

所述目的基因甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’，

所述目的基因甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’，

所述目的基因甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’，上述的目的基因?yàn)閟eptin9。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)試劑盒，

目的基因甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.10：

5’-TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-3’

目的基因甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.11：

5’-AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG-3’

目的基因甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.12：

5’-CGTTCGCGTTTTTATTGGTC-3’

目的基因甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.13：

5’-CGAACCATTAATAACGTACGAA-3’

目的基因甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.14：

5’-AAATTACCGACGCCCGCG-3’

目的基因甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.15：

5’-AAACGAACACGTAACGCG-3’，上述的目的基因?yàn)镠OXA9。

根據(jù)本發(fā)明的一些方面，還提供了一類基因甲基化檢測(cè)試劑盒，目的基因甲基化正義鏈探針、目的基因甲基化反義鏈探針5'端報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，目的基因甲基化正義鏈探針、目的基因甲基化反義鏈探針3'端的猝滅基團(tuán)為BHQ1；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含內(nèi)參基因甲基化的引物對(duì)和內(nèi)參基因甲基化探針，所述內(nèi)參基因?yàn)锳CTB，

內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

所述內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

所述內(nèi)參基因甲基化探針序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，基因甲基化檢測(cè)試劑盒用于直腸癌檢測(cè)。

本發(fā)明的整體思路如下：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可以提高基因甲基化檢測(cè)靈敏度的方法，該檢測(cè)方法充分利用基因甲基化的兩條鏈，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)且檢測(cè)靈敏度高。

本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：利用雙鏈檢測(cè)提高基因甲基化檢測(cè)的靈敏度，本發(fā)明的方法中包含目的基因甲基化正義鏈的引物對(duì)和目的基因甲基化反義鏈的引物對(duì)，作為衡量標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)參基因ACTB甲基化的通用引物對(duì)和探針，以及檢測(cè)目的基因甲基化的正、反義鏈的兩條探針。

本發(fā)明的一個(gè)目的基因?yàn)閟eptin9基因；septin9甲基化位點(diǎn)為啟動(dòng)子區(qū)的CpG島，序列為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-670～-555bp區(qū)。針對(duì)該位點(diǎn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的目的基因甲基化正、反義鏈的引物對(duì)序列如下所示。

目的基因甲基化正義鏈的正向引物：5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’；

目的基因甲基化正義鏈的反向引物：5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’；

目的基因甲基化反義鏈的正向引物：5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’；

目的基因甲基化反義鏈的反向引物：5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

本發(fā)明的septin9甲基化基因的正、反義鏈探針5'端報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，septin9甲基化基因的正、反義鏈探針3'端的猝滅基團(tuán)為BHQ1。針對(duì)septin9甲基化位點(diǎn)設(shè)計(jì)的檢測(cè)目的基因甲基化正、反義鏈的兩個(gè)探針序列如下所示。

目的基因甲基化正義鏈探針序列：5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’；

目的基因甲基化反義鏈探針序列：5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’；

本發(fā)明的內(nèi)參ACTB甲基化基因的引物對(duì)和探針，序列如下：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’

本發(fā)明所述的方法還包括其他PCR擴(kuò)增的常規(guī)試劑，主要包括：DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、PCR buffer等。所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的終濃度組成為：1～10×PCR緩沖液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM septin9甲基化正義鏈引物對(duì)、0.1～1uM septin9甲基化反義鏈引物對(duì)、0.1～1uM ACTB甲基化通用引物對(duì)、0.05～2ng/ul模板DNA、0.1～1uM septin9甲基化正義鏈探針、0.1～1uM septin9甲基化反義鏈探針、0.1～1uM ACTB甲基化通用探針、0.01～0.10U/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化鎂。

本發(fā)明的一種檢測(cè)步驟如下：

(1)從待測(cè)樣本中提取DNA。

(2)將提取后的DNA進(jìn)行硫化轉(zhuǎn)化修飾。

(3)對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行純化，得到樣本模板。

(4)對(duì)樣本模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性20分鐘，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段，95℃變性20s，56℃退火35s，并進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。

(5)比對(duì)正、反義雙鏈熒光累積法中septin9基因CP值和單用一條鏈檢測(cè)septin9基因的CP值，或者比對(duì)雙鏈檢測(cè)法和單鏈檢測(cè)法中腸癌樣本septin9基因甲基化的陽(yáng)性檢出率判斷兩種檢測(cè)方法樣本模板中甲基化的檢測(cè)程度。以內(nèi)參基因ACTB的擴(kuò)增曲線和CP值判斷實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和有效性。

本發(fā)明使用的DNA提取試劑和DNA硫化轉(zhuǎn)化試劑均為蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥有限公司自主生產(chǎn)的試劑，提取及硫化試劑對(duì)外銷售。

本發(fā)明首次使用同一基因的兩條鏈，即正、反義鏈甲基化熒光累積方法提高基因甲基化檢測(cè)靈敏度。與現(xiàn)有的甲基化檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明中的利用雙鏈檢測(cè)基因甲基化程度的方法具有較高的基因甲基化檢測(cè)靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明方法充分利用DNA的兩條鏈，增加熒光信號(hào)值，使甲基化熒光雙重累積，提高基因甲基化的檢測(cè)靈敏度，能在(95％)非甲基化DNA存在的背景下檢測(cè)到目的基因的甲基化，即甲基化DNA含量?jī)H為5％時(shí)本發(fā)明的方法也能準(zhǔn)確檢出。本發(fā)明方法采用定性法即可區(qū)分甲基化程度高低，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Cp值即可區(qū)分甲基化程度高低。除此之外，本發(fā)明的利用雙鏈檢測(cè)提高基因甲基化檢測(cè)靈敏度的方法還具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)檢測(cè)過(guò)程為閉管同孔反應(yīng)，即在一個(gè)孔中可同時(shí)檢測(cè)到兩條鏈的甲基化情況，操作簡(jiǎn)單快速，減少污染的可能性；(2)雙重反應(yīng)：目的基因與內(nèi)參基因處于不同的熒光通道，通過(guò)內(nèi)參基因可對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和有效性進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)估。(3)安全，整個(gè)體系不包含有毒有害物質(zhì)，無(wú)需PCR產(chǎn)物的開管，對(duì)試驗(yàn)人員以及環(huán)境都無(wú)危害。

本發(fā)明根據(jù)該雙鏈檢測(cè)法發(fā)明了相關(guān)的試劑盒，同時(shí)優(yōu)化了PCR擴(kuò)增條件，進(jìn)一步提高了擴(kuò)增反應(yīng)效率。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說(shuō)明：

圖1為本發(fā)明的原理示意圖；

圖2為在1例腸癌血漿樣本中使用本發(fā)明和常規(guī)方法的對(duì)比結(jié)果圖；

圖3為使用本發(fā)明檢測(cè)甲基化靈敏度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖4為使用本發(fā)明檢測(cè)1例肺癌血漿樣本(三個(gè)復(fù)孔)的檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

實(shí)施例1

下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

材料：待檢血漿樣本、濃度為2ng/ul的甲基化陽(yáng)性DNA、濃度為2ng/ul的甲基化陰性DNA。

儀器：Lightcycler 480、旋轉(zhuǎn)混勻器、水浴鍋、漩渦震蕩儀、冰箱。

試劑：DNA聚合酶(羅氏公司)、10×PCR Buffer(羅氏公司)、MgCl₂(羅氏公司)、dNTP(TaKaRa)、純化水。

引物和探針：所有引物的純度應(yīng)達(dá)到電泳級(jí)(PAGE)或HPLC級(jí)，不含雜帶。所有探針5'端報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，3'端的猝滅基團(tuán)為BHQ1。所有引物和探針的序列由本發(fā)明研究人員自主設(shè)計(jì)，然后由供應(yīng)商提供，濃度為10μmol/L備用。

septin9甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’

septin9甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’

septin9甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’

septin9甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

septin9甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’

septin9甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。

使用內(nèi)參基因甲基化的引物對(duì)和內(nèi)參基因甲基化探針，內(nèi)參基因?yàn)锳CTB，

內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

內(nèi)參基因甲基化探針序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。

對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行處理，所述待測(cè)樣本為正常人血漿或腸癌血漿。

A.從待測(cè)樣本中提取DNA(蘇州為真公司)。

B.對(duì)提取的DNA進(jìn)行硫化轉(zhuǎn)化修飾(蘇州為真公司)。

C.對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行純化，得到樣本模板。

將自主設(shè)計(jì)的septin9正義鏈引物對(duì)和正義鏈探針、反義鏈引物對(duì)和反義鏈探針以及DNA模板、內(nèi)參基因甲基化的引物對(duì)和內(nèi)參基因甲基化探針同時(shí)加到同一孔中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

PCR反應(yīng)體系和條件

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的終濃度組成為：1×PCR緩沖液、0.25mM dNTPs、350nM septin9甲基化正義鏈引物對(duì)、350nM septin9甲基化反義鏈引物對(duì)、0.05ng/ul模板DNA、70nM septin9甲基化正義鏈探針、70nM septin9甲基化反義鏈探針、1.5U TaqDNA聚合酶、2.5mM氯化鎂。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)的具體過(guò)程為：95℃預(yù)變性20分鐘，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段，95℃變性20s，56℃退火35s，并進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。若有擴(kuò)增信號(hào)，且呈S型擴(kuò)增曲線，則為陽(yáng)性樣本，說(shuō)明有甲基化出現(xiàn)；若無(wú)擴(kuò)增曲線升起，說(shuō)明為陰性樣本，即未發(fā)生甲基化。擴(kuò)增的Cp值小于等于40時(shí)，結(jié)果為有效值。

收集北京協(xié)和醫(yī)院結(jié)直腸癌血漿87例，健康人血漿107例。用上述雙鏈檢測(cè)法對(duì)血漿樣本進(jìn)行septin9基因甲基化檢測(cè)，以QIAGEN公司的血漿游離DNA提取、硫化純化試劑盒的單鏈檢測(cè)法檢測(cè)septin9基因甲基化作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果，所有血漿樣本的內(nèi)參基因ACTB均有擴(kuò)增且Cp值均小于40，證明該實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確有效。觀察目的基因通道，87例結(jié)直腸癌血漿樣本，雙鏈檢測(cè)法檢出陽(yáng)性的為67例，陽(yáng)性符合率為77.01％；單鏈檢測(cè)法檢出的陽(yáng)性為59例，陽(yáng)性符合率為67.82％。對(duì)陰性樣本進(jìn)行分析，107例健康人血漿樣本，雙鏈檢測(cè)法中9例檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陰性符合率為91.59％；單鏈檢測(cè)法中4例檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陰性符合率為96.26％。圖2為其中1例腸癌血漿樣本的兩種檢測(cè)方法的對(duì)比結(jié)果，如圖所示，雙鏈檢測(cè)法檢出的septin9基因甲基化的Cp值(曲線1)為29.71，熒光值為33左右；單鏈檢測(cè)法檢出的septin9基因甲基化的Cp值(曲線2)為33.37，熒光值為18左右。由此可見，雙鏈檢測(cè)法比單鏈檢測(cè)法檢出的septin9基因甲基化的Cp值高1-2個(gè)，且雙鏈檢測(cè)法檢出的熒光值也是單鏈檢測(cè)法檢出的2倍。

將甲基化陽(yáng)性DNA和甲基化陰性DNA稀釋成相同濃度，即2ng/ul，分別在95％、85％、50％、30％的非甲基化DNA存在的背景下，用雙鏈檢測(cè)法檢測(cè)含量為5％、15％、50％、70％的甲基化DNA，所有檢測(cè)樣本的內(nèi)參基因ACTB均有擴(kuò)增且Cp值均小于40，證明該實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確有效。進(jìn)而觀察目的基因通道，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，曲線1為甲基化含量為70％的擴(kuò)增曲線，CP值為23.90；曲線2為甲基化含量為50％的擴(kuò)增曲線，CP值為25.23；曲線3為甲基化含量為15％的擴(kuò)增曲線，CP值為26.71；曲線4為甲基化含量為5％的擴(kuò)增曲線，CP值為27.28，根據(jù)結(jié)果可得，雙鏈檢測(cè)法能在(95％)非甲基化DNA存在的背景下檢測(cè)到目的基因的甲基化，可大大的提高甲基化檢測(cè)靈敏度。

當(dāng)基因甲基化程度不高，樣本中目的基因甲基化的Cp值超過(guò)40時(shí)，單鏈檢測(cè)法定義為陰性，而此時(shí)雙鏈檢測(cè)法可充分利用兩條鏈，累積甲基化熒光，增加甲基化的檢出，從而提高目的基因甲基化的靈敏度和甲基化陽(yáng)性檢出率。

實(shí)施例2

發(fā)明人還做了HOXA9基因甲基化的雙鏈檢測(cè)。

正義鏈的探針：AAATTACCGACGCCCGCG

正義鏈的正向引物：TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG

正義鏈的反向引物：AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG

反義鏈的探針：AAACGAACACGTAACGCG

反義鏈的正向引物：CGTTCGCGTTTTTATTGGTC

反義鏈的反向引物：CGAACCATTAATAACGTACGAA

檢測(cè)20例肺癌血漿樣本和13例健康人血漿樣本。用上述雙鏈檢測(cè)法對(duì)血漿樣本進(jìn)行HOXA9基因甲基化檢測(cè)。所有血漿樣本的內(nèi)參基因ACTB均有擴(kuò)增且Cp值均小于40，證明該實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確有效。觀察目的基因通道，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果，所有血漿樣本的內(nèi)參基因ACTB均有擴(kuò)增且Cp值均小于40，證明該實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確有效。觀察目的基因通道，20例肺癌血漿樣本，雙鏈檢測(cè)法檢出陽(yáng)性的為15例，陽(yáng)性符合率為75％；對(duì)陰性樣本進(jìn)行分析，13例健康人血漿樣本，雙鏈檢測(cè)法中1例檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陰性符合率為92.31％。圖4為其中1例肺癌血漿樣本(三個(gè)復(fù)孔)的檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果圖。由此可見，雙鏈檢測(cè)法不僅適用于septin9基因甲基化的檢測(cè)，對(duì)肺癌標(biāo)志物HOXA9基因的甲基化檢測(cè)也有較高的檢出靈敏度和特異性。

<110> 江蘇為真生物醫(yī)藥技術(shù)股份有限公司

<120> 基因甲基化檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用

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