可視化MTHFR等位基因分型檢測試劑盒的制作方法

本發(fā)明屬于分子生物技術和基因檢測領域，具體是一種MTHFR等位基因(rs1801133和rs1801131)分型檢測試劑盒。

背景技術：

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是甲硫氨酸-葉酸代謝系統(tǒng)中的關鍵酶，維持葉酸正常代謝。MTHFR等位基因位點rs1801133和rs1801131(c.677和c.1298位點)突變可導致其編碼的葉酸代謝關鍵酶活性降低，引起葉酸代謝障礙，造成葉酸水平降低及高同型半胱氨酸血癥。對于MTHFR基因異常的人，MTHFR酶活性明顯降低，造成葉酸代謝障礙，導致新生兒神經管缺陷、唐氏綜合癥及唇腭裂等疾病的發(fā)病風險明顯增高，這類人需要補充更多的葉酸才能達到預期的效果。

另外，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)還參與同型半胱氨酸代謝過程，維持體內正常的同型半胱氨酸水平。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因c.677位點發(fā)生突變，會導致MTHFR的不穩(wěn)定，致使酶活力的下降，最終致使血漿同型半胱氨酸水平的升高。同型半胱氨酸血癥有引起動脈粥樣硬化和血栓形成的危險，并最終可引起冠心病、腦梗死和外周血管病。中國人群中MTHFR C677T突變率高達25％，是中國H型高血壓與腦卒中高發(fā)的重要遺傳因素，因此，檢測MTHFR基因c.677位點還具有預測攜帶者患高血壓、腦卒中等疾病的作用。

目前市場上已有的MTHFR等位基因分型檢測試劑盒基本都是基于熒光信號檢測的PCR擴增技術，需要用到實時熒光PCR設備，其價格較為昂貴，不利于在設施條件差的醫(yī)療單位使用。而同時臨床中，至今為止尚未有能夠直接采用普通PCR循環(huán)儀器就能夠實現(xiàn)可視化分型MTHFR等位基因的閉管方法。

技術實現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的為提供一種對設施條件要求低、結果判讀簡單、成本低廉的新型MTHFR等位基因分型檢測試劑盒,可實現(xiàn)分別針對MTHFR等位基因SNP位點位點1(rs1801133)野生型(P1)、位點1(rs1801133)突變型(P2)、位點2(rs1801131)野生型(P3)和位點2(rs1801131)突變型(P4)的分型檢測。

實現(xiàn)上述目的的技術方案如下。

一種可視化MTHFR等位基因分型檢測試劑盒，包括有4條引物，7條常規(guī)探針、以及2條與納米金顆粒連接的探針；

所述4條引物為：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

所述7條常規(guī)探針分別為SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11，或所述7條常規(guī)探針分別為SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11的反向互補序列；

所述2條與納米金顆粒連接的探針的堿基組成如SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13所示，或SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13的反向互補序列所示。

本發(fā)明利用了基于納米金探針的可視化核酸檢測技術，在將高靈敏的PCR擴增方法、高特異的酶切方法及可視化的納米金探針檢測方法相結合，用于MTHFR等位基因分型的可視化檢測，實現(xiàn)低成本、高靈敏的MTHFR等位基因分型檢測。通過檢測攜帶者基因組DNA中的SNP位點(rs1801133和rs1801131)單核苷酸多態(tài)性位點，判定該攜帶者的MTHFR等位基因類型，并根據(jù)攜帶者的等位基因類型指導攜帶者服用葉酸劑量，或提醒攜帶者患高血壓、腦卒中等疾病的風險，從而起到預警作用，提高攜帶者的生活質量，為臨床和患者提供一種新型檢測方法。

本發(fā)明具有以下有益效果:

采用本發(fā)明中的試劑盒對MTHFR等位基因SNP位點進行分型檢測無需使用熒光探針，試劑存放無需避光，不必擔心熒光衰減的問題，因此存放條件更加穩(wěn)定。

本發(fā)明采用的納米金探針有比較成熟的方法合成，成本低；具備高穩(wěn)定性，能夠耐受強熱循環(huán)和強機械沖擊；具備強適用性，能夠與各種酶反應液共存而不影響反應的正常進行。

利用本發(fā)明中的試劑盒可實現(xiàn)短時間高靈敏度的閉管核酸檢測，能夠有效的避免擴增產物的交叉污染。

本發(fā)明中的試劑盒能夠采用普通PCR儀完成對MTHFR等位基因位點的分型檢測，且結果區(qū)分特征明顯。

附圖說明

下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，不用于限定有權利要求所界定的本發(fā)明范圍。

圖1是本發(fā)明中引物探針設計原理。

圖2是實施例2中檢測反應的靈敏度。

圖3是實施例3中匹配基因型檢測結果。

圖4是實施例4中干擾實驗檢測結果。

圖5是實施例5中代表性樣本檢測結果。

具體實施方式

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發(fā)明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術語“和/或”包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內容的理解更加透徹全面。

實施例1引物探針

根據(jù)MTHFR等位基因SNP位點的分別特異性設計對應的引物和探針，針對該位點分別由一對特異性的引物和探針決定其檢測結果，其引物設計的位置和方法的原理如圖1所示。

所述MTHFR等位基因分型檢測試劑盒，包含4條引物、7條常規(guī)探針、2條納米金修飾探針、反應液、酶液。

引物、探針和納米金探針序列如引物1-引物4、探針1-探針7、納米金探針1-納米金探針2，或為上述序列的互補序列：

引物1：GCT GAC CTG AAG CAC TTG A；SEQ ID NO.1

引物2：GCG GAA GAA TGT GTC AGC C；SEQ ID NO.2

引物3：GGA GGA GCT GCT GAA GAT G；SEQ ID NO.3

引物4：CGG TTT GGT TCT CCC GAG A；SEQ ID NO.4

探針1：CGC GCC GAG GGC TCC CGC A；SEQ ID NO.5

探針2：CGC GCC GAG GAC TCC CGC AGA；SEQ ID NO.6

探針3：GCG TGA TGA TGA AAT CGT；SEQ ID NO.7

探針4：CGC GCC GAG GAA AGT GTC TTT GAA G；SEQ ID NO.8

探針5：CGC GCC GAG GCA AGT GTC TTT GAA GTC；SEQ ID NO.9

探針6：GAG CTG ACC AGT GAA GT；SEQ ID NO.10

探針7：GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT；SEQ ID NO.11

納米金探針1：Au-AAA AAA AAA AGT TCA TGA TCA CGA T；SEQ ID NO.12

納米金探針2：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-Au。SEQ ID NO.13

本實施例所述的試劑盒中，所述的納米金探針中的納米金顆粒的平均尺寸為1nm-200nm，較佳的納米金顆粒平均尺寸為5nm-80nm，本實施例中所用的納米金顆粒平均尺寸為10nm-30nm。上述納米金顆粒市面上能夠購買得到的合格產品即可。

所述的分型檢測試劑盒，所述酶液有兩種酶混合而成，兩種酶分別為擴增酶和內切酶，擴增酶可以是Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶，內切酶可以是TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN。本實施例中所用的擴增酶是Taq DNA聚合酶，內切酶所用的是AfuFEN。

所述MTHFR等位基因分型檢測試劑盒對MTHFR等位基因SNP位點進行分型檢測每例樣本需要4管反應實現(xiàn)結果分型的判讀，分別針對MTHFR等位基因SNP位點位點1(rs1801133)野生型(P1)、位點1(rs1801133)突變型(P2)、位點2(rs1801131)野生型(P3)和位點2(rs1801131)突變型(P4)，其步驟主要有以下三個階段，而這三個階段均是在同管閉管條件下完成的。第一階段：模板擴增，通過引物對、擴增酶的參與，實現(xiàn)對目標模板的高靈敏擴增；第二階段：通過探針和內切酶的參與，實現(xiàn)對目標模板向信號分子的高效率轉化；第三階段：通過納米金探針實現(xiàn)對信號分子的高分辨識別。通過以上三個階段的反應就可以實現(xiàn)在閉管條件下的高靈敏、高分辨、低成本的MTHFR等位基因SNP位點進行分型檢測。

所述的分型檢測試劑盒，所述的檢測結果判別方式可有肉眼直接判讀，反應結束后反應液紅色為陽性，反應液無色為陰性。

實施例2 MTHFR等位基因SNP位點分型檢測靈敏度

本實施例應用實施例1所述的所述MTHFR等位基因分型檢測試劑盒，檢測了不同濃度的MTHFR等位基因SNP位點分型的模板，用來驗證本發(fā)明所陳述的可視化檢測方法的可行性。

反應條件：

該試劑盒每樣本檢測由4管反應構成，分別含有針對四種基因型的引物和探針，各管反應總體積均為20μL。MTHFR等位基因SNP位點檢測反應體系組成為：10mM Tris緩沖液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2；引物3序列：SEQ ID NO.3；引物4序列：SEQ ID NO.4)，1μM探針(探針1序列SEQ ID NO.5；探針2序列：SEQ ID NO.6；探針3序列SEQ ID NO.7；探針4序列：SEQ ID NO.8；探針5序列：SEQ ID NO.9；探針6序列：SEQ ID NO.10；探針7序列：SEQ ID NO.11)，0.1μM納米金探針(探針1：SEQ ID NO.12；探針2：SEQ ID NO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶和內切酶A，0.2mM dNTP。向該體系中分別加入10⁵、10⁴、10³、10²、10、1及0拷貝的待測核酸(模板序列P1為：5’-ATA TTT TAT TTA TAT TTA TAG TTT TAA ATT ACA ACC AGA GCT TGG CAT ATT GTA TCT ATA CCT TTA TTA AAT GCT TTT AAT TTA ATA AAT TAT TGT TTT CTC TTA GAT ATG CAA TAA TTT TCC CAC TAT CAT TGA TTA TTT CCC GGG AAC CCA TAA CAA ATT ACT TAA AAA CCT TGC TTT TAT GGA AAG TGA TAT TTT GGA GAA AGT AAA AGA ACA CCA AGA ATC GAT GGA CAT CAA CAA CCC TCG GGA CTT TAT TGA TTG CTT CCT GAT CAA AAT GGA-3’，SEQ ID NO.14；模板序列P2為：5’-ATA TTT TAT TTA TAT TTA TAG TTT TAA ATT ACA ACC AGA GCT TGG CAT ATT GTA TCT ATA CCT TTA TTA AAT GCT TTT AAT TTA ATA AAT TAT TGT TTT CTC TTA GAT ATG CAA TAA TTT TCC CAC TAT CAT TGA TTA TTT CCC AGG AAC CCA TAA CAA ATT ACT TAA AAA CCT TGC TTT TAT GGA AAG TGA TAT TTT GGA GAA AGT AAA AGA ACA CCA AGA ATC GAT GGA CAT CAA CAA CCC TCG GGA CTT TAT TGA TTG CTT CCT GAT CAA AAT GGA-3’，SEQ ID NO.15；模板序列P3為：5’-CAT TTA GCT TCA CCC TGT GAT CCC ACT TTC ATC CTG GGC TGT GCT CCC TGC AAT GTG ATC TGC TCC ATT ATT TTC CAG AAA CGT TTC GAT TAT AAA GAT CAG CAA TTT CTT AAC TTG ATG GAA AAA TTG AAT GAA AAC ATC AGG ATT GTA AGC ACC CCC TGG ATC CAG GTA AGG CCA AGT TTT TTG CTT CCT GAG AAA CCA CTT ACA GTC TTT TTT TCT GGG AAA TCC AAA ATT CTA TAT TGA CCA AGC CCT GAA GTA CAT TTT TGA ATA CTA CAG TCT TGC CTA GAC AGC C-3’，SEQ ID NO.16；模板序列P4為：5’-CAT TTA GCT TCA CCC TGT GAT CCC ACT TTC ATC CTG GGC TGT GCT CCC TGC AAT GTG ATC TGC TCC ATT ATT TTC CAG AAA CGT TTC GAT TAT AAA GAT CAG CAA TTT CTT AAC TTG ATG GAA AAA TTG AAT GAA AAC ATC AGG ATT GTA AGC ACC CCC TGA ATC CAG GTA AGG CCA AGT TTT TTG CTT CCT GAG AAA CCACTT ACA GTC TTT TTT TCT GGG AAA TCC AAA ATT CTA TAT TGA CCA AGC CCT GAA GTA CAT TTT TGA ATA CTA CAG TCT TGC CTA GA CAG CC-3’，SEQ ID NO.17)。反應體系構成為反應程序為：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反應結束后拍照，結果示于圖2中。圖2的結果顯示本發(fā)明試劑盒可穩(wěn)定的檢測樣本基因組DNA。

實施例3 MTHFR等位基因SNP位點分型檢測匹配基因型樣本檢測

本實施例應用實施例1所述的所述MTHFR等位基因分型檢測試劑盒，檢測了不同分型的外周血樣本基因組DNA模板，用來驗證本發(fā)明所陳述的可視化檢測方法檢測實際樣本的可行性。

反應條件：

該試劑盒每樣本檢測由4管反應構成，分別含有針對四種基因型的引物和探針，各管反應總體積均為20μL。MTHFR等位基因SNP位點檢測反應體系組成為：10mM Tris緩沖液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2；引物3序列：SEQ ID NO.3；引物4序列：SEQ ID NO.4)，1μM探針(探針1序列SEQ ID NO.5；探針2序列：SEQ ID NO.6；探針3序列SEQ ID NO.7；探針4序列：SEQ ID NO.8；探針5序列：SEQ ID NO.9；探針6序列：SEQ ID NO.10；探針7序列：SEQ ID NO.11)，0.1μM納米金探針(探針1：SEQ ID NO.12；探針2：SEQ ID NO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶和內切酶A，0.2mM dNTP。向該體系中分別加入待測樣本DNA。反應體系構成為反應程序為：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反應結束后拍照，結果參照圖3(位點1為rs1801133，位點2為rs1801131；W代表野生，M代表突變)。圖3的結果顯示本發(fā)明試劑盒可以穩(wěn)定進行樣本檢測。

實施例4 MTHFR等位基因SNP位點分型檢測干擾實驗驗證

本實施例檢測了加入不同干擾物質(血紅蛋白、白蛋白、膽固醇、乙醇)的陽性樣本，用來驗證本發(fā)明所陳述的可視化檢測方法檢測實際樣本時干擾物質對結果的影響。

反應條件：

該試劑盒每樣本檢測由4管反應構成，分別含有針對四種基因型的引物和探針，各管反應總體積均為20μL。MTHFR等位基因SNP位點檢測反應體系組成為：10mM Tris緩沖液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2；引物3序列：SEQ ID NO.3；引物4序列：SEQ ID NO.4)，1μM探針(探針1序列SEQ ID NO.5；探針2序列：SEQ ID NO.6；探針3序列SEQ ID NO.7；探針4序列：SEQ ID NO.8；探針5序列：SEQ ID NO.9；探針6序列：SEQ ID NO.10；探針7序列：SEQ ID NO.11)，0.1μM納米金探針(探針1：SEQ ID NO.12；探針2：SEQ ID NO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶和內切酶A，0.2mM dNTP。向該體系中分別加入不同干擾物質(0.1mg/ml血紅蛋白、0.01mmol/L白蛋白、0.2mmol/L膽固醇、0.1％乙醇)的陽性樣本。反應體系構成為反應程序為：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反應結束后拍照，結果參加圖4(位點1為rs1801133，位點2為rs1801131；W代表野生，M代表突變)。圖4的結果顯示不同干擾物質(血紅蛋白、白蛋白、膽固醇、乙醇)不會影響本發(fā)明試劑盒的檢測結果。

實施例5樣本檢測結果

本實施例檢測10例臨床樣本，用來評價本發(fā)明所陳述的可視化檢測方法檢測實際樣本。

反應條件：

該試劑盒每樣本檢測由4管反應構成，分別含有針對四種基因型的引物和探針，各管反應總體積均為20μL。MTHFR等位基因SNP位點檢測反應體系組成為：10mM Tris緩沖液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2；引物3序列：SEQ ID NO.3；引物4序列：SEQ ID NO.4)，1μM探針(探針1序列SEQ ID NO.5；探針2序列：SEQ ID NO.6；探針3序列SEQ ID NO.7；探針4序列：SEQ ID NO.8；探針5序列：SEQ ID NO.9；探針6序列：SEQ ID NO.10；探針7序列：SEQ ID NO.11)，0.1μM納米金探針(探針1：SEQ ID NO.12；探針2：SEQ ID NO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶和內切酶A，0.2mM dNTP。向該體系中分別加入10例臨床樣本DNA。反應程序為：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反應結束后拍照，結果參見圖5(位點1為rs1801133，位點2為rs1801131；W代表野生，M代表突變)。圖5的結果顯示本發(fā)明試劑盒能夠正常的反應臨床樣本的結果。

以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州市寶創(chuàng)生物技術有限公司

<120> 可視化MTHFR等位基因分型檢測試劑盒

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctgacctga agcacttga 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcggaagaat gtgtcagcc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaggagctg ctgaagatg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggtttggtt ctcccgaga 19

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcgccgagg gctcccgca 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgcgccgagg actcccgcag a 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcgtgatgat gaaatcgt 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgcgccgagg aaagtgtctt tgaag 25

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgcgccgagg caagtgtctt tgaagtc 27

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gagctgacca gtgaagt 17

<210> 11

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtcttgtggt actgcactcg tctcggtttt ccgagacgag tcctcggcgc gatcgtgatg 60

aaccat 66

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aaaaaaaaaa gttcatgatc acgat 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcagtaccac aagacaaaaa aaaaa 25

<210> 14

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atattttatt tatatttata gttttaaatt acaaccagag cttggcatat tgtatctata 60

cctttattaa atgcttttaa tttaataaat tattgttttc tcttagatat gcaataattt 120

tcccactatc attgattatt tcccgggaac ccataacaaa ttacttaaaa accttgcttt 180

tatggaaagt gatattttgg agaaagtaaa agaacaccaa gaatcgatgg acatcaacaa 240

ccctcgggac tttattgatt gcttcctgat caaaatgga 279

<210> 15

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atattttatt tatatttata gttttaaatt acaaccagag cttggcatat tgtatctata 60

cctttattaa atgcttttaa tttaataaat tattgttttc tcttagatat gcaataattt 120

tcccactatc attgattatt tcccaggaac ccataacaaa ttacttaaaa accttgcttt 180

tatggaaagt gatattttgg agaaagtaaa agaacaccaa gaatcgatgg acatcaacaa 240

ccctcgggac tttattgatt gcttcctgat caaaatgga 279

<210> 16

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

catttagctt caccctgtga tcccactttc atcctgggct gtgctccctg caatgtgatc 60

tgctccatta ttttccagaa acgtttcgat tataaagatc agcaatttct taacttgatg 120

gaaaaattga atgaaaacat caggattgta agcaccccct ggatccaggt aaggccaagt 180

tttttgcttc ctgagaaacc acttacagtc tttttttctg ggaaatccaa aattctatat 240

tgaccaagcc ctgaagtaca tttttgaata ctacagtctt gcctagacag cc 292

<210> 17

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catttagctt caccctgtga tcccactttc atcctgggct gtgctccctg caatgtgatc 60

tgctccatta ttttccagaa acgtttcgat tataaagatc agcaatttct taacttgatg 120

gaaaaattga atgaaaacat caggattgta agcaccccct gaatccaggt aaggccaagt 180

tttttgcttc ctgagaaacc acttacagtc tttttttctg ggaaatccaa aattctatat 240

tgaccaagcc ctgaagtaca tttttgaata ctacagtctt gcctagacag cc 292