可視化HLA?B*5801基因分型檢測試劑盒的制作方法

本發(fā)明屬于分子生物技術和基因檢測領域，具體是一種HLA-B*5801基因分型檢測試劑盒。

背景技術：

別嘌呤醇是治療痛風的一線藥物，是目前惟一的黃嘌呤氧化酶抑制劑。該藥可引起嚴重副反應，包括Stevens-John綜合征(SJS)及中毒性表皮壞死癥(TEN)。HLA-B*5801等位基因與別嘌呤醇引發(fā)的SJS或TEN的強相關性首先由中國臺灣學者在漢族人群中發(fā)現，并被泰國、新加坡、香港和中國多個研究小組在漢族人群中證實，漢族人中HLA-B*5801等位基因頻率為9-15％(呈地域差異)。

研究表明，HLA-B*5801等位基因與別嘌呤醇引發(fā)的嚴重皮炎副反應呈現很強的相關性，尤其在漢族人中高達100％，幾乎所有副反應的患者都是HLA-B*5801的攜帶者，而別嘌呤醇耐受者中只有15％左右的HLA-B*5801攜帶者，檢測HLA-B*5801等位基因可以預防別嘌呤醇引發(fā)的SJS或TEN。在2012年美國風濕病學會更新的痛風管理指南中也建議使用別嘌呤醇前，應對嚴重過敏反應的高危人群，建議進行HLA-B*5801等位基因檢測。

然而，由于HLA-B*5801等位基因較為復雜，直接對其檢測很不方便。有研究進一步證實，對于亞洲人種，PSORS1C1基因的SNP位點(rs9263726)與HLA-B*5801等位基因存在直接相關性，且相關性達到100％，因此，可以檢測與HLA-B*5801等位基因關聯的SNP位點來反映攜帶者是否攜帶HLA-B*5801等位基因。本項目通過檢測PSORS1C1基因的SNP位點(rs9263726)來反映服用別嘌呤醇藥物的臨床攜帶者發(fā)生SJS/TEN的風險。

目前市場上已有的HLA-B*5801等位基因分型檢測試劑盒基本都是基于熒光信號檢測的PCR擴增技術，需要用到實時熒光PCR設備，其價格較為昂貴，不利于在設施條件差的醫(yī)療單位使用。而同時臨床中，至今為止尚未有能夠直接采用普通PCR循環(huán)儀器就能夠實現可視化分型HLA-B*5801等位基因的閉管方法。

技術實現要素：

基于此，本發(fā)明的目的為提供一種對設施條件要求低、可視化、成本低廉的新型HLA-B*5801等位基因分型檢測試劑盒。

實現上述目的的技術方案如下。

一種可視化HLA-B*5801基因分型檢測試劑盒，包括有2條引物，4條常規(guī)探針、以及2條與納米金顆粒連接的探針；

所述2條引物為：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

所述4條常規(guī)探針分別為SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6，或所述4條常規(guī)探針分別為SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6的反向互補序列；

所述2條與納米金顆粒連接的探針的堿基組成如SEQ ID NO.7至SEQ IDNO.8所示，或SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.8的反向互補序列所示。

本發(fā)明利用了基于納米金探針的可視化核酸檢測技術，在將高靈敏的PCR擴增方法、高特異的酶切方法及可視化的納米金探針檢測方法相結合，構建了可視化HLA-B*5801基因分型檢測試劑盒，可用于HLA-B*5801基因分型的可視化檢測，實現低成本、高靈敏的HLA-B*5801基因分型檢測。通過檢測患者基因組DNA中的SNP位點(rs9263726)單核苷酸多態(tài)性位點，判定該患者的HLA-B*5801基因編碼酶的藥物代謝速率類型，并根據攜帶者的等位基因類型輔助醫(yī)生對別嘌呤醇用藥的不良反應發(fā)生風險進行評價，指導攜帶者的安全用藥，為臨床提供一種新型檢測方法。

本發(fā)明具有以下有益效果。

采用本發(fā)明中的試劑盒對HLA-B*5801基因SNP位點進行分型檢測無需使用熒光探針，試劑存放無需避光，不必擔心熒光衰減的問題，因此存放條件更加穩(wěn)定。

本發(fā)明采用的納米金探針有比較成熟的方法合成，成本低；具備高穩(wěn)定性，能夠耐受強熱循環(huán)和強機械沖擊；具備強適用性，能夠與各種酶反應液共存而不影響反應的正常進行。

利用本發(fā)明中的試劑盒可實現短時間高靈敏度的閉管核酸檢測，能夠有效的避免擴增產物的交叉污染。

本發(fā)明中的試劑盒能夠采用普通PCR儀完成對HLA-B*5801基因SNP位點的分型檢測，且結果區(qū)分特征明顯。

附圖說明

下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，不用于限定有權利要求所界定的本發(fā)明范圍。

圖1是本發(fā)明中引物探針設計原理。

圖2是實施例2中檢測反應的靈敏度。

圖3是實施例3中匹配基因型檢測結果。

圖4是實施例4中干擾實驗檢測結果。

圖5是實施例5中代表性樣本檢測結果。

具體實施方式

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發(fā)明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術語“和/或”包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內容的理解更加透徹全面。

實施例1引物探針

根據HLA-B*5801基因SNP位點的分別特異性設計對應的引物和探針，針對該位點分別由一對特異性的引物和探針決定其檢測結果，其引物設計的位置和方法的原理如圖1所示。

所述HLA-B*5801基因分型檢測試劑盒，包含2條引物、4條常規(guī)探針、2條納米金修飾探針、反應液、酶液。

引物、探針和納米金探針序列如引物1-引物2、探針1-探針4、納米金探針1-納米金探針2，或為上述序列的互補序列：

引物1：GGA CCC CAG CTC CTT AAC A；SEQ ID NO.1

引物2：CCA TGT GGC AAA GTC GG；SEQ ID NO.2

探針1：CGC GCC GAG GGT CCC CCC C；SEQ ID NO.3

探針2：CGC GCC GAG GAT CCC CCC C；SEQ ID NO.4

探針3：AGA GTT TCC TCG GAG；SEQ ID NO.5

探針4：GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT；SEQ ID NO.6

納米金探針1：Au-AAA AAA AAA AGT TCA TGA TCA CGA T；SEQ ID NO.7

納米金探針2：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-Au。SEQ ID NO.8

本實施例所述的試劑盒中，所述的納米金探針的納米金顆粒平均尺寸為1nm-200nm，較佳的納米金顆粒平均尺寸為5nm-80nm，本實施例中所用的納米金探針平均尺寸為10nm-30nm。上述納米金顆粒市面上能夠購買得到的合格產品即可。

所述的分型檢測試劑盒，所述酶液有兩種酶混合而成，兩種酶分別為擴增酶和內切酶，擴增酶可以是Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶，內切酶可以是TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN。本實施例中所用的擴增酶是Taq DNA聚合酶，內切酶所用的是AfuFEN。

所述HLA-B*5801基因分型檢測試劑盒對HLA-B*5801基因SNP位點進行分型檢測每例樣本需要2管反應實現結果分型的判讀，分別針對HLA-B*5801 基因SNP位點野生型(P1)和突變型(P2)，其步驟主要有以下三個階段，而這三個階段均是在同管閉管條件下完成的。第一階段：模板擴增，通過引物對、擴增酶的參與，實現對目標模板的高靈敏擴增；第二階段：通過探針和內切酶的參與，實現對目標模板向信號分子的高效率轉化；第三階段：通過納米金探針實現對信號分子的高分辨識別。通過以上三個階段的反應就可以實現在閉管條件下的高靈敏、高分辨、低成本的HLA-B*5801基因SNP位點進行分型檢測。

所述的分型檢測試劑盒，所述的檢測結果判別方式可有肉眼直接判讀，反應結束后反應液紅色為陽性，反應液無色為陰性。

實施例2HLA-B*5801基因SNP位點分型檢測靈敏度

本實施例應用實施例1所述的所述HLA-B*5801基因分型檢測試劑盒，檢測了不同濃度的HLA-B*5801基因SNP位點分型的模板，用來驗證本發(fā)明所陳述的可視化檢測方法的可行性。

反應條件：

該試劑盒每樣本檢測由2管反應構成，分別含有針對兩種基因型的引物和探針，各管反應總體積均為20μL。HLA-B*5801基因SNP位點檢測反應體系組成為：10mM Tris緩沖液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2)，1μM探針(探針1序列SEQ ID NO.3；探針2序列：SEQ ID NO.4；探針3序列：SEQ ID NO.5；探針4序列：SEQ ID NO.6)，0.1μM納米金探針(探針1：SEQ ID NO.7；探針2：SEQ ID NO.8)，0.5U TaqDNA聚合酶和內切酶A，0.2mM dNTP。向該體系中分別加入10⁵、10⁴、10³、10²、10、1及0拷貝的待測核酸(模板序列P1為：5’-CAG GCA CAC AGA CCC CAG CTT TAC AAG GAC CCC AGC TCC TTA ACA CAG ATC CCA GCT CCG AGG AAA CTC GTC CCC CCC ACG TTA ATC CTG ACC GAC TTT GCC ACA TGG AGC CAG CAA ACC ATT TCT GGT GAG AGC CAA ATG CAC CTT CTG CAC CAT-3’，SEQ ID NO.9；模板序列P2為：5’-CAG GCA CAC AGA CCC CAG CTT TAC AAG GAC CCC AGC TCC TTA ACA CAG ATC CCA GCT CCG AGG AAA CTC ATC CCC CCC ACG TTA ATC CTG ACC GAC TTT GCC ACA TGG AGC CAG CAA ACC ATT TCT GGT GAG AGC CAA ATG CAC CTT CTG CAC CAT-3’，SEQ ID NO.10)。反應體系構成為反應程序為：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反應結束后拍照，結果示于圖2中。圖2的結果顯示本發(fā)明試劑盒可穩(wěn)定的檢測樣本基因組DNA。

實施例3HLA-B*5801基因SNP位點分型檢測匹配基因型樣本檢測

本實施例應用實施例1所述的所述HLA-B*5801基因分型檢測試劑盒，檢測了不同分型的外周血樣本基因組DNA模板，分型結果分別為：突變雜合型(樣本1)、野生純合型(樣本2)、突變純合型(樣本3)，用來驗證本發(fā)明所陳述的可視化檢測方法檢測實際樣本的可行性。

反應條件：

該試劑盒每樣本檢測由2管反應構成，分別含有針對兩種基因型的引物和探針，各管反應總體積均為20μL。HLA-B*5801基因SNP位點檢測反應體系組成為：10mM Tris緩沖液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2)，1μM探針(探針1序列SEQ ID NO.3；探針2序列：SEQ ID NO.4；探針3序列：SEQ ID NO.5；探針4序列：SEQ ID NO.6)，0.1μM納米金探針(探針1：SEQ ID NO.7；探針2：SEQ ID NO.8)，0.5U Taq DNA聚合酶和內切酶A，0.2mM dNTP。向該體系中分別加入待測樣本DNA。反應體系構成為反應程序為：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反應結束后拍照，結果參照圖3(W代表野生，M代表突變)。圖3的結果顯示本發(fā)明試劑盒可以穩(wěn)定進行樣本檢測。

實施例4HLA-B*5801基因SNP位點分型檢測干擾實驗驗證

本實施例檢測了加入不同干擾物質(血紅蛋白、白蛋白、膽固醇、乙醇)的陽性樣本，用來驗證本發(fā)明所陳述的可視化檢測方法檢測實際樣本時干擾物質對結果的影響。

反應條件：

該試劑盒每樣本檢測由2管反應構成，分別含有針對兩種基因型的引物和探針，各管反應總體積均為20μL。HLA-B*5801基因SNP位點檢測反應體系組成為：10mM Tris緩沖液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2)，1μM探針(探針1序列SEQ ID NO.3；探針2序列：SEQ ID NO.4；探針3序列：SEQ ID NO.5；探針4序列：SEQ ID NO.6)，0.1μM納米金探針(探針1：SEQ ID NO.7；探針2：SEQ ID NO.8)，0.5U Taq DNA聚合酶和內切酶A，0.2mM dNTP。向該體系中分別加入不同干擾物質(0.1mg/ml血紅蛋白、0.01mmol/L白蛋白、0.2mmol/L膽固醇、0.1％乙醇)的陽性樣本。反應體系構成為反應程序為：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反應結束后拍照，結果參加圖4(W代表野生，M代表突變)。圖4的結果顯示不同干擾物質(血紅蛋白、白蛋白、膽固醇、乙醇)不會影響本發(fā)明試劑盒的檢測結果。

實施例5樣本檢測結果

本實施例檢測10例臨床樣本，用來評價本發(fā)明所陳述的可視化檢測方法檢測實際樣本。

反應條件：

該試劑盒每樣本檢測由2管反應構成，分別含有針對兩種基因型的引物和探針，各管反應總體積均為20μL。HLA-B*5801基因SNP位點檢測反應體系組成為：10mM Tris緩沖液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2)，1μM探針(探針1序列SEQ ID NO.3；探針2序列：SEQ ID NO.4；探針3序列：SEQ ID NO.5；探針4序列：SEQ ID NO.6)，0.1μM納米金探針(探針1：SEQ ID NO.7；探針2：SEQ ID NO.8)，0.5U Taq DNA聚合酶和內切酶A，0.2mM dNTP。向該體系中分別加入10例臨床樣本DNA。反應程序為：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反應結束后拍照，結果參見圖5(W代表野生，M代表突變)。圖5的結果顯示本發(fā)明試劑盒能夠正常的反應臨床樣本的結果。

以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州市寶創(chuàng)生物技術有限公司

<120> 可視化HLA-B*5801基因分型檢測試劑盒

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atttctggtg agagccaaat gcaccttctg caccat 156

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