DNA文庫的制備方法以及試劑盒與流程

本發(fā)明涉及DNA文庫的制備及靶向捕獲方法以及試劑盒。尤其涉及血漿游離DNA文庫、白細(xì)胞gDNA文庫或組織來源的DNA文庫的制備及靶向捕獲方法以及試劑盒。
背景技術(shù)：
：研究發(fā)現(xiàn)，癌癥患者血液中存在少量的游離DNA，即血漿游離DNA(cfDNA)，而這些游離DNA中有一部分是來自于腫瘤細(xì)胞，這部分游離于血液中的腫瘤基因組片段被稱為循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。ctDNA作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，在腫瘤的個體化用藥檢測、復(fù)發(fā)及療效監(jiān)測等方面發(fā)揮著重要的作用。通過檢測從腫瘤組織釋放到血液中的ctDNA以獲得癌癥相關(guān)基因變異信息的方法，即為“液體活檢”。近年來基于ctDNA的液體活檢概念逐漸被醫(yī)生們所接受和認(rèn)可。它不僅可以輔助診斷實(shí)體瘤，而且能夠?qū)崿F(xiàn)耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測，療效評估，是組織活檢的有力補(bǔ)充?；谌蚪M建庫后探針捕獲的二代測序法技術(shù)，能實(shí)現(xiàn)多基因多靶點(diǎn)的平行檢測，且擁有極高的敏感性與特異性，能實(shí)現(xiàn)ctDNA的液體活檢。因此，基于二代測序技術(shù)的ctDNA文庫的構(gòu)建對于實(shí)現(xiàn)液體活檢以及腫瘤的輔助診斷、臨床指導(dǎo)用藥等都具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種DNA文庫的制備方法以及試劑盒，所述方法適用于cfDNA、白細(xì)胞gDNA、以及來源于組織樣本的DNA文庫的構(gòu)建。本發(fā)明的方法能夠便于實(shí)現(xiàn)靶基因的所有變異類型，如突變、缺失、插入、融合、以及拷貝數(shù)擴(kuò)增的檢測，克服了目前在DNA水平上通過PCR的方法富集靶基因序列，但只能檢測靶基因的突變和缺失，無法檢測融合的缺點(diǎn)。本發(fā)明的DNA文庫制備方法，是在SureSelectXT的建庫方法基礎(chǔ)上，對預(yù)文庫以及終文庫構(gòu)建過程中的細(xì)節(jié)進(jìn)行了改進(jìn)，例如末端修復(fù)以及3’端加A在同一個反應(yīng)體系中進(jìn)行，改進(jìn)雜交投入量、并對雜交捕獲截斷的阻斷制劑進(jìn)行優(yōu)化，由此獲得了更高的捕獲效率，更高的文庫多樣性，和更均一的覆蓋度，適合于微量以及低豐度突變的樣本文庫的構(gòu)建，并實(shí)現(xiàn)了技術(shù)流程上的節(jié)約。本發(fā)明一方面涉及DNA文庫的制備方法，其包括預(yù)文庫和終文庫的制備過程，其中所述的預(yù)文庫制備過程包括DNA的制備、末端修復(fù)和3’端加A，接頭連接，接頭連接產(chǎn)物純化，預(yù)文庫擴(kuò)增，擴(kuò)增的預(yù)文庫純化，所述的終文庫制備過程包括預(yù)文庫雜交，捕獲洗脫，終文庫制備，以及終文庫純化過程，其中所述DNA文庫為cfDNA文庫、白細(xì)胞gDNA文庫或組織來源的DNA文庫。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中所述的末端修復(fù)和3’端加A是在一個反應(yīng)體系中進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中末端修復(fù)和3’端加A的反應(yīng)體系含有ER&AT緩沖液，ER&AT酶，以及cfDNA，并且ER&AT緩沖液：ER&AT酶：cfDNA的體積比為7：3：50。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中末端修復(fù)和3’端加A的反應(yīng)體系條件為：20℃30分鐘(85℃熱蓋)65℃30分鐘(85℃熱蓋)4℃維持。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中預(yù)文庫雜交過程中所用的阻斷劑為雙向短鏈阻斷劑。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中所述的雙向短鏈阻斷劑結(jié)構(gòu)如下：根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中純化步驟中所加入的磁珠量較常規(guī)減少一半。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中接頭連接產(chǎn)物純化過程中連接反應(yīng)體系和磁珠體積比為1：0.8。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中擴(kuò)增的預(yù)文庫純化過程中PCR體積和磁珠體積1：1.2。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其還適用于白細(xì)胞gDNA、以及組織樣本DNA的文庫構(gòu)建。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中進(jìn)行白細(xì)胞gDNA、以及組織樣本的DNA文庫構(gòu)建時還涉及打斷時間、打斷稀釋液、以及漂洗緩沖液吹打位置的優(yōu)化。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中所述白細(xì)胞gDNA、以及組織樣本的DNA文庫構(gòu)建時打斷時間為30s到150s。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中所述白細(xì)胞gDNA、以及組織樣本的DNA文庫構(gòu)建時所用的打斷稀釋液為IDTE(10mMTris0.1MEDTA,pH8.0)。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中所述白細(xì)胞gDNA、以及組織樣本的DNA文庫構(gòu)建時漂洗緩沖液吹打位置為PCR儀于為65℃下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的制備方法，其中還進(jìn)一步包括純化的預(yù)文庫或終文庫的質(zhì)檢、純化的預(yù)文庫或終文庫的片段大小檢測。本發(fā)明的第二方面提供了雙向短鏈阻斷劑。根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的雙向短鏈阻斷劑，其具體結(jié)構(gòu)如下：所述雙向短鏈阻斷劑，能夠在雜交過程中產(chǎn)生更好的阻斷作用，使得雜交更徹底，結(jié)果更準(zhǔn)確。根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的雙向短鏈阻斷劑在制備用于構(gòu)建DNA文庫的試劑盒中的應(yīng)用，其中所述DNA文庫為cfDNA文庫、白細(xì)胞gDNA文庫或組織來源的DNA文庫。附圖說明圖1為預(yù)文庫總量結(jié)果圖。圖1A為cfDNA預(yù)文庫總量；圖1B為WBCgDNA預(yù)文庫總量，其中樣本數(shù)為8。圖2為FFPEgDNA不同投入量下KAPA-XT組與XT組預(yù)文庫產(chǎn)量，其中樣本數(shù)為7。其中KAPA即為如下的KAPA-XT組，QXT即為XT-30組。圖3為文庫濃度結(jié)果圖。圖3A為cfDNA結(jié)果，圖3B為WBCgDNA文庫結(jié)果，其中樣本同圖1。圖4為文庫中片段大小結(jié)果圖。圖4A為cfDNA結(jié)果，圖4B為WBCgDNA文庫結(jié)果。圖5為捕獲效率的結(jié)果比較圖，其中橫坐標(biāo)表示上述8個樣本的cfDNA和WBCgDNA的共16個文庫。圖6為文庫復(fù)雜度和測序深度的結(jié)果圖。圖6A和圖6B為cfDNA文庫的復(fù)雜度(5000X)和測序深度結(jié)果；圖6C和圖6D為WBCgDNA文庫的復(fù)雜度(5000X)和測序深度結(jié)果。圖7為KAPA+XT組實(shí)驗(yàn)操作流程圖。上述WBCgDNA即為白細(xì)胞來源的gDNA，KAPA-30即為如下的KAPA-XT組，XT-30即為如下的XT-30組。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1.實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為兩組進(jìn)行，具體分組情況如下：第一組(XT-30組)：根據(jù)現(xiàn)有的SureSelectXT方法的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行，并作為下面所述不同亞組的對照組，所用的cfDNA或白細(xì)胞來源的gDNA與各個亞組所用量保持一致。第二組(KAPA-XT組)：該組進(jìn)一步依據(jù)不同的樣本來源(血漿來源的cfDNA，白細(xì)胞來源的gDNA，F(xiàn)FPE(福爾馬林固定石蠟包埋)來源的gDNA)分為三個亞組。三個亞組依據(jù)下面所述的具體步驟進(jìn)行。2.實(shí)驗(yàn)步驟2.1DNA提取以及質(zhì)檢依據(jù)《cfDNA提取標(biāo)準(zhǔn)流程》提取30ngcfDNA并進(jìn)行洗脫，洗脫條件為室溫，體積為55μL。50μL進(jìn)入下面所述流程，3μL用來進(jìn)行質(zhì)量控制流程。在Qubit3.0HSKit試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了如下改進(jìn)：白細(xì)胞的打斷時間由90s調(diào)整為150s打斷，打斷稀釋液由ddH2O調(diào)整為IDTE，漂洗緩沖液的吹打位置由操作臺面調(diào)整為PCR儀內(nèi)于65℃下進(jìn)行，提取200nggDNA，然后進(jìn)行洗脫，洗脫條件為室溫，體積為55μL。50μL進(jìn)入以下流程，3μL用來進(jìn)行質(zhì)量控制流程。提取FFPE來源的gDNA，并將FFPE來源的gDNA超聲打斷到200-250bp左右，打斷時間設(shè)置為30s，60s，以及150s，為建庫做準(zhǔn)備。2.2末端修復(fù)，3’端加A1)本流程對接步驟2.1最后一步，打開KAPAHyperPrep96reactionKit(-20℃)，取出ER&AT緩沖液以及ER&AT酶試劑置于冰上融化。2)設(shè)置PCR儀(BioRadT100或ABVeriti)，具體程序(程序名為“ERA”)設(shè)置如下：20℃30分鐘(85℃熱蓋)65℃30分鐘(85℃熱蓋)4℃維持。3)依據(jù)步驟2.1分別定量準(zhǔn)備30ng血漿cfDNA，200ng白細(xì)胞來源的gDNA，5ng、10ng、30ngFFPE來源的gDNA，終末體積為50μL。4)冰上配制末端修復(fù)和加A反應(yīng)體系混勻液(表1)，手指輕彈3-5次，上下顛倒混勻2-3次，臺式微型離心機(jī)離心1-3秒。5)用P20移液器吸取10μL混勻液加入上述50μLDNA溶液中，上下輕柔吹打10次混勻，臺式微型離心機(jī)短暫離心1-3秒。表1末端修復(fù)和3’端加A反應(yīng)體系試劑反應(yīng)體積ER&AT緩沖液7μLER&AT酶3μLcfDNA或片段化的gDNA50μL總量60μL6)放入PCR儀Bio-RadT100或ABVeriti中，使用程序“ERA”，(85℃熱蓋，20℃30分鐘，65℃30分鐘，4℃維持)。2小時內(nèi)進(jìn)入下一步。2.3接頭連接1)準(zhǔn)備如下表2所示的試劑：表2接頭連接與純化試劑2)設(shè)置程序：設(shè)置(BioRadT100orABVeriti)定義程序名為“LIG”20℃15分鐘(85℃熱蓋)70℃10分鐘(85℃熱蓋)4℃保持。3)冰上配制接頭連接反應(yīng)體系混勻液(表3)，手指輕彈3-5次，上下顛倒混勻2-3次，臺式微型離心機(jī)離心1-3秒。4)用P100移液器吸取50μL混勻液加入上述0.2mL管中，移液器保持50μL上下吹打5次混勻，臺式微型離心機(jī)離心1-3秒。表3連接反應(yīng)體系設(shè)置試劑預(yù)反應(yīng)體積連接緩沖液30μLDNA連接酶10μLAdaptorOligoMix10μL末端修復(fù)混合液60μL總體積110ul5)在PCR儀(T100orABVeriti)上運(yùn)行程序“LIG”(20℃15分鐘，70℃10分鐘，4℃維持(85℃熱蓋))。2.4接頭連接產(chǎn)物純化1)將AMPUREXP磁珠置于室溫至少30分鐘，上下顛倒2-3次，渦旋混勻5-10秒已經(jīng)回復(fù)室溫的AMPUREXP磁珠，使其均一化。2)按照每個文庫600μL配制新鮮的75％乙醇。3)取EppendorfLoBind1.5mL離心管，按連接反應(yīng)體系和磁珠體積1：0.8比例，先后加入88μL均一化的磁珠和110μL加接頭的預(yù)文庫。移液器P200吹打5次混勻，溫和旋轉(zhuǎn)孵育5分鐘。4)將離心管置于磁力架。等待溶液澄清(約3-5分鐘)。5)將離心管置于磁力架上不動，打開管蓋，用移液器P200小心吸走澄清上清(約200μL)，避免碰到磁珠。6)將離心管仍置于磁力架上，用移液器P1000在每管加入300μL新鮮配制的75％乙醇。7)等待1分鐘使磁珠充分沉淀，期間沿水平方向緩慢旋轉(zhuǎn)離心管一圈，吸走乙醇。8)重復(fù)6，7步驟一次。9)臺式微型離心機(jī)離心1-3秒，將離心管重新放回磁力架靜置30秒，使用P10移液器除凈殘留乙醇，保持管蓋開啟。10)室溫2分鐘使磁珠干燥，以磁珠表面不反光，磁珠塊沒有裂紋為準(zhǔn)。11)加入28μLEB溶液，充分吹打混勻，室溫孵育3分鐘。12)將離心管置于磁力架2分鐘，直至溶液澄清。13)移取上清27.5μL至新的0.2mLPCR管，冰上備用。2.5預(yù)文庫擴(kuò)增1)預(yù)文庫擴(kuò)增所需試劑以及反應(yīng)條件參見表4和表5:表4PCR純化準(zhǔn)備表5預(yù)文庫擴(kuò)增PCR反應(yīng)條件2)為避免交叉污染，在專用的干凈區(qū)域或紫外線滅菌和帶正壓氣流的PCR臺配制PCR(除文庫DNA的所有成分)反應(yīng)液。3)按照表6準(zhǔn)備反應(yīng)體系混勻液(冰上配制)，手指輕彈3-5次，上下顛倒混勻2-3次，臺式微型離心機(jī)離心1-3秒。4)在“接頭連接產(chǎn)物純化”這一步中的PCR管中(含27.5μL接頭純化產(chǎn)物)每管用P100移液器加入22.5μL反應(yīng)混勻液，上下輕柔吹打10次混勻。5)置于PCR儀上運(yùn)行“PRE”程序。表6預(yù)富集PCR體系試劑預(yù)反應(yīng)體積5xKAPAHiFiBuffer10μL10mMdNTPMix1.5μLSureSelectPrimer5μLPre-CapturePCRReversePrimer5μLKAPAHiFi1μL干凈的連接混合液27.5μL總體積50μL2.6擴(kuò)增的預(yù)文庫純化1)將AMPUREXP磁珠置于室溫至少30分鐘。2)按照每個文庫600μL配制新鮮的75％乙醇。3)上下顛倒2-3次，渦旋混勻5-10秒已經(jīng)回復(fù)室溫的AMPUREXP磁珠，使其均一化。4)取EppendorfLoBind1.5mL離心管，按PCR體積和磁珠體積1：1.2比例，先后加入60μL均一化的磁珠和50μLPCR預(yù)文庫。移液器P200調(diào)到100μL上下吹打5次，溫和旋轉(zhuǎn)孵育5分鐘。5)將離心管置于磁力架。等待溶液澄清(約3-5分鐘)。6)離心管仍置于磁力架不動，打開管蓋，小心吸走上清(約110μL)，避免碰到磁珠。7)離心管仍置于磁力架上，用移液器P1000在每管加入300μL新鮮配制的75％乙醇。8)等待1分鐘使磁珠充分沉淀，期間沿水平方向緩慢旋轉(zhuǎn)離心管一圈，吸走乙醇。9)重復(fù)7，8步驟一次。10)臺式微型離心機(jī)離心1-3秒，將離心管重新放回磁力架靜置30s，使用P10移液器除凈殘留乙醇,保持管蓋開啟。11)室溫2分鐘使磁珠干燥，以磁珠表面不反光，磁珠塊沒有裂紋為準(zhǔn)。12)加入28μLddH2O，充分吹打混勻，室溫孵育3分鐘。13)將離心管置于磁力架2分鐘，直至溶液澄清。14)移取上清27.5μL至新的0.2mLPCR管，冰上備用。2.7純化的預(yù)文庫質(zhì)檢將上述步驟獲得的純化預(yù)文庫稀釋。取1μL純化后的預(yù)文庫到一個新的1.5mLEP管中，加入10μLddH2O，P20移液器上下吹打混勻10次，其中1μL用作Qubit定量，其余用作下一步的LabchipQC(使用LabchipDNAHSKit試劑盒進(jìn)行)。2.8預(yù)文庫雜交1)準(zhǔn)備表7中的試劑。2)程序設(shè)置：設(shè)置(BioRadS1000)定義程序名為“FASTHYB”表7預(yù)文庫雜交試劑準(zhǔn)備其中，預(yù)文庫雜交過程中所用的阻斷劑BLK為雙向短鏈阻斷劑，其具體結(jié)構(gòu)如下：3)該雜交反應(yīng)需要至少300ng預(yù)文庫，根據(jù)Qubit定量結(jié)果，判斷是否可以進(jìn)行雜交。如果預(yù)文庫產(chǎn)量大于1500ng，移取12μL純化后預(yù)文庫到48孔板。如果預(yù)文庫產(chǎn)量大于750ng但小于1500ng，移取相應(yīng)于750ng純化后預(yù)文庫到48孔板,用水補(bǔ)齊體積至12μL。如果預(yù)文庫產(chǎn)量小于750ng，但大于300ng，可嘗試雜交，移取所有預(yù)文庫到48孔板，用水補(bǔ)齊體積至12μL。4)按表8常溫配制預(yù)文庫封閉體系，按表9常溫配置探針體系。表8預(yù)文庫封閉體系預(yù)文庫封閉預(yù)反應(yīng)體積SureSelectQXTFastBlockerMix5μLBLK1μL預(yù)文庫12μL總體積(HybBuffer)18μL表9探針配置體系5)將含有預(yù)文庫封閉體系的48孔板蓋上8連管蓋，放入PCR儀。運(yùn)行程序“FASTHYB”程序95℃5分鐘,至第三步65℃開始，暫停PCR程序，打開8連管蓋。6)將相應(yīng)的探針組分按每個樣本12μL的體積用P20排槍迅速轉(zhuǎn)移到已含有預(yù)文庫組分的雜交板孔，總體積30μL，吹打5次混勻，每次取樣探針組分需更換槍頭。將八連管在板上蓋蓋緊，再貼上剪切成一半的microsealB貼膜以防止蒸干。運(yùn)行雜交程序至程序結(jié)束(65℃保持)。如需過夜雜交，也可將雜交程序65℃保持過夜至16小時后進(jìn)行下一步。2.9捕獲洗脫1)設(shè)置恒溫金屬浴溫度65℃。2)SCB/T1磁珠(為一種親和鏈霉磁珠，選取來自于ThermoFisher65601的MyOneTMStreptavidinT1)室溫平衡30分鐘以上。3)按600μL/樣本的用量將SureSelectWashBuffer2置于15ml錐形管內(nèi)金屬加熱器65℃孵育。4)取出SCB/T1磁珠，上下顛倒混勻5次，渦旋混勻10秒，室溫靜置半小時以上，渦旋混勻10秒,按樣品數(shù)分裝入1.5mlLoBind管，每個樣品需50μL，每個Lobind管最多放250μL。靜置磁力架上3分鐘，棄上清。5)每25μL原始磁珠加200μLSureSelectBindingBuffer，渦旋混勻3秒，短暫離心，靜置磁力架上3分鐘，棄上清。6)重復(fù)以上步驟2次，共3次。7)每25μL原始磁珠加入200μLSureSelectBindingBuffer，渦旋混勻3秒，重懸SCB/T1，分裝200μL/管于LoBind管中。8)將雜交樣本約28μL用P200轉(zhuǎn)移至重懸的SCB/T1磁珠中，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫旋轉(zhuǎn)孵育30分鐘。9)將磁珠樣品混合液管置于磁力架上靜置3分鐘，用P1000吸去約230μL上清。加入500μLSureSelectWashBuffer1，渦旋混勻5秒，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上,室溫旋轉(zhuǎn)孵育15分鐘。10)將磁珠樣品混合液管磁力架上靜置3分鐘，用P1000吸去約500μL上清。用P20吸盡殘留液體。11)加入200μL預(yù)熱至65℃的SureSelectWashBuffer2，渦旋混勻10秒，置于干式混勻儀上，65℃震蕩孵育10分鐘，轉(zhuǎn)速為300rpm。磁力架上靜置3分鐘,用P1000吸去約200μL上清，再用P20吸盡殘留液體。11)重復(fù)步驟10兩次，共三次。12)用P20除凈樣本管中殘留液體，P100移液器加入30μLEB，上下吹打10次混勻，放置冰上備用。2.10終文庫制備1)按表10準(zhǔn)備以下試劑；依據(jù)表11設(shè)置PCR儀(BioRadS1000)程序“POST”。表10捕獲文庫擴(kuò)增及純化表11PostPCR設(shè)置2)取20μLSCB/T1結(jié)合文庫的磁珠，渦旋混勻加到0.2mLPCR管中。3)按表12PostPCR體系所示的體系，依次加入0.2mlPCR管，用P100設(shè)置量程30μL吹打10次混勻，短暫離心，蓋上蓋子。在PCR儀上運(yùn)行表“POST”程序。表12PCR體系設(shè)定2.11終文庫純化1)將PCR產(chǎn)物置于微型離心機(jī)快速離心1s，靜置在96孔磁力架上5分鐘，吸取50μL上清加入到新的1.5mLEppendorfLoBind管中。2)加入50μLAMPUREXP磁珠，混勻，渦旋混勻儀上室溫孵育5分鐘。3)將離心管置于磁力架。等待溶液澄清(約2分鐘)。4)離心管仍置于磁力架不動，同時小心吸走澄清上清約100μL，不要碰到磁珠。5)離心管仍置于磁力架上，每管加入300μL新鮮配制的75％乙醇。等待1分鐘使磁珠充分沉淀，期間沿水平方向緩慢旋轉(zhuǎn)離心管一圈，吸走乙醇。75％乙醇重復(fù)洗滌一次。6)將離心管重新放回磁力架靜置30s，使用P10移液器除凈殘留乙醇。7)開蓋，室溫2分鐘使磁珠干燥，立刻進(jìn)行下一步。過度干燥會嚴(yán)重降低溶解效率。8)加入30μLEB，充分吹打混勻，室溫孵育3分鐘。9)將離心管置于磁力架2分鐘，直至溶液澄清。10)移取約30μL上清至新的1.5ml離心管，棄去磁珠。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1預(yù)文庫總量以及預(yù)文庫QC在與XT-30組投入量相同的情況下，KAPA+XT方法下的cfDNA和WBCgDNA預(yù)文庫得率顯著高于XT-30組，具體結(jié)果參見圖1。選取質(zhì)量不同的FFPEgDNA樣本進(jìn)行比對測試，KAPA+XT組的方法流程明顯優(yōu)于基于XT組的建庫流程，10個PCR循環(huán)后的預(yù)文庫得率明顯高于XT組流程，具體結(jié)果參見表13以及圖2。并且由于XT組預(yù)文庫產(chǎn)量過低，因此未進(jìn)行后續(xù)的測序比較。表13FFPEgDNA不同投入量下KAPA-XT組與XT組預(yù)文庫產(chǎn)量3.2文庫濃度測定純化后文庫的濃度。濃度過低(<10nM)則預(yù)示PCR循環(huán)數(shù)不夠或者純化丟失過多，過高(>50nM)也可能預(yù)示過分?jǐn)U增或者非特異性捕獲組成過多。本發(fā)明KAPA+XT組所構(gòu)建的cfDNA以及白細(xì)胞gDNA文庫濃度均顯著高于XT-30組，具體結(jié)果參見圖3。3.3純化后文庫片段大小檢測通過檢測文庫的片段大小，判斷文庫是否正常。結(jié)果分析：KAPA+XT組中加接頭的cfDNA的文庫片段分布在160-170bp之間，白細(xì)胞gDNA的文庫片段分布在200bp左右，參見圖4，均符合文庫構(gòu)建的要求，文庫構(gòu)建結(jié)果正常。3.4捕獲效率KAPA+XT組的捕獲效率平均在67％左右，且比XT-30組更穩(wěn)定，具體參見圖5。3.5復(fù)雜度和測序深度cfDNA在相同投入量(30ng)，同測序深度(5000×)下，KAPA+XT組和XT-30組在復(fù)雜度上保持較好的一致性，具體參見圖6，且兩個樣本中，無論是文庫復(fù)雜度還是測序深度，KAPA+XT組均優(yōu)于XT-30組。3.6終文庫構(gòu)建所需要時間根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建方法，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)操作流程，時間按8個樣本計(jì)算，手動操作時間為170分鐘，總計(jì)實(shí)驗(yàn)時間約10小時，參見圖7。按照標(biāo)準(zhǔn)的SureSelectXT方法，時間按8個樣本計(jì)算，手動操作時間為230小時，總計(jì)實(shí)驗(yàn)時間約26小時。通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明的方法相比標(biāo)準(zhǔn)方法在文庫構(gòu)建的各個指標(biāo)方面均產(chǎn)生了更優(yōu)異的技術(shù)效果，而這與上述提及的對標(biāo)準(zhǔn)方法的改進(jìn)之處，以及所使用的例如雙向短鏈阻斷劑直接相關(guān)。實(shí)施例中所用試劑具體參見表14：當(dāng)前第1頁1 2 3