本申請涉及一種識別Fe3+的水溶性探針的合成，屬于有機(jī)合成技術(shù)領(lǐng)域；又因?yàn)楸旧暾埳婕霸撍苄蕴结樤诩?xì)胞中的生物應(yīng)用，又屬于生物體金屬含量分析與檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自然界中存在著各種金屬，包括堿土金屬、堿金屬、過渡金屬和重金屬元素，而這些金屬與環(huán)境、生物、醫(yī)學(xué)和化學(xué)學(xué)科密切相關(guān)。在各種微量元素中，鐵是最豐富且重要的過渡金屬，在生物體的生命中起著重要的作用。鐵是人體生理活動(dòng)不可缺少的元素，在血液里具有參與氧的運(yùn)輸，蛋白轉(zhuǎn)移，合成DNA和RNA，以及維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓和酸堿平衡的重要作用。一旦機(jī)體內(nèi)鐵離子缺乏，就會(huì)引發(fā)各種生理系統(tǒng)紊亂，增加疾病。
然而過多的鐵在體內(nèi)也是有害甚至致命的。研究表明，生物體內(nèi)攝入過量的鐵會(huì)引發(fā)許多疾病，如心臟和肝臟疾病，糖尿病，甚至癌癥。因此，高選擇性和高靈敏度探針對活體細(xì)胞的檢測具有十分重要的作用。
就目前而言，鐵離子的檢測方法主要有原子吸收分光光度法(AAS)、紫外分光光度法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)，電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)和電化學(xué)分析法。盡管這些方法具有很高的靈敏度，但是由于它們往往需要昂貴的儀器、復(fù)雜的處理過程和高成本，長時(shí)間的消耗，所以并不是檢測樣品的最好方法。
熒光滴定法由于具有高選擇性、高靈敏度、操作簡單和易于操作等優(yōu)點(diǎn)，而受到了研究者的廣泛關(guān)注。熒光探針是一類能將分子識別的信息通過熒光信號有效表達(dá)的分子，廣泛應(yīng)用于陽離子、陰離子和中性分子等被分析物的熒光檢測。熒光探針具有靈敏度高、選擇性高、檢出限低、實(shí)時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)，在生物研究、環(huán)境污染物和其他有害的醫(yī)療監(jiān)測離子或小分子識別檢測方面具有重要意義。
常見的熒光發(fā)色團(tuán)有卟啉熒光素、羅丹明、香豆素、萘酰亞胺類、蒽醌類等化合物。在這些熒光基團(tuán)里，香豆素探針獨(dú)特的苯并芘吡喃酮結(jié)構(gòu)，使其具有熒光量子產(chǎn)率高，斯托克斯位移大，以及可調(diào)的光物理、光化學(xué)和光穩(wěn)定性等特性，是熒光分子探針中的一種很好的候選熒光配體。
因此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的上述缺陷，特提出此申請。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本申請的目的之一在于，提供一種根一種識別Fe3+的水溶性探針的制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請采用如下技術(shù)方案：
一種識別Fe3+的水溶性探針的制備方法，其特征在于，所述識別Fe3+的水溶性探針為7-二乙氨基-3-甲醛香豆素，其制備方法如下：
(1)將4-二乙基氨基水楊醛、丙二酸二乙酯和哌啶溶解在乙醇中，升溫至70-90℃回流攪拌6-8h，減壓蒸餾除去乙醇；之后加入冰醋酸和濃鹽酸，回流攪拌6-8h，冷卻至室溫，然后加入冰水，再調(diào)節(jié)pH值到4-5，攪拌后，得到白色沉淀，過濾，用水洗滌，干燥，再經(jīng)甲苯重結(jié)晶，得到7-二乙氨基香豆素；其反應(yīng)式為：
2)將N2保護(hù)下，在DMF中滴加POCl3，在20-50℃下攪拌30min，然后滴加7-二乙氨基香豆素-DMF溶液，得到紅色懸浮液；將所述紅色懸浮液在50-60℃下攪拌12-14h，然后倒入冰水中，得到混合溶液；將質(zhì)量百分比濃度為20％NaOH溶液加入到混合溶液中，獲得粗產(chǎn)物；將所述粗產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇重結(jié)晶，得到所述的7-二乙氨基-3-甲醛香豆素；其反應(yīng)式為：
。
優(yōu)選地，步驟(1)中，所述4-二乙基氨基水楊醛、丙二酸二乙酯和哌啶摩爾比為1:2:1。
優(yōu)選地，步驟(1)中，哌啶、乙醇、冰醋酸和濃鹽酸的體積比為1:30:20:20。
優(yōu)選地，步驟(2)中，所述7-二乙氨基香豆素-DMF溶液的濃度為0.69mmol/L。
優(yōu)選地，步驟(2)中，POCl3、DMF、7-二乙氨基香豆素-DMF溶液的體積比為1:1:5。
優(yōu)選地，步驟(1)中調(diào)節(jié)pH值4-5時(shí)，使用氨水、NaOH溶液、KOH溶液中的一種；優(yōu)選使用質(zhì)量百分比濃度為40％的NaOH溶液。
優(yōu)選地，步驟(1)具體包括：
將1.93g4-二乙氨基水楊醛，3.2g丙二酸二乙酯和1mL哌啶加入到30mL乙醇中，回流攪拌6h，減壓蒸餾去乙醇；之后加入20mL冰醋酸和20mL濃鹽酸，回流攪拌6h，冷卻至室溫，然后倒入100mL冰水；逐滴加入40％的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值到5，攪拌30min，得到白色沉淀；過濾，用水洗滌，干燥，再經(jīng)甲苯重結(jié)晶得到7-二乙氨基香豆素。
優(yōu)選地，步驟(2)具體包括：
N2保護(hù)下，往2mL DMF中滴加2mL POCl3，在20-50℃下攪拌30min；然后將7-二乙氨基香豆素-DMF溶液逐滴加入，得到紅色懸浮液；將紅色懸浮液在60℃下攪拌12h，然后倒入100mL冰水中得到混合溶液；將20％NaOH溶液加入到混合溶液中獲得粗產(chǎn)物；將所述粗產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇過濾、水洗、干燥和結(jié)晶，得到所述的7-二乙氨基-3-甲醛香豆素。
本申請的另一目的在于，提供一種識別Fe3+的水溶性探針應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請采用如下技術(shù)方案：
一種識別Fe3+的水溶性探針應(yīng)用，其特征在于，將所述探針應(yīng)用于Fe3+檢測上。
優(yōu)選地，將所述探針應(yīng)用到淋巴腫瘤細(xì)胞的Fe3+檢測上。
本申請中，濃鹽酸是指質(zhì)量百分比濃度為37％的鹽酸。
本申請中，所述識別Fe3+的水溶性探針為7-二乙氨基-3-甲醛香豆素，也稱探針L。
本申請的有益效果是：本申請?zhí)峁┝艘粋€(gè)處于5到6.5溫和pH值范圍內(nèi)的水溶性熒光探針，在其他金屬離子的干擾中對Fe3+的檢驗(yàn)具有快速響應(yīng)和高選擇性。本申請所提供的制備方法可操作性強(qiáng)，所制備的水溶性熒光探針收率高，且制備過程時(shí)間得到了縮短，減少了生產(chǎn)制備成本。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例詳述本申請，但本申請并不局限于這些實(shí)施例。
如無特別說明，本申請的實(shí)施例中的原料均通過商業(yè)途徑購買。
實(shí)施例1
本實(shí)施例涉及水溶性探針的制備：
(1)7-二乙氨基香豆素的合成(1)
將(1.93g,10mmol)4-二乙氨基水楊醛，(3.2g,20mmol)丙二酸二乙酯和1mL哌啶加入到30mL乙醇中，在90℃回流攪拌6h，減壓蒸餾去溶劑。之后向混合物中加入20mL冰醋酸和20mL濃鹽酸，回流攪拌6h，冷卻至室溫，然后倒入100mL冰水。逐滴加入40％的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值到5，攪拌30min，得到白色沉淀。過濾，用水洗滌，干燥，再經(jīng)甲苯重結(jié)晶得7-二乙氨基香豆素的合成(1.74g，8mmol)，收率為80.1％。
(2)7-二乙氨基-3-甲醛香豆素的合成(L)
N2保護(hù)下，往新蒸餾的2mL DMF中滴加2mL POCl3，在20-50℃下攪拌30min得紅色溶液。然后將1(1.50g，6.91mmol，溶解在10mL DMF中)逐滴加入到上述溶液中，產(chǎn)生紅色懸浮液。將混合物在60℃下攪拌12h，然后倒入100mL冰水中。將20％NaOH溶液加入到混合物中獲得大量沉淀。粗產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇過濾、水洗、干燥和結(jié)晶，得到7-二乙氨基-3-甲醛香豆素的合成(1.20g，4.89mmol)，收率為70.8％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝12.35(s,1H),8.62(s,1H),7.44(d,J＝9.0,1H),6.69(d,J＝2.2,1H),6.51(s,1H),3.49(q,J＝7.0,4H),1.26(t,J＝7.1,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm):165.55,164.46,158.04,153.80,150.23,131.96,110.96,108.53,105.46,96.81,77.38,77.06,76.74,45.36,12.39；ESI-MS m/z([M+H]+):Calcd 245；found:244.5。
實(shí)施例2
本實(shí)施例涉及識別Fe3+的水溶性探針的應(yīng)用
一、初步測試
分別以乙醇，乙腈，甲醇，四氫呋喃，二氯甲烷，水等為溶劑分別配制5、10、20μM的探針在365nm紫外燈下觀測其熒光，而后分別加入10當(dāng)量的Pb2+,Ni2+,Mg2+,Cd2+,Co2+,Cu2+,Ni2+,Fe2+,Zn2+,K+,Li+,Na+,Al3+,Fe3+,Cr3+等金屬離子，發(fā)現(xiàn)僅有Fe3+發(fā)生淬滅。綜合考量，以蒸餾水作為溶劑配制10μM探針進(jìn)行試驗(yàn)。
二、光譜測試
為了探索熒光探針的金屬選擇性，其熒光光譜通過添加不同的金屬離子得到，其中包括Pb2+,Ni2+,Mg2+,Cd2+,Co2+,Cu2+,Ni2+,Fe2+,Zn2+,K+,Li+,Na+,Al3+,Fe3+,Cr3+等，實(shí)驗(yàn)時(shí)向10μM探針中加入10當(dāng)量金屬離子。
我們可以清楚地觀察到在200nm-350nm波長范圍內(nèi)，鐵離子吸收紫外線的強(qiáng)度明顯高于其他離子或空白探針。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cu2+和Cr3+的加入會(huì)引起最大吸收峰發(fā)生紅移現(xiàn)象。
通過不同的金屬離子對熒光探針的熒光光譜的影響分析，可以發(fā)現(xiàn)Fe3+的加入導(dǎo)致探針熒光猝滅，而除銅離子，鉻離子對探針的熒光強(qiáng)度稍有影響，其他金屬離子對探針的熒光強(qiáng)度幾乎沒有影響。由此說明，探針對Fe3+具有良好的選擇性。
三、不同F(xiàn)e3+濃度對探針熒光強(qiáng)度的影響
在實(shí)驗(yàn)過程中，在0-10當(dāng)量范圍，不同F(xiàn)e3+濃度對探針的熒光強(qiáng)度有影響。隨著Fe3+濃度的增加，熒光強(qiáng)度也相應(yīng)降低。
探針的檢測限可根據(jù)熒光滴定進(jìn)行計(jì)算。通過斯特恩沃瑪公式法計(jì)算得出探針L的檢測限為0.025μM。
檢測限＝3σ÷m＝2.46×10-8mol＝0.025μM
其中σ是空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差，m是校準(zhǔn)曲線的斜率，該檢測線比之前報(bào)告的大多數(shù)探針的檢測限都要低很多，可以看出探針L具有更高的靈敏度。
四、繪制Job曲線
通過實(shí)驗(yàn)研究繪制Job曲線，可知，當(dāng)探針L的含量達(dá)到50％，(1-XL)達(dá)到最大值，這表明探針L與Fe3+形成1:1的化合物。
五、pH的影響
為了研究pH值對探針的熒光強(qiáng)度的影響，實(shí)驗(yàn)測定了pH 2～9范圍內(nèi)探針的熒光強(qiáng)度的變化，加入Fe3+的探針其熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化，而未加入Fe3+的探針其熒光強(qiáng)度在pH 4～5范圍內(nèi)急劇增加，在pH大于6時(shí)熒光強(qiáng)度開始減小，得出探針L最適宜的范圍為5～6.5。經(jīng)測定，實(shí)驗(yàn)室所用蒸餾水的pH為5.8，所以可以直接用于實(shí)驗(yàn)而不需要緩沖液的相應(yīng)調(diào)節(jié)。
六、恢復(fù)性探究
探針的可逆性是實(shí)際應(yīng)用中的一個(gè)重要因素。為了探索探針的可逆性，實(shí)驗(yàn)用L-Fe3+跟H2PO4-進(jìn)行熒光滴定實(shí)驗(yàn)。正如預(yù)期的那樣，當(dāng)10當(dāng)量的Fe3+加入到探針L時(shí)，可以觀察到一個(gè)明顯的熒光猝滅，當(dāng)添加30當(dāng)量的H2PO4-到混合溶液中，之前明顯的熒光淬滅恢復(fù)到探針L本身的熒光強(qiáng)度。因此可以得出，探針L對Fe3+的檢測是可逆的。
七、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
隨著對熒光探針響應(yīng)機(jī)理的理解，并根據(jù)其明顯的熒光特性，本文探討了在活體細(xì)胞中識別Fe3+的可能性。在37℃下，將人體淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞Ramos用探針L(10μmol)孵育35min，并用PBS緩沖液沖洗以去除殘留的化合物L(fēng)。然后向Ramos細(xì)胞添加適量的Fe3+(0，5，10當(dāng)量)后孵育0.5h，用PBS緩沖液沖洗后，細(xì)胞的共聚焦熒光顯微鏡成像。結(jié)果，用沒加Fe3+培養(yǎng)的細(xì)胞具有很強(qiáng)的明亮的熒光，而那些加入Fe3+的細(xì)胞顯示出明顯的熒光猝滅，沒有明顯的熒光被發(fā)現(xiàn)，說明該傳感器L是一個(gè)可用于生物系統(tǒng)中Fe3+檢測的熒光探針。不僅如此，用不同濃度的探針L(10μmol，20μmol，50μmol)來孵育細(xì)胞48h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)Ramos細(xì)胞保持良好狀態(tài)，這表明探針L具有毒性低、生物相容性好的特性。
以上所述，僅是本申請的幾個(gè)實(shí)施例，并非對本申請做任何形式的限制，雖然本申請以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限制本申請，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本申請技術(shù)方案的范圍內(nèi)，利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許的變動(dòng)或修飾均等同于等效實(shí)施案例，均屬于技術(shù)方案范圍內(nèi)。