一種對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行Y?STR分型的方法和系統(tǒng)與流程

本發(fā)明涉及一種分型方法和系統(tǒng)，尤其涉及一種對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行Y-STR分型的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat,STR)是廣泛存在于人類染色體DNA中的一類多態(tài)性遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，因其存在范圍廣(平均16kb中即有一個(gè)STR基因座)，核心序列小(2-7bp)且擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度均小于500bp，等位基因位點(diǎn)的數(shù)字即代表序列重復(fù)的次數(shù)。STR基因座的等位基因片斷長(zhǎng)度集中，故可對(duì)多個(gè)STR基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。復(fù)合擴(kuò)增多個(gè)STR基因座，累計(jì)鑒別能力可以接近或達(dá)到DNA指紋水平。Y染色體為男性特有的染色體，同一父系所有的男性個(gè)體都具有相同的Y-STR單倍型。Y-STR檢驗(yàn)作為常染色體檢驗(yàn)的一種補(bǔ)充手段，對(duì)家系排查、父權(quán)親權(quán)鑒定、男女混合成分中男性成分的檢測(cè)及多個(gè)男性混合成分的判定具有重要的應(yīng)用價(jià)值，而且因?yàn)樯姘阜缸镄袨槿?0％以上為男性，Y-STR檢驗(yàn)在DNA檢驗(yàn)中扮演著越來越重要的角色?，F(xiàn)在法醫(yī)DNA技術(shù)的作用更多的體現(xiàn)在被動(dòng)比對(duì)方面，把Y-STR檢驗(yàn)法引進(jìn)到偵查學(xué)領(lǐng)域破獲案件，創(chuàng)立了“Y-STR家系排查法”，可以縮小命案?jìng)刹榉秶瑸閭刹樘岢鲋赶蛐缘木€索。家系排查指將犯罪現(xiàn)場(chǎng)提取到的Y-STR數(shù)據(jù)，與一定范圍內(nèi)的家系進(jìn)行比對(duì)，一旦比中，便可以指向犯罪行為人所在家系。目前河南、山東等正在以縣(市)為單位建庫，以行政村為單元繪制家系圖譜，在家系圖譜的基礎(chǔ)上采集生物樣本，開展Y-STR數(shù)據(jù)庫建設(shè)工作。通過Y數(shù)據(jù)庫自動(dòng)化比對(duì)，可快速指向犯罪嫌疑人所在家系，縮小偵查范圍；快速指向無名尸體所在家系，指明偵查方向；可以排除女性DNA的干擾，獲得明確的男性信息，入庫自動(dòng)比對(duì)。河南Y庫采取“邊打邊建，以打促建”的方針，已經(jīng)利用該庫成功破獲數(shù)百起命案積案，頗有成效。專利CN103866019中公開了一種用于法醫(yī)Y-STR檢測(cè)的Y-STR熒光復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)試劑，具體公開了21個(gè)Y-STR基因座及擴(kuò)增引物。然而，其引物的設(shè)計(jì)使得一些Y-STR基因座的擴(kuò)增產(chǎn)物排列過于緊密甚至前一個(gè)基因座的擴(kuò)增產(chǎn)物跨到下一個(gè)基因座的范圍內(nèi)，造成分型無法判讀，另外基因座排布緊密還可能造成等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物在分析時(shí)出現(xiàn)串?dāng)_、錯(cuò)位從而導(dǎo)致整個(gè)結(jié)果無法正確分析判讀。如何提供一種可解決上述問題的對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行Y-STR分型的方法和系統(tǒng)成為有待解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行Y-STR分型的方法，通過采用特定Y-STR基因座組合以及針對(duì)這些基因座設(shè)計(jì)的特定引物，使得在分型過程中不會(huì)出現(xiàn)分型無法判讀、分型串?dāng)_、錯(cuò)位的問題，能準(zhǔn)確地獲得男性個(gè)體包括24個(gè)Y-STR基因座、以及性別決定基因座Amelogenin在內(nèi)共25個(gè)基因座的基因型，從而為實(shí)現(xiàn)對(duì)該男性個(gè)體進(jìn)行家系排查、父權(quán)親權(quán)鑒定、男女混合樣本中男性成分來源推斷，和/或男男混合樣本中男性成分來源推斷等提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明還提供一種對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行Y-STR分型的系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)男性個(gè)體針對(duì)上述25個(gè)基因座的準(zhǔn)確分型。本發(fā)明還提供了一種復(fù)合檢測(cè)體系，所述檢測(cè)體系能準(zhǔn)確獲得男性個(gè)體包括24個(gè)Y-STR基因座和性別決定基因座Amelogenin在內(nèi)共25個(gè)基因座的基因型。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)試劑盒，包括所述的復(fù)合檢測(cè)體系。本發(fā)明提供的一種對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行Y-STR分型的方法，該方法包括：1)獲得男性個(gè)體的DNA；2)獲得所述DNA包括24個(gè)Y-STR基因座、以及性別決定基因座Amelogenin在內(nèi)共25個(gè)基因座的基因型，所述24個(gè)Y-STR基因座為DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617，包括采用與所述基因座對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟；其中基因座DYS460的擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.1至SEQIDNo.2的核苷酸序列；基因座DYS389I/II的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.3至SEQIDNo.4的核苷酸序列；基因座DYS390，DYS392，DYS458，DYS437的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.5至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.15至SEQIDNo.38的核苷酸序列；基因座DYS527a/b的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.39至SEQIDNo.40的核苷酸序列；基因座DYS617，Amelogenin的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.41至SEQIDNo.44的核苷酸序列；3)根據(jù)所述男性個(gè)體25個(gè)基因座的基因型獲得該個(gè)體的Y-STR分型結(jié)果。在本發(fā)明的方案中，所述25個(gè)基因座是申請(qǐng)人通過對(duì)大量男性個(gè)體的生存環(huán)境、種族起源等進(jìn)行綜合分析獲得的。針對(duì)上述基因座的引物也是申請(qǐng)人通過大量實(shí)驗(yàn)獲得的，成功解決了在對(duì)男性個(gè)體的Y-STR分型過程存在的分型無法判讀、分型串?dāng)_、錯(cuò)位的問題，同時(shí)這些特定Y染色體基因座的組合還能實(shí)現(xiàn)對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行家系排查、父權(quán)親權(quán)鑒定、男女混合樣本中男性成分來源推斷，和/或男男混合樣本中男性成分來源推斷。進(jìn)一步的，在本申請(qǐng)的方案中，“獲得男性個(gè)體的DNA”指的是提取該個(gè)體的例如血液、組織等樣本中的DNA，或者直接獲得含有所述個(gè)體DNA的血卡?！八瞿行詡€(gè)體的Y-STR分型結(jié)果”指的是能用于對(duì)該男性個(gè)體進(jìn)行家系排查、父權(quán)親權(quán)鑒定、男女混合樣本中男性成分來源推斷，和/或男男混合樣本中男性成分來源推斷的Y-STR分型結(jié)果。其中男男混合樣本中男性成分來源推斷指對(duì)來自非同一父系家族的男性個(gè)體的區(qū)分。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述引物為熒光標(biāo)記引物。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式中，其中2)還包括在獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，使用遺傳分析儀分析該擴(kuò)增產(chǎn)物，以獲得所述25個(gè)基因座的基因型的步驟。在本發(fā)明的方案中，所述遺傳分析儀可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的遺傳分析儀，例如ABI3130或ABI3500型遺傳分析儀，通過ID-X軟件或其他GeneMapper軟件等分析該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物中所述25個(gè)基因座的基因型。本發(fā)明提供的一種對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行Y-STR分型的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括DNA獲取體系，復(fù)合檢測(cè)體系、推斷體系；所述DNA獲取體系用于獲得所述男性個(gè)體的DNA；所述復(fù)合檢測(cè)體系用于獲得所述DNA包括24個(gè)Y-STR基因座、以及性別決定基因座Amelogenin在內(nèi)共25個(gè)基因座的基因型，并根據(jù)該基因型獲得該個(gè)體的Y-STR分型結(jié)果，所述24個(gè)Y-STR基因座為DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617，獲得所述25個(gè)基因座的基因型的過程包括采用與所述基因座對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟；其中基因座DYS460的擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.1至SEQIDNo.2的核苷酸序列；基因座DYS389I/II的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.3至SEQIDNo.4的核苷酸序列；基因座DYS390，DYS392，DYS458，DYS437的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.5至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.15至SEQIDNo.38的核苷酸序列；基因座DYS527a/b的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.39至SEQIDNo.40的核苷酸序列；基因座DYS617，Amelogenin的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.41至SEQIDNo.44的核苷酸序列；所述推斷體系用于根據(jù)所述個(gè)體的Y-STR分型結(jié)果對(duì)該男性個(gè)體進(jìn)行家系排查、父權(quán)親權(quán)鑒定、男女混合樣本中男性成分來源推斷，和/或男男混合樣本中男性成分來源推斷。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述引物為熒光標(biāo)記引物。更進(jìn)一步的，所述復(fù)合檢測(cè)體系還用于在獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，使用遺傳分析儀分析該擴(kuò)增產(chǎn)物，以獲得所述25個(gè)基因座的基因型。更進(jìn)一步的，所述遺傳分析儀利用針對(duì)各基因座的等位基因的分型標(biāo)準(zhǔn)物來確定男性個(gè)體DNA中各基因座的基因型。本發(fā)明提供的一種復(fù)合檢測(cè)體系，所述體系包括男性個(gè)體DNA，25個(gè)基因座，以及擴(kuò)增引物，所述復(fù)合檢測(cè)體系用于利用所述擴(kuò)增引物獲得所述DNA包括24個(gè)Y-STR基因座、以及性別決定基因座Amelogenin在內(nèi)共25個(gè)基因座的擴(kuò)增產(chǎn)物，并由所述擴(kuò)增產(chǎn)物獲得男性個(gè)體的DNA的25個(gè)基因座的基因型，并進(jìn)一步由該基因型獲得所述個(gè)體的Y-STR分型結(jié)果，所述24個(gè)Y-STR基因座為DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617，所述擴(kuò)增引物由與所述25個(gè)基因座對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物組成，其中基因座DYS460的擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.1至SEQIDNo.2的核苷酸序列；基因座DYS389I/II的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.3至SEQIDNo.4的核苷酸序列；基因座DYS390，DYS392，DYS458，DYS437的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.5至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.15至SEQIDNo.38的核苷酸序列；基因座DYS527a/b的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.39至SEQIDNo.40的核苷酸序列；基因座DYS617，Amelogenin的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.41至SEQIDNo.44的核苷酸序列。在本發(fā)明的方案中，所述DNA聚合酶可以是FastStartDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、HotstartDNA聚合酶中的一種或多種。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)試劑盒，包括所述的復(fù)合檢測(cè)體系。在本發(fā)明的方案中，本發(fā)明利用所述復(fù)合檢測(cè)體系進(jìn)行22個(gè)基因座的分型的方法，包括：1)將獲取的男性個(gè)體DNA作為模板；2)使用所述擴(kuò)增引物作為模板的男性個(gè)體DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)以得到擴(kuò)增產(chǎn)物；3)將所述擴(kuò)增產(chǎn)物利用遺傳分析儀進(jìn)行分析，以獲得25個(gè)基因座的基因型。在本發(fā)明的方案中，所述25個(gè)基因座信息如表1所示：表1基因座重復(fù)序列5’標(biāo)記DYS19TAGAROXDYS385a/bGAAAHEXDYS389I/II(TCTG)(TCTA)FAMDYS390(TCTA)(TCTG)FAMDYS391TCTATAMRADYS392TATFAMDYS393AGATROXDYS437TCTAHEXDYS448AGAGATTAMRADYS456AGATTAMRADYS635TSTAROXGATAH4TAGAHEXDYS438TTTTCTAMRADYS439AGATROXDYS460ATAGFAMDYS447TAAWATAMRADYS527abGAAAROXDYS617TATTAMRADYS522GATAHEXDYS444TAGAROXDYS458GAAAHEXAmelogenin---HEX本發(fā)明提供的擴(kuò)增引物序列如下。所述22對(duì)擴(kuò)增引物及其相對(duì)應(yīng)的基因座如下表2所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物；表2本發(fā)明方案具有以下的優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明的檢測(cè)方法和檢測(cè)系統(tǒng)采用特定的STR基因座組合以及引物序列，使得最終獲得的分型圖譜上各位點(diǎn)之間排布均勻，且引物特異性高，可以得到完整的STR分型，峰型尖銳清晰，平衡性好，無Pull-up峰、stutter帶，無非特異性人工產(chǎn)物出現(xiàn)，完全能夠滿足法醫(yī)Y-STR檢驗(yàn)的要求。2、使用本發(fā)明的檢測(cè)方法和檢測(cè)系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)特定24個(gè)Y-STR位點(diǎn)和1個(gè)Amelogenin位點(diǎn)，具有高的親權(quán)鑒定能力、男性個(gè)體進(jìn)行家系排查、以及男女混合樣本中男性成分來源推斷，和/或男男混合樣本中男性成分來源推斷。3、本發(fā)明的方案可以通過使用熒光標(biāo)記，利用常規(guī)的遺傳分析儀，根據(jù)所要擴(kuò)增的基因的分子量和熒光顏色的不同，獲得直觀的檢測(cè)結(jié)果，并且該結(jié)果與現(xiàn)有檢測(cè)系統(tǒng)相比，準(zhǔn)確性為100％。4、本發(fā)明提供的方案能有效從基因水平為其家系排查、親權(quán)鑒定等提供準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)。附圖說明圖1顯示了本申請(qǐng)各基因座的等位基因排布圖(其中第一行為藍(lán)色熒光，第二行為綠色熒光，第三行為黃色熒光，第四行為紅色熒光)。圖2顯示了使用本發(fā)明系統(tǒng)獲得的一個(gè)樣本的分型結(jié)果圖。圖3顯示了使用專利CN103866019體系獲得的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(ladder)的分型圖(其中第一行為藍(lán)色熒光，第二行為綠色熒光，第三行為黑色熒光，第四行為紅色熒光)。圖4顯示了使用本申請(qǐng)?bào)w系獲得的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(ladder)的分型圖(其中第一行為藍(lán)色熒光，第二行為綠色熒光，第三行為黑色熒光，第四行為紅色熒光)。圖5顯示了使用專利CN103866019體系獲得的基因座DYS460等位基因分型圖(其中第一行為藍(lán)色熒光，第二行為綠色熒光，第三行為黑色熒光，第四行為紅色熒光)。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例中使用的193份人抗凝血(男性193份)，由公安部物證鑒定中心提供。以下實(shí)施例中使用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用試劑耗材和儀器如下表3所示：表3實(shí)施例1、對(duì)本發(fā)明的對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行Y-STR分型的方法和系統(tǒng)準(zhǔn)確性的驗(yàn)證在本實(shí)施例中，所述男性個(gè)體為193份男性人抗凝血，已知其個(gè)體來源，但在本申請(qǐng)實(shí)施例1的實(shí)施過程中設(shè)定其個(gè)體來源未知，采用本申請(qǐng)方法和系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行Y-STR分型，包括：1)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中的DNA獲取體系獲得男性個(gè)體的DNA，2)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中的復(fù)合檢測(cè)體系獲得所述DNA包括24個(gè)Y-STR基因座以及性別決定基因座Amelogenin在內(nèi)共25個(gè)基因座的基因型，并根據(jù)該基因型獲得該個(gè)體的Y-STR分型結(jié)果，3)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中所述推斷體系，根據(jù)所述個(gè)體的Y-STR分型結(jié)果對(duì)該男性個(gè)體進(jìn)行家系排查、父權(quán)親權(quán)鑒定、男女混合樣本中男性成分來源，和/或男女混合樣本中男性成分來源推斷。本實(shí)施例中，所述復(fù)合檢測(cè)體系用于利用所述擴(kuò)增引物獲得所述DNA包括24個(gè)Y-STR基因座、以及性別決定基因座Amelogenin在內(nèi)共25個(gè)基因座的擴(kuò)增產(chǎn)物，并由所述擴(kuò)增產(chǎn)物獲得男性個(gè)體的DNA的25個(gè)基因座的基因型，并進(jìn)一步由該基因型獲得所述個(gè)體的Y-STR分型結(jié)果；所述24個(gè)Y-STR基因座為DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617；所述擴(kuò)增引物由與所述25個(gè)基因座對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物組成，其中基因座DYS460的擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.1至SEQIDNo.2的核苷酸序列；基因座DYS389I/II的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.3至SEQIDNo.4的核苷酸序列；基因座DYS390，DYS392，DYS458，DYS437的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.5至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.15至SEQIDNo.38的核苷酸序列；基因座DYS527a/b的擴(kuò)增引物相同，為SEQIDNo.39至SEQIDNo.40的核苷酸序列；基因座DYS617，Amelogenin的擴(kuò)增引物分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.41至SEQIDNo.44的核苷酸序列。1、獲得含上述192個(gè)男性個(gè)體DNA的192份血卡作為實(shí)驗(yàn)樣本，并使用標(biāo)準(zhǔn)DNA9948作為陽性對(duì)照樣本。2、利用所述復(fù)合檢測(cè)體系對(duì)上述樣本進(jìn)行25個(gè)基因座的分型，包括：使用所述擴(kuò)增引物對(duì)DNA模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；將擴(kuò)增產(chǎn)物利用遺傳分析儀確定25個(gè)基因座的基因型。具體過程如下：2.1、引物池配置擴(kuò)增引物池的配置，其中所述25個(gè)基因座對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物如上所述；本發(fā)明提供的各種引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成好的引物用1×TE緩沖液稀釋到100μM，將25個(gè)基因座的上下游引物等比混合，得到濃度為50μM的引物。從22管PCR引物中分別取不同體積加入到一個(gè)新的離心管中，作為22重PCR引物池，在該引物池中，各STR位點(diǎn)的引物的終濃度如下表4所示：表4STR基因座終濃度(μmol/L)DYS4600.15DYS389I/II0.3DYS3900.23DYS3920.5Amelogenin0.15DYS4580.2DYS4370.3DYS385a/b0.3GATA-H40.4DYS5220.4DYS4560.15DYS3910.24DYS4470.26DYS4380.32DYS4480.32DYS6170.5DYS3930.15DYS6350.3DYS4390.3DYS190.4DYS4440.36DYS527a/b0.42.2、多重PCR反應(yīng)本實(shí)施例使用9700型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。(1)配置PCRmix(25μL體系)，如下表5所示。表5試劑名稱濃度PCR引物池12.5μLTris-HCl20mMKCl50mMMgCl21.6mM牛血清白蛋白0.8mg/mlTween-200.2％甘油3.2％NaN30.02％dNTP200μMTaqDNA聚合酶2U男性個(gè)體DNA模板卡片0.25mm2總計(jì)25μL(2)擴(kuò)增程序PCR擴(kuò)增過程的熱循環(huán)參數(shù)為：①95℃，11min；②28個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃1min，60℃1min，72℃1min；③60℃，60min；④25℃，保溫。2.3、PCR產(chǎn)物分型待分型樣品的準(zhǔn)備：1.電泳上樣混合物的準(zhǔn)備，按下面比率準(zhǔn)備內(nèi)標(biāo)和去離子甲酰胺組成上樣混合物：10μlTyper500內(nèi)標(biāo)+1000μl去離子甲酰胺，混合均勻。2.每管加入10μl上樣混合物、1μl擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻。3.95℃變性3分鐘，立即放在冰上冷卻3分鐘，之后電泳。ABI3130XL型遺傳分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用ABI3130XLDateCollectionSoftware3.1收集數(shù)據(jù)，GeneMapper3.3軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，獲得所述25個(gè)基因座的基因型。2.4、結(jié)果分析使用本發(fā)明系統(tǒng)對(duì)193份DNA樣品進(jìn)行分型的一個(gè)代表性分型結(jié)果如圖2所示，為了驗(yàn)證分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，從193份DNA樣品中隨機(jī)抽取100份DNA樣品，對(duì)25個(gè)基因座進(jìn)行測(cè)序(北京邁奧德恩生物科技有限公司測(cè)序)，采用本實(shí)施例的復(fù)合檢測(cè)體系獲得的所有的分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果均一致，一致性達(dá)到100％，此結(jié)果證本發(fā)明復(fù)合檢測(cè)體系分型結(jié)果準(zhǔn)確。3、根據(jù)所述男性個(gè)體25個(gè)基因座的基因型獲得該個(gè)體的Y-STR分型結(jié)果，并進(jìn)行父系親屬鑒定。由本實(shí)施例方法獲得的上述193份檢材的父系親屬鑒定結(jié)果，與其已知的個(gè)體父系親屬鑒定結(jié)果一致，說明本發(fā)明方法可以進(jìn)行男性個(gè)體的父系親屬鑒定。進(jìn)一步的，上述25個(gè)基因座的基因型也可以用于對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行家系排查、男女混合樣本中男性成分來源推斷，和/或男男混合樣本中男性成分來源推斷。實(shí)施例2本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)與專利CN103866019中檢測(cè)體系的比較1.本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)與專利CN103866019檢測(cè)體系中針對(duì)各基因座所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增各等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物大小范圍如下：專利CN103866019：本申請(qǐng)(其中圖1顯示了本申請(qǐng)各基因座的擴(kuò)增產(chǎn)物排布圖)：從黑線標(biāo)示可看出，專利CN103866019中DYS460和DYS389II擴(kuò)增產(chǎn)物排布過緊密，會(huì)造成以下兩種問題：?jiǎn)栴}1)、等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(ladder)分型錯(cuò)誤。圖3顯示了使用專利CN103866019系統(tǒng)獲得的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(ladder)的分型圖，可以看出，所示專利CN103866019，基因座DYS438和DYS389II的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物分型錯(cuò)位，DYS438的第一個(gè)峰應(yīng)該是7，紅框標(biāo)示，第一個(gè)峰識(shí)別錯(cuò)誤，由于該錯(cuò)誤導(dǎo)致后續(xù)全部錯(cuò)位。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物分型錯(cuò)誤將必然導(dǎo)致無法對(duì)樣本進(jìn)行正確分型。圖4顯示了使用本申請(qǐng)系統(tǒng)獲得的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(ladder)的分型圖，可以看出，各等位基因位點(diǎn)之間排布均勻，且引物特異性高，可以得到完整的STR分型，峰型尖銳清晰，平衡性好。問題2)、本該是前一個(gè)基因座的分型，卻在下一個(gè)基因座的范圍內(nèi)，無法判讀。比如DYS460的等位基因分布是7,8,9,10,11,12,13(https://yhrd.org/tools/marker/DYS460，YHRD數(shù)據(jù)庫)。我們對(duì)812個(gè)男性樣本的基因座DYS460做了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其中有4個(gè)樣本的分型是13，有兩個(gè)樣本是14,如下表所示。LOCUS:DYS460等位基因分型樣本個(gè)數(shù)頻率810.001291950.2401103280.4040112680.330012140.01721340.00491420.0025GD:0.67對(duì)于專利CN103866019，當(dāng)DYS460出現(xiàn)分型是13時(shí)，對(duì)應(yīng)峰的位置是120bp，14對(duì)應(yīng)124bp。而DYS458的范圍大小是121bp-164bp，所以用專利CN103866019的系統(tǒng)，DYS460等位基因14會(huì)在DYS458的范圍內(nèi)，DYS458出現(xiàn)兩個(gè)峰而無法準(zhǔn)確判斷。DYS460分型為14的樣本會(huì)在圖5所示紅框的位置。因此，對(duì)于DYS460基因座的一些等位基因類型，專利CN103866019系統(tǒng)是無法準(zhǔn)確進(jìn)行分型的。而本申請(qǐng)方案中，由于申請(qǐng)人對(duì)各基因座等位基因的引物，以及特定的基因座的組合和排布進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，使得不存在上述問題，由以上本申請(qǐng)的各等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物大小范圍可知，DYS460等位基因14不會(huì)錯(cuò)誤的出現(xiàn)在下一個(gè)基因座DYS389I的位置上。2.本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)與專利CN103866019檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定性比較申請(qǐng)人經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明的檢測(cè)系統(tǒng)在引物池(引物mix)和PCR緩沖液混合一周以內(nèi)都可以穩(wěn)定的檢測(cè)出各基因座的等位基因，而CN103866019檢測(cè)系統(tǒng)在引物池和PCR緩沖液混合后，至少對(duì)于DYS389II基因座對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)因?yàn)橐镏g形成二聚體而逐漸降低，兩小時(shí)DYS389II基因座會(huì)因?yàn)槠鋽U(kuò)增產(chǎn)物低于檢出限而發(fā)生等位基因分型缺失，如下表所示，等位基因分型成功比例隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷減少，一天以后基本上無法進(jìn)行分型，而本申請(qǐng)系統(tǒng)在放置一周以后仍然能夠?qū)λ械任换蜻M(jìn)行成功分型，上述系統(tǒng)PCR體系均采用常規(guī)的酶和試劑：對(duì)于基因座DYS389II：本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)與專利CN103866019檢測(cè)系統(tǒng)相比，具有高的檢測(cè)穩(wěn)定性，能夠更為準(zhǔn)確，完整的獲得男性個(gè)體基因座各等位基因的分型，能為后續(xù)的對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行家系排查、父權(quán)親權(quán)鑒定、男女混合樣本中男性成分的檢測(cè)及多個(gè)男性混合樣本中男性成分的檢測(cè)提供準(zhǔn)確、完整的數(shù)據(jù)。序列表<110>公安部物證鑒定中心<120>一種對(duì)男性個(gè)體進(jìn)行Y-STR分型的方法和系統(tǒng)<130>160616GF<160>44<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1cgaggaatctgacacctc18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2gcattccatatcatctatc19<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3atcttctgtatccaactctc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4ggcttatccctgagtagcag20<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5cgataatattttacacatttt21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6cagggtgacagtaaaatgaa20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7aatcagacccagttgatgcaa21<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8agacgctccaaaggaccca19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9aactcagcaacaggaatga19<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10ctatggttctggcattacaag21<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11gactatgggcgtgagtgcat20<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12aaacagaggaagaccctgtcattc24<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13ctgaagagctagacaccat19<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14atcgcattccaattacatagt21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15ttagcactttcagcacatcac21<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16gactctttcctctgatggtg20<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17gcccatccaaatcattcataat22<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>18agccggtgctggaagacaga20<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>19atcgttgggaccttgtgataatg23<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>20attagggttctctagagggacag23<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>21gctgttccctattcattcaatcat24<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>22ctatagggagacggaataaaa21<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>23attcgtgttatctctgcctt20<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>24tgactggtgtgtcacagcatg21<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>25agtccatgacagctgatgc19<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>26gtggcagacgcctataatcc20<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>27tgacgttgtcaaagagcttcaa22<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>28tttattccgctgtgttggaga21<210>29<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>29gctggagtcattcctaatgtgg22<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>30aaactttgaggtatgtctcata22<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>31ctgtcatggaatgctctcttg21<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>32aatctgcccaaatatcca18<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>33atgctcgagttgttatgg18<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>34ctgaagtggcttggaattc19<210>35<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>35ctagcgtcaatctctgcacctg22<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>36ctgaatgactactgagtttct21<210>37<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>37atgtgtatgaaaggtgtgaacca23<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>38tgtacggctgtctaagggatc21<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>39gtcgttatcgcaaacatag19<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>40gatgcattctaggaagatta20<210>41<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>41tgtaggcaggttttatggagg21<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>42agtccgggagtgatagcattag22<210>43<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>43cctgggctctgtaaagaatagtg23<210>44<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>44agagcttaaactgggaagctg21當(dāng)前第1頁1 2 3