大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)引物、試劑盒和檢測(cè)方法與流程

本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)引物、試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
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化妝品含有營(yíng)養(yǎng)豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、無機(jī)鹽等，極利于微生物的生長(zhǎng)和繁殖。微生物生長(zhǎng)繁殖可引起化妝品腐敗變質(zhì)，還可產(chǎn)生毒素或代謝產(chǎn)物。這些異物作為變應(yīng)原或刺激原可能會(huì)對(duì)使用部位產(chǎn)生致敏或刺激作用，引起各類型化妝品皮膚病，例如接觸性皮炎、痤瘡、毛發(fā)損害、光感性皮炎和皮膚色素異常等，因此，《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)中規(guī)定，每克或每毫升產(chǎn)品中不得檢出糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，其中大腸桿菌是糞大腸菌群中與人類生活密切相關(guān)的一種菌，為人和溫血?jiǎng)游锬c道中的正常寄生細(xì)菌，作為糞便污染的最佳指示菌，大腸桿菌檢出的意義最大。

目前，檢測(cè)化妝品中病原細(xì)菌的方法主要是細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)，通常需經(jīng)富集培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生理生化鑒定等過程，操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，而且一次只能檢測(cè)一種病原細(xì)菌，難以滿足快速檢測(cè)的需求。而以PCR技術(shù)為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，通過特異引物在熱循環(huán)儀中對(duì)靶標(biāo)基因片段進(jìn)行指數(shù)倍增。信號(hào)放大，已成為病原菌快速檢驗(yàn)的理想之選。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的一種新型DNA擴(kuò)增技術(shù)，是在同一反應(yīng)體系中同時(shí)加入多對(duì)引物擴(kuò)增多條目的DNA片段，采用這一技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)，該技術(shù)在食品、飲用水中已有應(yīng)用，但在化妝品領(lǐng)域較少見，因此，迫切需要建立快速、高效、可同時(shí)檢測(cè)多種病原微生物的化妝品微生物檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明利用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的特異性鑒別基因，分別設(shè)計(jì)了特異性引物，采用多重PCR技術(shù)對(duì)3種病原菌進(jìn)行快速檢測(cè)。通過對(duì)多重PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化，開發(fā)了針對(duì)化妝品中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒；同時(shí)，結(jié)合前處理技術(shù)，建立了檢測(cè)準(zhǔn)確，高效的檢測(cè)方法。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)引物，其特征在于，所述的多重PCR檢測(cè)引物如下所示：針對(duì)大腸桿菌phoA基因：phoA-F：5'-GTTTCTACCGCAGAGTTG-3'，phoA-R：5'-GACTATGACCAGCGTGTT-3'；針對(duì)銅綠假單胞菌oprL基因：oprL-F：5'-GGCGTGCTGATGCTCGTA-3'，oprL-R：5'-CGCTGACCGCTGCCTTTC-3'；針對(duì)金黃色葡萄球菌nuc基因：nuc-F：5'-ACATAAAGAACCTGCGAC-3'，nuc-R：5'-CATTTTTCCATCAGCATA-3'。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的多重PCR檢測(cè)試劑盒包含權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測(cè)引物。

所述的多重PCR檢測(cè)試劑盒還包括含Mg²⁺的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP和Taq DNA聚合酶。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述的多重PCR檢測(cè)引物或多重PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種化妝品中大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：a)對(duì)待測(cè)的化妝品樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后提取細(xì)菌的基因組DNA作為模板；b)利用權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測(cè)引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；c)檢測(cè)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷化妝品樣品中是否存在大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

所述的步驟a)所述的對(duì)待測(cè)的化妝品樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)具體為將待測(cè)的化妝品樣品接種到SCDLP增菌液中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，所述的SCDLP增菌液為：每升含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、NaCl 5g、K₂HPO₄ 2.5g、葡萄糖3g、組氨酸4g、硫乙醇酸鈉1g、卵磷脂2g和吐溫-80 10g，余量為蒸餾水，pH7.2～7.3。

所述的多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：DNA模板1pg～100ng、含Mg²⁺的10×緩沖溶液10mM、dNTP 0.2mM、Taq DNA聚合酶1.0U、上述的多重PCR檢測(cè)引物phoA-F、phoA-R、oprL-F、oprL-R、nuc-F和nuc-R各0.5μM，加ddH₂O至總體積為25μL；所述的多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性50s、54℃退火40s、72℃延伸1min20s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

本發(fā)明的通過組合大腸桿菌堿性磷酸酶基因(phoA基因)、銅綠假單胞菌外膜蛋白基因(oprL基因)和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因(nuc基因)序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，利用該特異性引物按照本發(fā)明的方法對(duì)樣品進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，可一次實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中的大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的特異性檢測(cè)，具有檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高、沒有引物二聚體形成等優(yōu)勢(shì)，三對(duì)引物擴(kuò)增DNA的靈敏度分別為1.59pg/μL、1.69pg/μL、1.34pg/μL。

本發(fā)明提供的針對(duì)化妝品中大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)方法還具備檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比可大大節(jié)省檢測(cè)成本和時(shí)間，提高檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性，具有廣泛的市場(chǎng)應(yīng)用前景，同時(shí)本發(fā)明的檢測(cè)方法中設(shè)置了陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

附圖說明：

圖1是3種病原菌單重PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1～7的模板為大腸桿菌ATCC8039、銅綠假單胞菌ATCC9027和金黃色葡萄球菌ATCC6538的總DNA，1的引物為phoA-F/phoA-R，2的引物為oprL-F/oprL-R，3的引物為nuc-F/nuc-R，4的引物為phoA-F/phoA-R和oprL-F/oprL-R，5的引物為phoA-F/phoA-R和nuc-F/nuc-R，6的引物為oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R，7的引物為phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R，8為空白對(duì)照。

圖2是引物phoA-F/phoA-R的靈敏度和特異性的擴(kuò)增結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1～7的模板為大腸桿菌ATCC8039基因組DNA，1～7的模板終濃度分別為159.15ng/μL、15.915ng/μL、1.59ng/μL、159.15pg/μL、15.915pg/μL、1.59pg/μL和0.159pg/μL，8代表銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa，9代表金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus，10代表惡臭假單胞菌Pseudomonas putida，11代表熒光假單胞菌Pseudomonas Fluorescens，12代表洋蔥伯克霍爾德菌Burkholderia cepacia，13代表表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis，14代表腐生葡萄球菌Staphylococcus saprophytics，15代表嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophilia，16代表肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae，17代表弗氏檸檬酸桿菌Citrobacter freundii，18代表粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens，19代表地衣芽胞桿菌Bacillus lincheniformis，20代表枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。

圖3是引物oprL-F/oprL-R的靈敏度和特異性的擴(kuò)增結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1～7的模板為銅綠假單胞菌ATCC9027基因組DNA，1～7的模板終濃度分別為169.34ng/μL、16.934ng/μL、1.69ng/μL、169.34pg/μL、16.934pg/μL、1.69pg/μL和0.169pg/μL，8代表大腸桿菌Escherichia coli，9～20代表的菌株同圖2。

圖4是引物nuc-F/nuc-R的靈敏度和特異性的擴(kuò)增結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1～7的模板為金黃色葡萄球菌ATCC6538基因組DNA，1～7的模板終濃度分別為134.48ng/μL、13.448ng/μL、1.34ng/μL、134.48pg/μL、13.448pg/μL、1.34pg/μL和0.134pg/μL，8代表大腸桿菌Escherichia coli，9代表銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa，10～20代表的菌株同圖2。

圖5是引物對(duì)phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R對(duì)大腸桿菌ATCC8039、銅綠假單胞菌ATCC9027和金黃色葡萄球菌ATCC6538的總DNA的靈敏度擴(kuò)增的結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1～7的模板終濃度分別為151.23ng/μL、15.123ng/μL、1.51ng/μL、151.23pg/μL、15.123pg/μL、1.51pg/μL和0.151pg/μL，8代表空白對(duì)照。

圖6是檢測(cè)的化妝品中的大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1代表保濕乳，2代表化妝水，3代表面霜，4代表潔面膏，5代表爽膚水，6代表粉底液，7代表精華液，8代表陽(yáng)性對(duì)照，9代表陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：多重PCR檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)與篩選

1、引物設(shè)計(jì)

分別將大腸桿菌堿性磷酸酶基因(phoA基因)、銅綠假單胞菌外膜蛋白基因(oprL基因)和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因(nuc基因)作為特異性檢測(cè)目標(biāo)序列，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，篩選出特異性高的3對(duì)引物如下所示：

針對(duì)大腸桿菌phoA基因：phoA-F：5'-GTTTCTACCGCAGAGTTG-3'(如SEQ ID NO.1所示)，phoA-R：5'-GACTATGACCAGCGTGTT-3'(如SEQ ID NO.2所示)，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為663bp。

針對(duì)銅綠假單胞菌oprL基因：oprL-F：5'-GGCGTGCTGATGCTCGTA-3'(如SEQ ID NO.3所示)，oprL-R：5'-CGCTGACCGCTGCCTTTC-3'(如SEQ ID NO.4所示)，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為444bp。

針對(duì)金黃色葡萄球菌nuc基因：nuc-F：5'-ACATAAAGAACCTGCGAC-3'(如SEQ ID NO.5所示)，nuc-R：5'-CATTTTTCCATCAGCATA-3'(如SEQ ID NO.6所示)，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為274bp。

2、單重PCR靈敏度和特異性實(shí)驗(yàn)

采用合成好的引物對(duì)phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R中的一對(duì)引物、兩對(duì)引物和三對(duì)引物分別對(duì)大腸桿菌ATCC8039、銅綠假單胞菌ATCC9027和金黃色葡萄球菌ATCC6538三株菌株等量混合后提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出663bp、444bp和274bp的特異性片段，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致(圖1)。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：濃度為10ng/μL的DNA模板1μL、含Mg²⁺的10×緩沖溶液10mM(終濃度)、dNTP 0.2mM(終濃度)、Taq DNA聚合酶1.0U、上下游引物各0.5μM(終濃度)，加ddH₂O至總體積為25μL；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性50s、54℃退火40s、72℃延伸1min20s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

2.1單重PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)

以大腸桿菌ATCC8039基因組DNA作為DNA模板，按照終濃度分別為159.15ng/μL、15.915ng/μL、1.59ng/μL、159.15pg/μL、15.915pg/μL、1.59pg/μL和0.159pg/μL進(jìn)行添加，利用引物對(duì)phoA-F/phoA-R按照上述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。

以銅綠假單胞菌ATCC9027基因組DNA作為DNA模板，按照終濃度分別為169.34ng/μL、16.934ng/μL、1.69ng/μL，169.34pg/μL、16.934pg/μL、1.69pg/μL和0.169pg/μL進(jìn)行添加，利用引物對(duì)oprL-F/oprL-R按照上述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。

以金黃色葡萄球菌ATCC6538基因組DNA作為DNA模板，按照終濃度分別為34.48ng/μL、13.448ng/μL、1.34ng/μL、134.48pg/μL、13.448pg/μL、1.34pg/μL和0.134pg/μL進(jìn)行添加，利用引物對(duì)nuc-F/nuc-R按照上述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明：引物對(duì)phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R的靈敏度分別為1.59pg/μL、1.69pg/μL、1.34pg/μL(圖2～4)。

2.2單重PCR特異性實(shí)驗(yàn)

分別采用引物對(duì)phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R，按照上述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別對(duì)從污染化妝品中分離出的11株污染菌株(惡臭假單胞菌，熒光假單胞菌，洋蔥伯克霍爾德菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，嗜麥芽窄食單胞菌，肺炎克雷伯氏菌，弗氏檸檬酸桿菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，地衣芽胞桿菌，枯草芽孢桿菌)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均未擴(kuò)增出條帶(圖2～4)，說明上述三對(duì)引物對(duì)大腸桿菌ATCC8039、銅綠假單胞菌ATCC9027和金黃色葡萄球菌ATCC6538這3種病原菌有良好的檢測(cè)特異性和準(zhǔn)確性。

3、多重PCR檢測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)

將大腸桿菌ATCC8039、銅綠假單胞菌ATCC9027和金黃色葡萄球菌ATCC6538三株菌株等量混合后提取總DNA作為DNA模板，按照終濃度分別為151.23ng/μL、15.123ng/μL、1.51ng/μL、151.23pg/μL、15.123pg/μL、1.51pg/μL和0.15pg/μL進(jìn)行添加，同時(shí)采用三對(duì)引物phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R按照上述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件(步驟2)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。結(jié)果采用上述三對(duì)引物擴(kuò)增的靈敏度均為1.51pg/μL(圖5)。

實(shí)施例2：化妝品中3種致病菌的檢測(cè)

(1)人工污染樣品的制備：某公司送檢的七個(gè)不同類型的化妝品樣品，分別為保濕乳、化妝水、面霜、潔面膏、爽膚水、粉底液和精華液，采用《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007版)中微生物檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)微生物污染，進(jìn)行人工隨機(jī)病原菌污染，保濕乳中加入大腸桿菌ATCC8039和銅綠假單胞菌ATCC9027，化妝水中加入銅綠假單胞菌ATCC9027和金黃色葡萄球菌ATCC6538，面霜中加入大腸桿菌ATCC8039和金黃色葡萄球菌ATCC6538，潔面膏中加入大腸桿菌ATCC8039、銅綠假單胞菌ATCC9027和金黃色葡萄球菌ATCC6538，爽膚水中加入惡臭假單胞菌和腐生葡萄球菌，粉底液中加入洋蔥伯克霍爾德菌和表皮葡萄球菌，精華液中加入肺炎克雷伯氏菌和弗氏檸檬酸桿菌，由此制備得到各化妝品的人工污染樣品。

(2)樣品的細(xì)菌增菌培養(yǎng)：分別取10g人工污染樣品，加入90mL SCDLP增菌液中(菌懸液中各菌株的終濃度均為10²CFU/mL)，充分混勻后，置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中150rpm培養(yǎng)6h，陰性對(duì)照為100mL SCDLP增菌液，陽(yáng)性對(duì)照為加入大腸桿菌ATCC8039、銅綠假單胞菌ATCC9027和金黃色葡萄球菌ATCC6538的100mL SCDLP增菌液(菌懸液中3株菌株的終濃度均為10²CFU/mL)；SCDLP增菌液的配方為：每升含有蛋白胨20g，牛肉膏3g，NaCl 5g，K₂HPO₄2.5g、葡萄糖2.5g，組氨酸5g，硫乙醇酸鈉1g，卵磷脂2g，吐溫-80 10g，蒸餾水1000mL，調(diào)pH7.2～7.3，121℃高壓滅菌20min。

(3)基因組DNA提取：取上述振蕩培養(yǎng)后的增菌液各10mL，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌3次，采用Magen細(xì)菌DNA提取試劑盒分別提取七個(gè)化妝品的人工污染樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)菌基因組DNA，采用BioSpec-nano超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)多重PCR擴(kuò)增：以步驟(3)提取的基因組DNA為模板，利用引物對(duì)phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：總體積為25μL，濃度為10ng/μL的DNA模板1μL，10×緩沖溶液(含Mg²⁺)10mM，dNTP 0.2mM，Taq DNA聚合酶1.0U，引物phoA-F、phoA-R、oprL-F、oprL-R、nuc-F和nuc-R各0.5μM，加ddH₂O補(bǔ)足至25μL；多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，54℃退火40s，72℃延伸1min20s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL用1.0％瓊脂糖凝膠(含染色劑Gold view)在120V電壓下電泳30min，然后置于Bio-Red凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果(圖6)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明，污染有大腸桿菌ATCC8039、銅綠假單胞菌ATCC9027和金黃色葡萄球菌ATCC6538這3種病原菌中的兩種或三種的化妝品樣品(保濕乳、化妝水、面霜、潔面膏)均能檢出各基因相應(yīng)條帶，而沒有污染這3種病原菌的化妝品樣品(爽膚水、粉底液、精華液)未出現(xiàn)條帶，說明本發(fā)明的多重PCR檢測(cè)引物能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出污染化妝品中的大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

序列表

<110> 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測(cè)中心）

<120> 大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)引物、試劑盒和檢測(cè)方法

<160> 6

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtttctaccg cagagttg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gactatgacc agcgtgtt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcgtgctga tgctcgta 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgctgaccgc tgcctttc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acataaagaa cctgcgac 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catttttcca tcagcata 18