一種菌種固體連續(xù)發(fā)酵結(jié)構(gòu)和設(shè)備及發(fā)酵方法與流程

本發(fā)明屬于發(fā)酵設(shè)備領(lǐng)域，涉及一種發(fā)酵設(shè)備，尤其是一種菌種固體連續(xù)發(fā)酵設(shè)備及方法。

背景技術(shù)：

100多年前，液體深層發(fā)酵得到了長足的發(fā)展并日漸成熟，目前在酶、抗生素工業(yè)生產(chǎn)中有廣泛應(yīng)用。但是這種發(fā)酵方式設(shè)備復(fù)雜、前期投入大，發(fā)酵過程耗能高，如果用于微生物菌種的大規(guī)模發(fā)酵，且用作生產(chǎn)菌種的成本過高。

傳統(tǒng)固體發(fā)酵通常是指微生物生長于不溶于水的基質(zhì)且基質(zhì)上含有不同量的自由水，傳統(tǒng)固體發(fā)酵用設(shè)備也比較簡單，前期投入小。缺點是不能夠連續(xù)生產(chǎn)，且條件不易控制，通常為批次發(fā)酵，后期獲取純化菌種更加困難。上世紀60年代人們提出惰性載體固態(tài)發(fā)酵，微生物在固態(tài)的培養(yǎng)基質(zhì)中生長，這種發(fā)酵方式以惰性載體如蛭石、甘蔗渣為培養(yǎng)基吸附介質(zhì)，打破了固體發(fā)酵以固態(tài)物質(zhì)作為營養(yǎng)來源的培養(yǎng)基形式，初步實現(xiàn)了固態(tài)發(fā)酵的連續(xù)性，但是其應(yīng)用范圍有限，大多數(shù)惰性載體適用范圍很窄，且菌體不能直接收集。如何將現(xiàn)有的固體發(fā)酵設(shè)備生產(chǎn)連續(xù)化和參數(shù)可控化是固體發(fā)酵大規(guī)模應(yīng)用的前提。前人對固體發(fā)酵裝置如何連續(xù)生產(chǎn)做了很多研究。

B.Lonsane曾歸納出九種不同形式的工業(yè)規(guī)模的固體發(fā)酵反應(yīng)器：轉(zhuǎn)鼓式、加蓋盤式、木盒式、傾斜接種盒式、垂直培養(yǎng)盒式、淺盤式、傳送帶式、圓柱式、混合型式。但是固體發(fā)酵過程在固體顆粒物質(zhì)的大小、pH、傳熱、傳質(zhì)等方面的條件難以控制，同時不能夠連續(xù)生產(chǎn)。為了克服以上困難，目前人們的研究集中于如何更好地實現(xiàn)固體發(fā)酵的連續(xù)性和更好的傳質(zhì)、傳熱。

如申請?zhí)枮?00420094421.1的發(fā)明專利公開了一種可進行流水線式生產(chǎn)的多層網(wǎng)帶式固體發(fā)酵設(shè)備，由在一個箱體內(nèi)安裝多層可連續(xù)運行的固體物料輸送裝置，固體物料經(jīng)進料口通過多層輸送裝置到達底部，發(fā)酵完成。這種設(shè)備可以連續(xù)生產(chǎn)，但是這種固體發(fā)酵最主要的問題是傳質(zhì)、傳熱問題，固態(tài)的培養(yǎng)基中的通氣和營養(yǎng)流動受限；此外這種發(fā)酵設(shè)備運行時固態(tài)的物料很難自動均勻的平鋪在傳送裝置上。

申請?zhí)枮?01410757428.0的發(fā)明專利公開了一種淺盤式固體發(fā)酵設(shè)備，該設(shè)備包括罐體、罐體內(nèi)帶孔的固定床、固定床上的淺盤，罐體內(nèi)底部設(shè)有無菌空氣入口和蒸汽管道、外部連接有溫度和濕度的測量調(diào)節(jié)系統(tǒng)、過濾設(shè)備、壓力表。罐體內(nèi)通過無菌空氣增濕或加熱。發(fā)酵完成后在罐內(nèi)直接采取空氣干燥，實現(xiàn)發(fā)酵、干燥在一個罐內(nèi)完成。此發(fā)酵設(shè)備溫度控制比較完善，但是不能連續(xù)生產(chǎn)。

陳洪章等人提出以壓力脈動法為動力源培養(yǎng)進行固體發(fā)酵，通過外界周期性的刺激強化生物反應(yīng)和細胞內(nèi)外物質(zhì)傳遞的過程，并設(shè)計了壓力脈動固體發(fā)酵技術(shù)，傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵技術(shù)通過機械攪拌解決傳質(zhì)、傳熱問題，但這樣會損害菌絲體的生長，壓力脈動通過讓氣相均勻的使固態(tài)基質(zhì)分散，加強供氧與排出CO₂的速度，使固體顆粒起松動作用，為菌絲體的大量繁殖擴充了空間。但是這種發(fā)酵方式不能夠連續(xù)、操作比較繁瑣、無法直接獲取菌體。

綜上所述，固態(tài)發(fā)酵目前無法大規(guī)模應(yīng)用，關(guān)鍵在于難以進行連續(xù)生產(chǎn)、很好的傳熱傳質(zhì)、和參數(shù)可控，而這是采用固態(tài)營養(yǎng)供給帶來的必然結(jié)果，固態(tài)的營養(yǎng)物質(zhì)本身含水量少，難以傳遞物質(zhì)和能量，在生產(chǎn)時參數(shù)難以調(diào)控，所以會出現(xiàn)各種問題限制了固體發(fā)酵的大規(guī)模應(yīng)用。據(jù)此我們可以將營養(yǎng)供給液體化，選一種基質(zhì)作為支持物可以吸附培養(yǎng)基，營養(yǎng)物質(zhì)不再作為支持基質(zhì)，這樣可以增加營養(yǎng)物質(zhì)的流動性和連續(xù)性，固體發(fā)酵的顆粒問題、pH、傳熱、傳質(zhì)也會容易控制。據(jù)此更進一步將菌體的營養(yǎng)供給和菌體生長通過特種生長材料隔離開，培養(yǎng)基不斷更新，菌體生長不斷生長，至一定階段后能夠通過刮取直接獲取菌體，而殘留的菌種可繼續(xù)生長，從而實現(xiàn)可固體發(fā)酵的連續(xù)性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決目前固體發(fā)酵技術(shù)無法連續(xù)生產(chǎn)、傳熱傳質(zhì)困難、參數(shù)難以控制的問題，提供一種菌種固體連續(xù)發(fā)酵設(shè)備及方法，該裝置能夠改變營養(yǎng)供給形式，使固體發(fā)酵能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)、參數(shù)可控、傳熱傳質(zhì)容易的目的。

為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

一種菌種固體連續(xù)發(fā)酵裝置，包括自下而上層疊設(shè)置的生長斜面、供養(yǎng)層和生長層；生長層的上方設(shè)置滴管，滴管與裝有種子液和補料的接種補料瓶的出口相連通，滴管的出口位于生長層的前端，生長層的后端設(shè)置菌體收集裝置；生長斜面的后端高度低于前端。

本發(fā)明進一步的改進在于：

所述生長斜面采用傳送帶或表面設(shè)置有移動刮板的平板，移動刮板能夠沿平板表面運動，將菌體收集至菌體收集裝置中；在平板上接種時，移動刮板靠近生長層，將菌體均勻涂布在生長層上。

所述滴管通過接種補料管道與接種補料瓶的出口相連；滴管上設(shè)置若干滴灌帶。

一種菌種固體連續(xù)發(fā)酵設(shè)備，包括罐體，罐體內(nèi)設(shè)置用于安裝菌種固體連續(xù)發(fā)酵裝置的支架，支架上自下而上依次安裝多層菌種固體連續(xù)發(fā)酵裝置，且每層菌種固體連續(xù)發(fā)酵裝置平行設(shè)置；接種補料瓶安裝于罐體的頂部，蒸汽入口與蒸汽發(fā)生器的蒸汽出口相連，蒸汽發(fā)生器的另一個蒸汽出口與罐體相連；接種補料瓶的種子液出口連接接種補料管道，接種補料管道上設(shè)置若干滴管，每個滴管的出口位于對應(yīng)菌種固體連續(xù)發(fā)酵裝置的前端上方，且與生長層之間留有間隙；菌體收集裝置設(shè)置于罐體的內(nèi)部，且位于多層菌種固體連續(xù)發(fā)酵裝置的后端，并與收集槽相連通；罐體的頂部開設(shè)無菌空氣出口并安裝有壓力表，底部開設(shè)廢液排出口和蒸汽排出口，廢液排出口上設(shè)置廢液收集槽。

其進一步的改進在于：

所述菌體收集裝置包括菌體刮板，菌體刮板上還安裝有菌體收集板，菌體刮板能夠沿豎直方向運動，收集每層菌種固體連續(xù)發(fā)酵裝置上生長的菌體；罐體的底部設(shè)置有開口，當菌體刮板運動至底部時，菌體刮板與菌體收集板組成的腔體與收集槽相連通。

所述罐體上還連接有空氣壓縮機和溫濕度測量儀，空氣壓縮機通過空氣濾膜和溫濕度自動調(diào)節(jié)裝置與罐體相連。

所述罐體內(nèi)側(cè)頂部設(shè)置有可視燈，罐體的側(cè)面還開設(shè)有可視窗。

所述罐體能夠承受的最大壓力為0.3MPa。

一種菌種固體連續(xù)發(fā)酵方法，包括以下步驟：

1)滅菌：

打開蒸汽發(fā)生器，關(guān)閉除蒸汽排出口外的其他通氣口，蒸汽進入接種補料瓶和罐體內(nèi)部，控制蒸汽進入和排出速度，使罐體內(nèi)的壓力維持在0.15MPa，持續(xù)30min，完成滅菌；然后通入無菌空氣，使罐體內(nèi)部維持正壓；

2)接種：

將事先準備好的種子液按照無菌操作要求加入接種補料瓶，接種補料瓶的體積為1L-50L，種子液的體積為10-30ml/m²，與生長層的面積和層數(shù)成正比；生長層的層數(shù)為4～20層，調(diào)節(jié)生長斜面使生長層正對著滴管，滴加種子液的同時勻速轉(zhuǎn)動生長斜面，使生長層上布滿菌種，之后將菌體刮板靠近生長層并勻速轉(zhuǎn)動傳送帶斜面，使菌種均勻涂布在生長層上；

3)補料：

按無菌操作要求加入補料液，補料速度為0.1～0.5L/m²·h，補料液從供養(yǎng)層的頂部到達底部，廢液滴入廢液收集槽，排出罐體；補料過程同通過溫濕度自動調(diào)節(jié)裝置調(diào)節(jié)溫度和濕度，使溫度保持在25～40℃；

4)收集菌種：

當菌體生物量達到要求時，轉(zhuǎn)動傳送帶用菌體刮板將菌體刮下，或者用移動刮板刮取菌體，從而直接獲取菌體；然后將生長斜面轉(zhuǎn)動至初始狀態(tài)，繼續(xù)滴加補料液，使生長層上殘留的菌種繼續(xù)生長，繼續(xù)收集菌體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明固體發(fā)酵能夠連續(xù)：由三層不同的材料組成菌體培養(yǎng)斜面，供養(yǎng)層可以吸附液體培養(yǎng)基，營養(yǎng)物質(zhì)不再作為支持基質(zhì)；生長層能夠吸附液體培養(yǎng)基，且菌種能夠在其表面生長；支持層能夠支撐斜面。菌體的營養(yǎng)供給和菌體生長通過特種生長材料隔離開，培養(yǎng)基不斷更新，菌體生長不斷生長，通過刮取直接獲取菌體，而殘留的菌種可繼續(xù)生長，從而實現(xiàn)可固體發(fā)酵的連續(xù)性。本發(fā)明具有良好的傳熱傳質(zhì)：營養(yǎng)供給液體化可以增加營養(yǎng)物質(zhì)的流動性，菌體與營養(yǎng)物質(zhì)接觸更加充分，熱量和物質(zhì)傳遞比傳統(tǒng)固體發(fā)酵更加有效率。另外，本發(fā)明條件可控：固體發(fā)酵的顆粒問題、pH、溫度更容易控制。傳統(tǒng)固體發(fā)酵溫度、pH、通風(fēng)等條件受制于固態(tài)培養(yǎng)基難以調(diào)控，本發(fā)明采用液體培養(yǎng)基使這些條件得以控制。其次，本發(fā)明菌體收集方便：直接將生長層上的菌體刮取收集，避免使用操作繁瑣且耗能大的大型離心機。最后，本發(fā)明產(chǎn)量可控：菌體生長斜面層數(shù)可以根據(jù)不同生產(chǎn)的需要進行調(diào)節(jié)，能夠?qū)崿F(xiàn)資源的合理利用。

【附圖說明】

圖1為本發(fā)明平板式連續(xù)發(fā)酵裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明傳送帶式連續(xù)發(fā)酵裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明滴管的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為本發(fā)明平板式連續(xù)發(fā)酵設(shè)備的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5為本發(fā)明傳送帶式連續(xù)發(fā)酵設(shè)備的結(jié)構(gòu)示意圖。

其中：1-溫濕度自動調(diào)節(jié)裝置；2-空氣濾膜；3-空氣壓縮機；4-收集槽；5-廢液收集槽；6-支架；7-傳送帶；8-滴管；9-接種補料管道；10-接種補料瓶；11-蒸汽發(fā)生器；12-無菌空氣出口；13-壓力表；14-可視窗；15-菌體收集板；16-菌體刮板；17-溫濕度測量儀；18-可視燈；19-罐體；20-廢液排出口；21-蒸汽排出口；22-移動刮板；23-滴灌帶；24-供養(yǎng)層；25-生長層；26-生長斜面。

【具體實施方式】

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步詳細描述：

參見圖1和圖2，本發(fā)明菌種固體連續(xù)發(fā)酵裝置，包括自下而上層疊設(shè)置的生長斜面、供養(yǎng)層24和生長層25；生長層25的上方設(shè)置滴管8，滴管8與裝有種子液和補料的接種補料瓶10的出口相連通，滴管8的出口位于生長層25的前端，生長層25的后端設(shè)置菌體收集裝置；生長斜面26的后端高度低于前端。生長斜面采用傳送帶7或表面設(shè)置有移動刮板22的平板，移動刮板22能夠沿平板表面運動，將菌體收集至菌體收集裝置中；在平板上接種時，移動刮板22靠近生長層25，將菌體均勻涂布在生長層25上。滴管8通過接種補料管道9與接種補料瓶10的出口相連；滴管8上設(shè)置若干滴灌帶23。

如圖3所示，本發(fā)明菌種固體連續(xù)發(fā)酵設(shè)備。本設(shè)備主體結(jié)構(gòu)分由罐體19、接種補料裝置、生長斜面和菌體收集裝置構(gòu)成。罐體上有無菌空氣出口12、接種補管道9、廢液排出口20，罐體20上有無菌空氣進口外部連接有控溫控濕儀器1、空氣過濾設(shè)備2空氣壓縮機3、蒸汽發(fā)生器11和調(diào)控壓力的閥門及儀表13；培養(yǎng)基只在供養(yǎng)層中循環(huán)，菌體在生長層25上生長。接種補料裝置分接種和補料兩部分，采用滴灌的方式，互相獨立。本發(fā)明裝置設(shè)計簡單，可以直接獲取固體發(fā)酵的菌種。

如圖4所示，本發(fā)明可采用傳送帶7替換平板26，傳送帶7的斜度是30°～60°。

本發(fā)明蒸汽發(fā)生器11與接種補料裝瓶10和罐體19同時連接，可以同時滅菌。滴管8與供養(yǎng)層24和生長層25斜面有適當距離，種子液和補料的滴管8分別在生長層和供養(yǎng)層始端上方。生長層25的始端和末端分別比供養(yǎng)層24短10cm和30cm。供養(yǎng)層24的末端有一段下垂，呈倒三角形狀，在罐體的底部有對應(yīng)的廢液收集槽5，廢液收集槽5的底部與廢液排出口20相連接。

菌體收集裝置由菌體刮板16、菌體收集板15、收集通道和收集槽4組成。菌體刮板16和菌體收集板均固定在一可移動的支架上，可向下移動依次刮取菌體，菌體通過菌體收集板的移動被推入收集管道。菌體刮板16、菌體收集板15、長移動板、短移動板和收集管道組成的空間是密閉的。罐體外部有一可視窗14，頂部有一可視燈18。

本發(fā)明還公開了一種菌種固體連續(xù)發(fā)酵方法，包括以下步驟：

1)滅菌：

打開蒸汽發(fā)生器，關(guān)閉除蒸汽排出口外的其他通氣口，蒸汽進入接種補料瓶和罐體內(nèi)部，控制蒸汽進入和排出速度，使罐體內(nèi)的壓力維持在0.15MPa，持續(xù)30min，完成滅菌；然后通入無菌空氣，使罐體內(nèi)部維持正壓；

2)接種：

將事先準備好的種子液按照無菌操作要求加入接種補料瓶，接種補料瓶的體積為1L-50L，種子液的體積為10-30ml/m²，與生長層的面積和層數(shù)成正比；生長層的層數(shù)為4～20層，調(diào)節(jié)生長斜面使生長層正對著滴管，滴加種子液的同時勻速轉(zhuǎn)動生長斜面，使生長層上布滿菌種，之后將菌體刮板靠近生長層并勻速轉(zhuǎn)動傳送帶斜面，使菌種均勻涂布在生長層上；

3)補料：

按無菌操作要求加入補料液，補料速度為0.1～0.5L/m²·h，補料液從供養(yǎng)層的頂部到達底部，廢液滴入廢液收集槽，排出罐體；補料過程同通過溫濕度自動調(diào)節(jié)裝置調(diào)節(jié)溫度和濕度，使溫度保持在25～40℃；

4)收集菌種：

當菌體生物量達到要求時，轉(zhuǎn)動傳送帶用菌體刮板將菌體刮下，或者用移動刮板刮取菌體，從而直接獲取菌體；然后將生長斜面轉(zhuǎn)動至初始狀態(tài)，繼續(xù)滴加補料液，使生長層上殘留的菌種繼續(xù)生長，繼續(xù)收集菌體。

實施例1

以大腸桿菌菌體生產(chǎn)為例，固體發(fā)酵罐生長斜面層數(shù)為4層，采用傳送帶式生長斜面。將大腸桿菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，在搖瓶中37℃培養(yǎng)24h，種子液的體積為10ml/m²。將種子液按照無菌操作要求加入接種補料罐10右側(cè)罐體，調(diào)節(jié)傳送帶斜面使生長層正對著滴管8，滴加種子液的同時勻速轉(zhuǎn)動傳送帶斜面7，使生長層上布滿菌種，之后將菌體刮板16靠近生長層并勻速轉(zhuǎn)動傳送帶斜面，使菌種均勻涂布在生長層上。按無菌操作要求加入補料液，補料速度為0.4L/m²·h，補料液通過供養(yǎng)層，從傳送帶頂部到達底部，這時其營養(yǎng)利用完全，廢液滴入廢液收集槽5，排出罐體。補料過程同時也是菌體生長的過程，當菌體生物量達到要求時，將菌體刮板16靠近生長層并勻速轉(zhuǎn)動傳送帶斜面，刮板16將菌體刮下，將菌體聚集到一起，從而直接獲取了菌體。將斜面轉(zhuǎn)動至初始狀態(tài)，繼續(xù)滴加補料液，使生長層25上殘留的菌種繼續(xù)生長，繼續(xù)收集菌體，從而實現(xiàn)固體發(fā)酵的連續(xù)性和可控性。

實施例2

以納豆桿菌菌體生產(chǎn)為例，固體發(fā)酵罐生長斜面層數(shù)為20層，采用板式生長斜面。將納豆桿菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，搖瓶中37℃培養(yǎng)24h，種子液的體積為40ml/m²。將種子液按照無菌操作要求加入接種補料罐10右側(cè)罐體，滴加完種子液后，將菌體刮板靠近生長層并勻速移動，使菌種均勻涂布在生長層上。按無菌操作要求加入補料液，補料速度為為0.3L/m²·h，補料液通過供養(yǎng)層，從傳送帶頂部到達底部，這時其營養(yǎng)利用完全，廢液滴入廢液收集槽5，排出罐體。補料過程同時也是菌體生長的過程，當菌體生物量達到要求時，移動刮板16將釀酒酵母菌體刮下，將菌體聚集到一起，從而直接獲取了菌體。將斜面轉(zhuǎn)動至初始狀態(tài)，繼續(xù)滴加補料液，使生長層25上殘留的菌種繼續(xù)生長，繼續(xù)收集菌體，從而實現(xiàn)固體發(fā)酵的連續(xù)性和可控性。

實施例3

以釀酒酵母菌體生產(chǎn)為例，固體發(fā)酵罐生長斜面層數(shù)為10層，采用板式生長斜面。將釀酒酵母接種至YPD液體培養(yǎng)基中，搖瓶中28℃培養(yǎng)24h，種子液的體積為30ml/m²。將種子液按照無菌操作要求加入接種補料罐10右側(cè)罐體，滴加完種子液后，將菌體刮板靠近生長層并勻速移動，使菌種均勻涂布在生長層上。按無菌操作要求加入補料液，補料速度為0.3/m²·h，補料液通過供養(yǎng)層，從傳送帶頂部到達底部，這時其營養(yǎng)利用完全，廢液滴入廢液收集槽5，排出罐體。補料過程同時也是菌體生長的過程，當菌體生物量達到要求時，移動刮板16將釀酒酵母菌體刮下，將菌體聚集到一起，從而直接獲取了菌體。將斜面轉(zhuǎn)動至初始狀態(tài)，繼續(xù)滴加補料液，使生長層25上殘留的菌種繼續(xù)生長，繼續(xù)收集菌體，從而實現(xiàn)固體發(fā)酵的連續(xù)性和可控性。

以上內(nèi)容僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動，均落入本發(fā)明權(quán)利要求書的保護范圍之內(nèi)。