毛果楊PtrZFP103基因及其編碼蛋白和應用的制作方法

本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，具體涉及毛果楊PtrZFP103基因及其編碼蛋白和應用。
背景技術：
：森林為社會、生態(tài)和經(jīng)濟等提供了利益，但隨著氣候不斷變化樹木經(jīng)歷干旱、高鹽和高溫等脅迫，這些導致它們受到干擾致使死亡。溫度、昆蟲、病原體和高鹽等環(huán)境變化被預計為導致森林廣泛死亡現(xiàn)象的主要因素。所以培育出抗鹽的林木品種對改善森林結構具有重要意義。傳統(tǒng)的雜交育種需要優(yōu)良品種作為主要資源，由于林木生長周期長、遺傳機理不明確等致使獲得抗逆新品種的時間長而且效率很低，難以滿足不同目的定向培育樹木新品的要求。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展、基因工程和分子育種等手段的興起，研究植物抗逆調(diào)控機制鑒別出參與抗逆的重要功能性基因，并通過轉基因方法改良植物抗逆性已經(jīng)成為林木新品種培育更為有效的方法和途徑。毛果楊作為一個遺傳背景清楚的模式植物，為林木遺傳改良提供了很好的原材料。轉錄因子通過調(diào)控相關基因的表達參與植物生長發(fā)育、信號傳導、逆境脅迫應答等反應。單個基因表達量的增加并不能從根本上改良植物的抗逆能力，而多個基因表達的增強可以提高植物對多種不良環(huán)境的抵抗性。轉錄因子能對脅迫信號做出應答，通過與其啟動子中特異且保守的順式作用元件發(fā)生結合，激活或抑制下游基因表達。轉錄因子可以調(diào)控多個與同類性狀有關的基因的表達，因此，研究抗逆相關的轉錄因子的調(diào)控機制對于提高植物抗逆性具有重要意義。鋅指蛋白(zincfingerprotein)是一個龐大的轉錄因子家族，根據(jù)鋅指的保守基序特點，可將含鋅指結構域的轉錄因子分為C2H2、C4HC3、C3HC4、C2HC5、C3H等亞類，其中以C2H2型最多，為經(jīng)典鋅指模體結構。鋅指蛋白轉錄因子在植物生長發(fā)育、形態(tài)建成以及非生物和生物脅迫等逆境應答中起著不同的調(diào)控作用。研究表明，C2H2型鋅指蛋白主要有兩方面的功能，一是調(diào)控各個時期植物的生長發(fā)育，二是調(diào)控環(huán)境脅迫下基因的表達。已經(jīng)從擬南芥、矮牽牛、小麥、大麥、大豆等作物中分離到多個C2H2型鋅指蛋白基因,廣泛地參與植物生長發(fā)育和脅迫應答反應。從擬南芥中克隆了一個能編碼C2H2型鋅指蛋白的STZ基因，將該基因轉入煙草明顯提高植株對冷及高鹽條件的耐受力。將鋅指蛋白基因ZFP245和ZFP179轉入水稻，提高了植物在干旱脅迫下存活率和耐鹽能力。從大豆中克隆得到C2H2型鋅指蛋白基因SCOF-1和GsZFP1受低溫誘導表達。在矮牽牛中獲得的鋅指蛋白基因ZPT2-3，轉入該基因的煙草對干旱的耐受能力也得到明顯提高。因此，選擇毛果楊為材料，分離、鑒定C2H2型鋅指蛋白轉錄因子并分析其抗逆功能，對林木分子育種的新品種培育方面具有重要的理論及實際意義。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供毛果楊PtrZFP103基因及其編碼蛋白和應用。本發(fā)明中毛果楊PtrZFP103基因的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。本發(fā)明中毛果楊PtrZFP103基因編碼蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。本發(fā)明中毛果楊PtrZFP103基因的應用是指在提高植物在高鹽脅迫下抗逆能力上的應用。本發(fā)明公開了毛果楊中的PtrZFP103轉錄因子的應用，本發(fā)明利用農(nóng)桿菌介導法在擬南芥中過表達該基因，獲得的擬南芥轉基因株系有效地提高了植物對高鹽脅迫下的耐受性的特征。在高鹽脅迫下對PtrZFP103轉基因擬南芥株系和WT(野生型擬南芥株系)的細胞的受損情況、生理指標進行了觀察，發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫下轉基因株系細胞受損程度明顯低于WT并且生理指標的結果也驗證了PtrZFP103基因的過表達株系抗逆能力明顯高于WT。通過本發(fā)明發(fā)現(xiàn)PtrZFP103特異性的提高植物在高鹽脅迫下的抗性，可培育出抗高鹽的轉PtrZFP103基因的新品種，對林木分子育種的新品種培育方面具有重要的理論及實際意義。附圖說明圖1為本發(fā)明中毛果楊RNA電泳圖；圖2為本發(fā)明中毛果楊PtrZFP103基因PCR產(chǎn)物的膠回收電泳圖，其中M為DL2000DNAMarker，1為PCR產(chǎn)物；圖3為本發(fā)明中實時熒光定量PCR分析在NaCl脅迫下毛果楊根和葉片中PtrZFP103基因的表達量，其中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d；圖4為本發(fā)明中實時熒光定量PCR分析在Mannitol脅迫下毛果楊根和葉片中PtrZFP103基因的表達量，其中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d；圖5為本發(fā)明中實時熒光定量PCR分析在ABA脅迫下毛果楊根和葉片中PtrZFP103基因的表達量，其中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d；圖6為本發(fā)明中實時熒光定量PCR分析在SA脅迫下毛果楊根和葉片中PtrZFP103基因的表達量，其中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d；圖7為本發(fā)明中實時熒光定量PCR分析在MeJA脅迫下毛果楊根和葉片中PtrZFP103基因的表達量，其中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d；圖8為本發(fā)明中PtrZFP103過表達載體轉入農(nóng)桿菌中PCR電泳檢測圖，M為DL2000DNAMarker，1-3為PtrZFP103基因；圖9為本發(fā)明中PtrZFP103基因的亞細胞定位分析；圖10為本發(fā)明中PtrZFP103轉基因擬南芥在添加卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基中篩選情況；圖11為本發(fā)明中具有卡那霉素抗性的T0代PtrZFP103轉基因擬南芥在基因組水平上的PCR檢測，M為DL2000DNAMarker，+為陽性對照，-為陰性對照，1～12為轉基因植株；圖12為本發(fā)明中PtrZFP103轉基因擬南芥陽性植株的轉錄水平上的PCR檢測，M為DL2000DNAMarker，+為陽性對照，-為陰性對照，1～12為轉基因植株；圖13為本發(fā)明中在不同濃度的NaCl脅迫下WT和PtrZFP103轉基因擬南芥的萌發(fā)率比較圖；圖14為本發(fā)明中WT和PtrZFP103轉基因擬南芥種在1/2MS培養(yǎng)基和含100mMNaCl培養(yǎng)基中生長11天的根部生長情況對比圖；圖15為本發(fā)明中用300mMNaCl溶液分別澆灌轉基因和野生型擬南芥土培苗0h、24h和72h后取其葉片進行的NBT(NitroblueTetrazolium,硝基四氮唑藍)染色圖；圖16為本發(fā)明中生長4周的野生型和轉基因擬南芥土培苗在經(jīng)300mMNaCl脅迫0h、24h、72h后取其葉片進行DAB(Diaminobenzidine,二氨基苯胺)染色圖；圖17為本發(fā)明中野生型和轉基因擬南芥土培苗生長4周后經(jīng)300mMNaCl脅迫0h、24h、72h后取其葉片進行EvansBlue(伊文思藍)染色圖；圖18為本發(fā)明中在NaCl脅迫下WT和PtrZFP103轉基因擬南芥植株MDA含量測定圖，其中表示W(wǎng)T，表示Line1，表示Line2，表示Line3；圖19為本發(fā)明中在NaCl脅迫下WT和PtrZFP103轉基因擬南芥植株SOD活性測定圖，其中表示W(wǎng)T，表示Line1，表示Line2，表示Line3；圖20為本發(fā)明中在NaCl脅迫下WT和PtrZFP103轉基因擬南芥植株POD活性測定圖，其中表示W(wǎng)T，表示Line1，表示Line2，表示Line3。具體實施方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。具體實施方式一：本實施方式毛果楊PtrZFP103基因的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。本實施方式中毛果楊PtrZFP103基因的編碼區(qū)全長序列507bp。具體實施方式二：本實施方式毛果楊PtrZFP103基因編碼蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。本實施方式毛果楊PtrZFP103基因的編碼蛋白由168個氨基酸組成。具體實施方式三：本實施方式毛果楊PtrZFP103基因的應用是指在提高植物在高鹽脅迫下抗逆能力上的應用。以下實施例中如無特別說明均為常規(guī)方法。所使用的材料、試劑、酶、感受態(tài)細胞何質(zhì)粒等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。1.毛果楊PtZFP103基因的獲得以及表達特性分析如下：1.1目的基因的克隆1.1.1目的基因序列的獲得在目的基因序列兩端設計引物如表1。表1本發(fā)明用于目的基因克隆的引物序列利用CTAB法提取毛果楊(Populustrichocarpa(Torr.&Gray))雌株無性系Nisqually1總RNA，如圖1并且反轉錄成cDNA。以此cDNA為模板，使用LATaq酶體系進行目的基因的克隆，反應條件為：95℃預變性3min；95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸48s，循環(huán)數(shù)為35；最后72℃延伸7min，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR體系如表2。表2本發(fā)明用于目的基因克隆PCR反應體系1.1.2.目的基因連接T載體測序?qū)δ康钠萎a(chǎn)物進行膠回收如圖2，將回收產(chǎn)物連接到T載體，熱激法大腸桿菌轉化后進行藍白斑篩選，將挑取10個白色菌落進行擴大培養(yǎng)PCR檢測，提取陽性質(zhì)粒后進行測序。經(jīng)檢測，核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，將該基因片段命名為PtrZFP103，由507bp個堿基組成。其編碼具有序列表中SEQIDNO：2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。1.2毛果楊PtrZFP103基因表達特性分析(qRT-PCR)1.2.1.引物設計設計PtrZFP103基因特異性引物103F、103R及Actin內(nèi)參引物ActinF、ActinR，如表3。表3本發(fā)明用于基因表達特異性分析的引物序列1.2.2.實時熒光定量PCR分析取生長健壯毛果楊組培苗，分別對其進行200mMNaCl、200mMmannitol、200μMABA、100μMSA和200μMMeJA脅迫處理，處理時間為0h、3h、6h、12h、24h；取下各個樣品的根和葉，提取RNA并反轉錄為模板，進行實時熒光定量PCR，反應體系如表4：表4本發(fā)明用于實時熒光定量PCR反應體系按兩步法反應程序進行擴增：94℃預變性30s，94℃變性5s，60℃退火及延伸15s，78℃讀板1s，循環(huán)數(shù)為45。將得到的數(shù)據(jù)輸入Excel中，分析數(shù)據(jù)并使用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)計算，做圖(如圖3-200mMNaCl，圖4-200mMMannitol，圖5-200μMABA，圖6-100μSA，圖7-200MmMeJA，圖中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d)。結果表明該基因在NaCl脅迫下根和葉都有上調(diào)表達的趨勢，推測在鹽脅迫下，這個基因可能參與植物的調(diào)控作用。2.轉基因手段分析PtrZFP103基因功能2.1設計引物設計構建過表達載體的帶有酶切位點的引物及載體檢測引物，如表5。表5本發(fā)明用于構建過表達載體的引物序列引物用途引物名稱引物序列(5’-3’)過表達載體構建ZFP103FGCTCTAGACATGGATTTCCAACCAAACAC過表達株系檢測ZFP103RGCGTCGACTAAGCCTTAAAGACAAATCTA2.2實驗方法2.2.1pBI121-PtrZFP103-GFP過表達載體構建PtrZFP103基因以ZFP103F和ZFP103R為引物擴增后，產(chǎn)物選取了SalI和XbaI兩個酶切位點構建到表達載體pBI121-GFP(購買得到的)上。經(jīng)PCR后電泳、雙酶切及測序檢測后，確定載體構建成功。2.2.2農(nóng)桿菌介導的擬南芥遺傳轉化將克隆pBI121-PtrZFP103-GFP載體轉化到EHA105農(nóng)桿菌細胞中，28℃培養(yǎng)2天。挑取單克隆農(nóng)桿菌到5ml50mg/LKan和50mg/LRif的LB液體培養(yǎng)基中，28℃進行小搖，第二天將500μL小搖的菌液加入250mL50mg/LKan的LB液體中28℃至菌液OD600為0.8～1.0，將菌液放入滅菌離心管4000rpm，4℃離心8min，用相同體積的5％(5g蔗糖/100mL水)的蔗糖水對菌液進行重懸，加入SilwetL-77，加入量為每100mL加入20μL，然后作為侵染工程菌液。選取培養(yǎng)1個月生長健壯、高4-6cm和具有大量的半開的花苞和極少數(shù)的果莢的擬南芥，將花苞在菌液中侵染3-5s，取出花苞用吸水紙吸去多余菌液，用保鮮膜包裹放入暗處16h-24h。等到擬南芥角果發(fā)黃，收集T0代種子，在37℃烘干24h，室溫48h，放入4℃冰箱一周后備用。2.2.3PtrZFP103基因的亞細胞定位將pBI121-PtrZFP103-GFP質(zhì)粒和pBI121-GFP制備成DNA微彈，利用基因槍的方法打入新鮮洋蔥的第4～7層鱗莖內(nèi)表皮即使用基因槍瞬時轉化洋蔥細胞，利用激光共聚焦顯微鏡顯微鏡觀察其亞細胞定位。2.2.4轉基因擬南芥的PCR檢測分別以野生型(WT)和轉基因擬南芥為材料，CTAB法提取擬南芥基因組DNA，方法參照實施例一。以pBI121-GFP為陽性對照，以WT的總DNA為陰性對照，對篩選的轉化植株進行PCR檢測。2.2.5轉基因擬南芥的多種脅迫將轉PtrZFP103基因的擬南芥T3代line1，line2，line3和WT(野生型擬南芥株系)的種子在20％的次氯酸鈉溶液中消毒20min，最后用滅菌的蒸餾水漂洗5-6次，種入1/2MS培養(yǎng)皿和分別含有75mM、100mM、125mM、150mMNaCl的1/2MS培養(yǎng)基中，將其放置到溫度22±2℃、光照強度80-100μmol·m-2·s-1、光周期16h/8h(日/夜)的人工培養(yǎng)室中培養(yǎng)12天，觀察種子萌發(fā)率。2.3結果與分析2.3.1PtrZFP103過表達載體轉入農(nóng)桿菌將本實施例實驗方法2.2.1中所說PCR檢測和雙酶切后編號測序，選取結果較好的序號電轉農(nóng)桿菌。涂板28℃培養(yǎng)后挑取單克隆搖菌PCR檢測，跑電泳，結果如圖8所示。從圖中可以看出，在507bp處有條帶，說明已將中間表達載體已經(jīng)導入到農(nóng)桿菌中。將陽性菌落存菌。2.3.2PtrZFP103基因的亞細胞定位將打完基因槍的洋蔥表皮附在載玻片上在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照如圖9，發(fā)現(xiàn)PtrZFP103基因定位于細胞核上。2.3.3PtrZFP103基因過表達株系的篩選T3代轉基因株系的獲得在含有50mg/L的卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基中種入T0種子進行篩選有抗性的植株第一代，在7d左右，沒有轉入目的基因的植株根系較短，葉片發(fā)黃，未能長出四片真葉，甚至死亡。而轉化的植株，根系較發(fā)達，可以長出真葉，在培養(yǎng)基中正常生長(圖10)。繼續(xù)收獲種子為T1代。繼續(xù)進行卡那霉素篩選，直到T3代種子收獲。這時轉基因植株為純合株系可以用于后期實驗的研究。2.3.4PtrZFP103轉基因擬南芥的PCR檢測2.3.4.1PtrZFP103轉基因擬南芥基因組水平上的PCR鑒定以提取的基因組DNA為模板，用PtrZFP103的特異性引物(表3)，以pBI121-GFP為陽性對照、WT(野生型擬南芥)為陰性對照進行PCR檢測，轉基因植株可以擴增出特異性條帶長度為507bp，但WT中未出現(xiàn)特異性的條帶(圖11)，可以初步得出結論，植株的轉化成功。2.3.4.2PtrZFP103轉基因擬南芥RNA水平上的PCR鑒定進一步對轉基因植株分析，將DNA水平上有條帶的12個轉化植株提取高質(zhì)量的RNA為模板，反轉錄成cDNA，再以其為模板進行PCR檢測。PCR出的特異條帶與質(zhì)粒PCR出的特異條帶在一條線上為507bp(圖12)，進一步證明PtrZFP103基因已經(jīng)進行了轉錄。2.3.5轉基因擬南芥的抗逆能力篩選用同樣的轉基因擬南芥株系(line1、line2和line3)T3代種子和非轉基因?qū)φ諗M南芥(WT)株系進行種子萌發(fā)率的實驗，種子消毒后，用200μL的移液槍在含有各種脅迫的1/2MS培養(yǎng)基中分別點入一定數(shù)量的種子，光照培養(yǎng)7d后在CuSO4、ZnSO4、CdCl2、NaCl和甘露醇等條件下，觀察各種脅迫下的萌發(fā)率，發(fā)現(xiàn)結果表明：在NaCl條件下，三個轉基因株系T3代種子萌發(fā)率在各個梯度條件下明顯高于野生型的種子，說明了這個基因特異性的提高了轉基因株系的抗鹽的能力(如圖13)。3.鹽脅迫下轉基因擬南芥的抗逆性分析以及細胞受損情況研究3.1植物材料轉基因擬南芥(line1、line2和line3)T3代種子以及非轉基因?qū)φ諗M南芥(WT)種子，以下實驗至少重復三次。3.2實驗方法3.2.1鹽脅迫下轉基因擬南芥的抗逆性分析將轉PtrZFP103基因的擬南芥T3代的種子消毒種入1/2MS培養(yǎng)皿和含有NaCl的1/2MS培養(yǎng)基中，觀察萌發(fā)率。將生長在1/2MS培養(yǎng)基5-8d后的擬南芥放入脅迫條件100mMNaCl下觀察幼苗的根長及生長情況。3.2.2鹽脅迫下轉基因擬南芥細胞受損情況研究將轉PtrZFP103基因的擬南芥T3代和WT的種子消毒種入培養(yǎng)基，培養(yǎng)7-8d待苗長出兩葉一芯后種入土中，溫室培養(yǎng)3-4周以后，用300mMNaCl脅迫24h、72h后取大小相同的葉片，這些葉片都進行NBT、DAB和EvansBlue染色，觀察染色情況。所有的染色是將組培苗放入干凈的5ml的離心管中，加入配制好濃度為1mg/ml的染液，過夜，用蒸餾水反復清洗直到?jīng)]有浮色放入卡諾固定液。其中DAB染色為暗處過夜。3.2.3鹽脅迫下轉基因擬南芥的生理指標測定3.2.3.1MDA含量測定分別取未經(jīng)脅迫處理和300mMNaCl脅迫處理3天的WT、line1、line2、line3擬南芥植株，每個樣取0.04g左右，用液氮速凍后進行研磨，迅速加入1.5mL的10％的三氯乙酸，4℃冰箱放置30min，11000rpm離心10min，吸取1mL的上清液于新的離心管中，然后加入1mL的0.6％TBA混勻，沸水浴15min，立即放入冰上冷卻10min，室溫下12000rpm離心20min；取上清液2mL在532nm和450nm下進行測OD值，對照管是1mL的0.6％TBA和1mL的水。根據(jù)以下公式即可計算樣品提取液中的丙二醛的含量C和單位質(zhì)量樣品中的丙二醛的含量y，計算公式：C(MDA濃度μmol/L)＝6.45×OD523-0.56×OD450；y(μmol/g)＝(c×v)/w。3.2.3.2SOD含量測定現(xiàn)處理擬南芥植株用液氮對整個植株速凍之后對植物材料進行研磨，取0.02g樣離心管中，之后加入1.5mL的1/15mol/L磷酸緩沖液，在4℃冰箱中放置30min，11000rpm離心20min，去上清的酶液50μL放入新的2mL離心管中，之后加入1.5mL的SOD反應液和450μL1/15mol/L磷酸緩沖液；30℃，6級光照培養(yǎng)10min，發(fā)現(xiàn)變藍，隨后立即測吸收光值(OD560)，用緩沖液置于暗處進行調(diào)零，SOD反應液照光做為對照。A1：0.5mLH2O+1.5mLSOD反應液光照后測OD值；A2：0.5mL酶液(已經(jīng)稀釋10倍)+1.5mLSOD反應液光照后測OD值(每個樣品重復三次)；2mL1/15mol/L磷酸緩沖液放入暗處用于調(diào)零。計算SOD的活性公式：SOD活性＝(N×ΔA)/(W×T×50％)；其中，ΔA＝(A1-A2)/A1；N代表稀釋倍數(shù)；T代表反應時間(min)；W代表物材料植物材料的凈重。3.2.3.3POD含量測定現(xiàn)處理擬南芥植株用液氮對整個植株速凍之后對植物材料進行研磨，取0.02g樣加入2mL的離心管中，之后向離心管中加入1.5mL的0.01mol/L磷酸緩沖液，每個樣品3個生物學重復，在4℃冰箱中放置0.5h，11000rpm離心20min，取上清的酶液1mL加入2mL離心管中4℃冰箱保存，取酶液0.5mL酶液中加入0.5mL0.1M磷酸緩沖液(pH7.2)，0.5mL愈創(chuàng)木酚溶液，充分混勻，30℃反應10min，在測定之前加入0.5mL0.8％H2O2，混勻用722S分光光度計在470nm處測各樣品的OD值，以ddH2O替代作為對照值，并以ddH2O進行調(diào)零。需要注意的是在測定的時候要迅速，測每30s讀一次OD值，直到數(shù)不再變化為止，將這些點連起來，會形成一個曲線，酶液在所測定用時內(nèi)的變化值一般取曲線初始線性部分的OD變化值。POD活性計算：POD活性＝(N×ΔA)/(W×T)；其中ΔA＝(A1-A2)/A1；N代表稀釋倍數(shù)；T代表反應時間(min)；W代表植物材料粉末的凈重。3.3實驗結果3.3.1鹽脅迫下轉基因PtrZFP103擬南芥的抗逆能力分析3.3.2.1鹽脅迫下轉基因擬南芥幼苗的抗逆分析選取轉PtrZFP103基因的擬南芥T3代株系用于消毒，種在1/2MS培養(yǎng)基中，5-8d后移至分別含有100mMNaCl和150mMmannitol的培養(yǎng)基平板上，將平板豎直放置8d后，幼苗生長情況如圖14所示。結果表明：轉基因擬南芥的根系在NaCl脅迫下的長勢和鮮重比野生型擬南芥強很多，說明了這個基因轉入擬南芥后提高了擬南芥抗鹽能力。3.3.2.2鹽脅迫下轉基因擬南芥的萌發(fā)情況2中2.3.5進行了種子萌發(fā)率的實驗，結果表明：三個轉基因株系T3代種子萌發(fā)率在各個梯度條件下明顯高于野生型的種子，說明了轉基因擬南芥株系在鹽脅迫下的耐受力強。3.3.2.3鹽脅迫下轉基因擬南芥細胞受損情況研究NBT、DAB和EvansBlue染色具有相同的處理條件：生長4周的野生型和轉基因擬南芥土培苗在經(jīng)300mMNaCl脅迫轉基因擬南芥(line1、line2和line3)和野生型擬南芥(WT)分別處理24h和72h，取其葉片進行染色。3.3.2.4NBT染色法分析逆境下轉基因植株細胞內(nèi)超氧離子水平NBT還原法，在植物體內(nèi)NBT被超氧離子O2-氧化成藍色甲腙，通過藍色的深淺可以反映O2-含量的多少。取樣進行染色如圖15；結果表明：在正常生長條件下，野生型和轉基因株系植株葉片染色情況相似，只有在取材部位分布著少量的藍色斑塊，說明O2-含量基本一致；在鹽脅迫下，隨著脅迫時間的增長，無論是野生型還是轉基因株系，葉片上的藍色斑塊面積都逐漸增加，顏色也漸漸變深。在不同的脅迫時間下，過表達PtrZFP103基因株系line1、line2和line3植株的藍色斑塊面積明顯小于野生型，且染色也較淺。這說明在鹽脅迫下，與野生型相比，轉PtrZFP103基因擬南芥植株體內(nèi)的O2-含量明顯減少，對氧化傷害的抵抗性明顯提高。3.3.2.5DAB染色法分析逆境下轉基因植株細胞內(nèi)過氧化氫水平DAB是過氧化物酶的生色底物，在過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成淺棕色不溶性產(chǎn)物。用于定位過氧化酶活性的具體部位和活性?？梢酝ㄟ^染色的深淺，準確的可以反映出H2O2含量的多少。取樣進行染色如圖16；結果表明：在正常生長條件下，野生型和轉基因株系植株葉片染色情況相似，分布著很少的棕色斑塊，無明顯的差異，說明H2O2含量基本相同；在鹽脅迫條件下，隨著脅迫時間的增加，無論是野生型還是轉基因株系葉片的斑塊顏色和面積均有明顯的變化。在不同的脅迫時間下，過表達PtrZFP103基因株系line1、line2和line3植株的棕色斑塊面積明顯小于野生型，且染色也較淺，說明了轉基因PtrZFP103株系葉片內(nèi)的H2O2的含量比野生型株系的植株葉片內(nèi)的H2O2含量少。結果說明在脅迫條件下PtrZFP103轉基因擬南芥比WT擬南芥抗逆能力強。3.3.2.6EvansBlue染色法分析逆境下轉基因植株細胞的受損情況EvansBlue染色法，原理在于伊文思藍能夠與蛋白結合形成伊文思藍蛋白復合物，正常細胞膜不能透過伊文思藍,當細胞受到損傷后,伊文思藍進入細胞并與蛋白結合,使其染成藍色。利用這一原理能夠通過染色的深淺研究轉基因擬南芥細胞的損傷情況。取樣進行染色如圖17；結果表明；在正常生長條件下轉基因株系和轉基因植株葉片染色顏色較淡且無明顯差異，說明細胞損傷的情況基本相同；在鹽脅迫條件下，隨著脅迫時間的增加，轉基因株系和野生型植株葉片的顏色均變深。而過表達PtrZFP103的轉基因株系葉片的顏色明顯要比野生型葉片顏色淺。這說明轉基因株系葉片在干旱脅迫條件的損傷程度比野生型植株的損傷程度少。結果表明PtrZFP103基因在擬南芥植株體內(nèi)起著非常重要的抗鹽功能。3.3.3鹽脅迫下轉基因擬南芥各項生理指標的研究將野生型和轉PtrZFP103基因擬南芥(Line1、Line2、Line3)的種子消毒后，種于1/2MS培養(yǎng)基平板上，7-9天后將幼苗移至培養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)4周。然后用300mMNaCl溶液處理野生型和轉基因植株，3天后分別取未處理和脅迫處理的擬南芥植株用于以下生理生化指標的測定。3.3.3.1MDA(丙二醛)含量的測定植物在逆境條件下遭受傷害與活性氧積累誘發(fā)的膜脂過氧化作用密切相關，可通過檢測MDA的含量來檢測膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度和植物的抗逆性，結果如圖18所示；結果表明：在正常生長條件下，野生型和轉基因株系植株的MDA含量基本相同。在鹽脅迫下，轉基因和野生型擬南芥的MDA含量都增大了，但轉基因株系在脅迫情況下，MDA含量要低于野生型。采用單因素方差進行組內(nèi)比較，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下轉基因株系Line1、Line2、Line3中的MDA含量與野生型擬南芥中的MDA含量差異極顯著。也就是說在干旱脅迫下，轉基因株系MDA含量增加的程度沒有野生型大，試驗結果表明轉PtrZFP103基因在擬南芥植株內(nèi)起著非常重要的抗鹽功能。3.3.3.2SOD(超氧化物歧化酶)活性的測定SOD能夠通過歧化反應清除生物細胞中的超氧自由基(O2－)，生成H2O2和O2，抵御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統(tǒng)的損傷，增強了植物的抗逆功能，如圖19；結果表明：在未經(jīng)脅迫情況下，WT和轉基因株系的SOD活性大致相同，而經(jīng)過鹽脅迫的WT和轉基因株系清除O2.－的能力都有所增加，而轉基因株系的SOD活性明顯高于野生型。這說明PtrZFP103基因能夠正向地調(diào)節(jié)SOD活性，可以增加植株對活性氧的清除能力。試驗結果表明：PtrZFP103基因在擬南芥植株體內(nèi)起著非常重要的抗鹽功能。3.3.3.3POD(過氧化物酶)活性的測定POD是生物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的重要保護酶，能夠清除植物體內(nèi)氧自由基，提高其抗逆性，如圖20；結果如下：WT和轉基因株系在正常生長狀態(tài)下，POD活性基本持平。在鹽脅迫下，WT和轉基因株系的POD活性都提高了，說明在脅迫下，植物清除H2O2的能力增強。采用單因素方差進行組內(nèi)比較，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下轉基因株系Line2、Line3中的POD含量與野生型擬南芥中的POD含量差異極顯著。這說明在鹽脅迫下，轉基因株系的POD活性顯著高于野生型，也就是說轉基因植株的抗鹽脅迫能力明顯優(yōu)于野生型植株。試驗結果表明PtrZFP103基因在擬南芥植株體內(nèi)起著非常重要的抗逆功能。以上實驗中所用藥品皆為市售產(chǎn)品。從上述實驗中可知，利用農(nóng)桿菌介導法在擬南芥中表達該基因，獲得轉基因擬南芥發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下轉基因株系的萌發(fā)率高。為了更進一步的驗證實驗結果，通過對不同生長階段的T3代純合植系和WT進行鹽條件下的抗逆能力分析。在根長實驗中，轉基因株系的根長比WT長而且側根也比較多，轉基因擬南芥在NaCl脅迫下的長勢和鮮重比野生型擬南芥強很多。說明PtrZFP103基因在鹽脅迫下具有很重要的抗逆功能。同時通過NBT、DAB、EvansBlue染色對轉基因株系和WT在鹽脅迫下細胞的受損情況進行了觀察，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下WT細胞受損程度明顯高于轉基因株系，也驗證了上面的結論。通過各項生理指標的測定，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，PtrZFP103基因的過表達株系的抗逆能力明顯高于WT。本實驗說明PtrZFP103基因轉入擬南芥植株體內(nèi)提高了植物在鹽脅迫下的抗逆能力。序列表<110>東北林業(yè)大學<120>毛果楊PtrZFP103基因及其編碼蛋白和應用<160>10<210>1<211>507<212>DNA<213>人工序列<220><223>毛果楊PtrZFP103基因的核苷酸序列。<400>1atggatttccaaccaaacacctctctacatctaagcctaccaagcaatcaactaaaccta60gaacttgtactcgagccatcctcttcttcttcatcatcacctcatagtccggcagaacct120cgaattttctcatgcaactactgccgaagaaagttttatagctcacaagctcttgggggt180caccaaaatgctcataagcttgagagaaccttggccaaaaagagccgagagatgagttca240tccgtacgggctcatggaagatcgaacccacggtcaggatcgtcttcttgcatgagtggg300ccaagctttcctcgacatcatgaaccagccctagcaaggttcgagcaccatggacatgct360ggtaggtttgttggtgacgcgagctatgacaggacagagatgaattatggttccatagaa420ggtgtagggggttcttggtccctggtatatagaacagaaaatgttcaagaagagttgagc480cagctagatttgtctttaaggctttga507<210>2<211>168<212>DNA<213>人工序列<220><223>果楊PtrZFP103基因編碼蛋白的氨基酸序列。<400>2atggatttccaaccaaacacctctctacatctaagcctaccaagc45MetAspPheGlnProAsnThrSerLeuHisLeuSerLeuProSer51015aatcaactaaacctagaacttgtactcgagccatcctcttcttct90AsnGlnLeuAsnLeuGluLeuValLeuGluProSerSerSerSer202530tcatcatcacctcatagtccggcagaacctcgaattttctcatgc135SerSerSerProHisSerProAlaGluProArgIlePheSerCys354045aactactgccgaagaaagttttatagctcacaagctcttgggggt180AsnTyrCysArgArgLysPheTyrSerSerGlnAlaLeuGlyGly505560caccaaaatgctcataagcttgagagaaccttggccaaaaagagc225HisGlnAsnAlaHisLysLeuGluArgThrLeuAlaLysLysSer657075cgagagatgagttcatccgtacgggctcatggaagatcgaaccca270ArgGluMetSerSerSerValArgAlaHisGlyArgSerAsnPro808590cggtcaggatcgtcttcttgcatgagtgggccaagctttcctcga315ArgSerGlySerSerSerCysMetSerGlyProSerPheProArg95100105catcatgaaccagccctagcaaggttcgagcaccatggacatgct360HisHisGluProAlaLeuAlaArgPheGluHisHisGlyHisAla110115120ggtaggtttgttggtgacgcgagctatgacaggacagagatgaat405GlyArgPheValGlyAspAlaSerTyrAspArgThrGluMetAsn125130135tatggttccatagaaggtgtagggggttcttggtccctggtatat450TyrGlySerIleGluGlyValGlyGlySerTrpSerLeuValTyr140145150agaacagaaaatgttcaagaagagttgagccagctagatttgtct495ArgThrGluAsnValGlnGluGluLeuSerGlnLeuAspLeuSer155160165ttaaggctttga507168<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物PtrZFP103F的核苷酸序列。<400>3atggatttccaaccaaacac20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物PtrZFP103R的核苷酸序列。<400>4aagccttaaagacaaatcta20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物103F的核苷酸序列。<400>5tgagttcatccgtacgggct20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物103R的核苷酸序列。<400>6caagaaccccctacaccttc20<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物ActinF的核苷酸序列。<400>7atggccgatgccgaggatattcaac25<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物ActinR的核苷酸序列。<400>8ggtcaagatacctcttttagattgt25<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物ZFP103F的核苷酸序列。<400>9gctctagacatggatttccaaccaaacac29<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物ZFP103R的核苷酸序列。<400>10gcgtcgactaagccttaaagacaaatcta29當前第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