一種抗呼吸道合胞病毒的全人源抗體的制作方法

本發(fā)明涉及抗呼吸道合胞病毒抗體或其抗原結(jié)合片段，特別是全人源的抗呼吸道合胞病毒(RSV)單克隆抗體。

背景技術(shù)：

人源化抗體可以通過用人源抗體的相應(yīng)部分，取代小鼠抗體對(duì)抗原特異性不重要的區(qū)域而制備得到。由此得到的重組抗體由于其含有殘余的鼠類序列，因此在將其給予病人時(shí)，往往會(huì)在病人中引發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)(人抗鼠反應(yīng))。因此，希望制備出不含非人類序列的全人源抗體。人源化抗體已經(jīng)有過報(bào)道，例如利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建和篩選人源抗體文庫，以獲得人源化抗體，或者將來自免疫人類供體的淋巴細(xì)胞植入重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID)，以獲得人源化抗體，或者利用基因工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá)人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，以獲得人源化抗體。針對(duì)致病抗原的完全人源化抗體，也可以通過對(duì)臍帶血的大量篩選，將包含IgM天然全組分的臍帶血進(jìn)行分離而得到(例如，參見美國(guó)專利No.6,391,635)。然而上述這些方法，或者得到的是親和力低的抗體，或者需要依賴具有特定免疫應(yīng)答的人類供體。

呼吸道合胞病毒(RSV，簡(jiǎn)稱合胞病毒，也屬副粘病毒科)是引起小兒病毒性肺炎最常見的病原，可引起間質(zhì)性肺炎，及毛細(xì)支氣管炎。在北京，48％的病毒性肺炎和58％的毛細(xì)支氣管炎系由合胞病毒引起(1980～1984)；在廣州，小兒肺炎及毛細(xì)支氣管炎的31.4％由合胞病毒引起(1973～1986)；在美國(guó)，20％～25％的嬰幼兒肺炎和50％～75％的毛細(xì)支氣管炎由合胞病毒引起。

RSV感染的潛伏期為2～8天(多為4～6天)。合胞病毒肺炎的典型所見是單核細(xì)胞的間質(zhì)浸潤(rùn)。主要表現(xiàn)為肺泡間隔增寬和以單核細(xì)胞為主的間質(zhì)滲出，其中包括淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。此外肺泡腔充滿水腫液，并可見肺透明膜形成。在一些病例，亦可見細(xì)支氣管壁的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。在肺實(shí)質(zhì)出現(xiàn)伴有壞死區(qū)的水腫，導(dǎo)致肺泡填塞、實(shí)變和萎陷。少數(shù)病例在肺泡腔內(nèi)可見多核融合細(xì)胞，形態(tài)與麻疹巨細(xì)胞相仿，但找不到核內(nèi)包涵體。

RSV有兩個(gè)主要的表面糖蛋白，F(xiàn)和G。兩個(gè)糖蛋白(90KDa和68KDa)暴露于病毒粒子表面。90KDa的高度糖基化的G蛋白負(fù)責(zé)將病毒顆粒結(jié)合到靶細(xì)胞上。68KDa的F蛋白介導(dǎo)病毒被膜與細(xì)胞融合和合胞體形成。所述的F和G表面糖蛋白為主要的保護(hù)性抗原，核蛋白N和被膜蛋白M2具有較小的保護(hù)性活性。抗G糖蛋白的單克隆抗體比抗F糖蛋白的單克隆抗體不太可能中和病毒，且不具有抑制融合活性。F糖蛋白的氨基酸序列在與人感染有關(guān)的RSV亞組間有大約90％的保守性。

目前唯一上市的抗RSV單克隆抗體只批準(zhǔn)用于預(yù)防早產(chǎn)兒感染RSV，是抗F蛋白的抗體，該抗體的名稱是帕利珠單抗Synagis(MedImmune制造)，是一種人源化的鼠單克隆抗體，該藥通過呼吸道合胞病毒融合蛋白阻止病毒向下呼吸道擴(kuò)散。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供抗RSV抗體或其抗原結(jié)合片段，優(yōu)選為全人源抗RSV單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及抗RSV抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含：

至少一個(gè)重鏈CDR，其具有選自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；和/或

至少一個(gè)輕鏈CDR，其具有選自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

進(jìn)一步地，對(duì)于所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含：

選自具有如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的三個(gè)重鏈CDR；和/或

選自具有如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的三個(gè)輕鏈CDR。

優(yōu)選地，對(duì)于所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含：

具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和/或具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述抗體是全人源抗RSV單克隆抗體R66。

任選地，本發(fā)明所述的抗原結(jié)合片段選自Fab、Fab'、F(ab)₂、單鏈Fv(scFv)、Fv、dsFv、雙抗體、Fd和Fd'片段。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，涉及全人源抗RSV單克隆抗體R66。單克隆抗體R66的重鏈、輕鏈(KAPPA)的核酸序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，其相應(yīng)的重鏈、輕鏈(KAPPA)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

本發(fā)明還涉及通過對(duì)上述R66抗體的重鏈和/或輕鏈氨基酸序列的插入、取代和/或缺失形成的并具有相同功能的抗體。

本發(fā)明還涉及上述R66抗體的抗原結(jié)合片段，特別是選自Fab、Fab'、F(ab)₂、單鏈Fv(scFv)、Fv、dsFv、雙抗體、Fd和Fd'片段的抗原結(jié)合片段。

本發(fā)明還涉及含有上述抗體(優(yōu)選為R66)的單個(gè)重鏈和/或單個(gè)輕鏈的單域抗體、嵌合抗體、抗體融合蛋白抗體、抗體/抗體片段-因子融合蛋白或抗體/抗體片段-化學(xué)偶聯(lián)物。

本發(fā)明提供編碼上述抗體的核酸，其包含：

至少一個(gè)編碼重鏈CDR的核苷酸序列，其選自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9；和/或

至少一個(gè)編碼輕鏈CDR的核苷酸序列，其選自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15。

優(yōu)選地，對(duì)于本發(fā)明所述的核酸，其包含：

如SEQ ID NO：1所示的編碼重鏈可變區(qū)的核酸和/或如SEQ ID NO：2所示的編碼輕鏈可變區(qū)的核酸。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供制備抗RSV抗體(優(yōu)選為全人源抗RSV單克隆抗體)的方法，包括如下步驟：

(1)提供表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明的抗RSV抗體(優(yōu)選為全人源抗RSV單克隆抗體)的DNA分子，以及與所述DNA分子可操作相連的表達(dá)調(diào)控序列；

(2)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；

(3)在適合所述抗RSV抗體(優(yōu)選為全人源抗RSV單克隆抗體)表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；

(4)分離純化獲得所述的抗RSV抗體(優(yōu)選為全人源抗RSV單克隆抗體)。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供包含本發(fā)明的抗RSV抗體(優(yōu)選為全人源抗RSV單克隆抗體)的核酸序列的載體以及包含所述核酸序列或載體的宿主細(xì)胞。

所述載體可以是重組表達(dá)載體。

所述宿主細(xì)胞可以是293T細(xì)胞、中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NS0、SP2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝癌細(xì)胞、549A細(xì)胞、3T3細(xì)胞、以及許多其他細(xì)胞系。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供本發(fā)明的抗RSV抗體(優(yōu)選為全人源抗RSV單克隆抗體)、核酸、載體或宿主細(xì)胞在制備用于預(yù)防或治療RSV相關(guān)疾病的治療劑中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于治療RSV相關(guān)疾病的藥物組合物，藥物組合物中包含治療有效量的本發(fā)明的抗RSV抗體(優(yōu)選為全人源抗RSV單克隆抗體)、核酸、載體或宿主細(xì)胞，和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括生理相容的水性和非水性載體、穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、抗氧化劑、溶劑、分散介質(zhì)、外衣層、緩沖液、血清蛋白等。

所述RSV相關(guān)疾病選自由病毒性肺炎、間質(zhì)性肺炎、毛細(xì)支氣管炎組成的組。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，涉及本發(fā)明的抗RSV抗體(優(yōu)選為全人源抗RSV單克隆抗體)、核酸、載體或宿主細(xì)胞在制備用于檢測(cè)RSV的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的抗RSV抗體(優(yōu)選為抗RSV單克隆抗體)優(yōu)選是全人源的，與其它動(dòng)物源性(如鼠源性)的抗RSV抗體相比，因物種差異導(dǎo)致的免疫原性大大減少，且特異性好、親和力高，如果用于臨床將大大降低副作用。此外，由于本發(fā)明中的抗RSV抗體(優(yōu)選為單克隆抗體)可以和RSV F抗原特異性結(jié)合，在RSV的診斷和檢測(cè)中也有很好的應(yīng)用。應(yīng)用于人時(shí)不會(huì)產(chǎn)生類似鼠抗體所產(chǎn)生的副作用。

附圖說明

圖1是R66純化后的電泳圖；

圖2是ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單克隆抗體R66與RSV-F(Strain A2)的結(jié)合；

圖3是ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單克隆抗體R66與RSV-F(Strain RSS-2)的結(jié)合。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面結(jié)合具體實(shí)施方式并參照附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。此外，在以下說明中，省略了對(duì)公知結(jié)構(gòu)和技術(shù)的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的概念。

實(shí)施例1全人源抗RSV抗體R66的制備

1、人工合成R66的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)

按照序列如SEQ ID NO：1所示的單克隆抗體R66的重鏈可變區(qū)、序列如SEQ ID NO：2所示的單克隆抗體R66的輕鏈(KAPPA)可變區(qū)的核酸序列送GENEWIZ公司人工合成。

將人工合成得到的R66重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)作為模板，分別加入Taq酶和dNTPs，以及引物，進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物。

2、重組抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建

利用快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒(購自康為世紀(jì))回收PCR產(chǎn)物，得到40μl PCR產(chǎn)物待用。

分別對(duì)R66的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)目的片段進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系為：Nhe Ⅰ/Not Ⅰ各0.5μl、10*FastDigest Green Reaction Buffer 3μl以及PCR產(chǎn)物26μl，37℃恒溫5h。

對(duì)改造好的表達(dá)載體(表達(dá)載體為pcDNA3.1-Zeo(+)(Invitrogen公司)，由GENEWIZ公司預(yù)先將人抗體重鏈/輕鏈的恒定區(qū)改造到此表達(dá)載體中)進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系為：Nhe Ⅰ/Not Ⅰ各0.5μl、10*FastDigest Green Reaction Buffer 3μl、載體1μg、用H₂O補(bǔ)齊30μl，37℃恒溫30min。然后加入2μl堿性磷酸酶和3.5μl10*buffer(NEB)混勻，37℃恒溫水浴2h。

上述目的片段和載體的雙酶切體系中所使用的Nhe Ⅰ、Not Ⅰ、10*FastDigest Green Reaction buffer均購自Thermo Scientific。

對(duì)將酶切后的R66的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)目的片段分別進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，并通過紫外儀觀察結(jié)果。用小刀將目的條帶切下放入一個(gè)稱量好重量的Ep管中，利用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(購自康為世紀(jì))回收各個(gè)目的片段。

將各個(gè)目的片段分別和載體進(jìn)行連接，連接體系為：載體2μl、目的片段15μl、T4DNA Ligase(購自NEB)1μl、緩沖液2μl，混勻后16℃恒溫水浴保持2h。

將每個(gè)目的片段的所有連接產(chǎn)物加入到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s后，迅速置于冰浴5min。然后加入800μL培養(yǎng)基，37℃振蕩(100r/min)溫育1h。將培養(yǎng)菌液10000rpm離心15s，去除800ul上清，重懸沉淀，全部涂布于含氨芐青霉素鈉(100μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上,正向放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，再倒置培養(yǎng)過夜至菌落清晰。挑取單菌落接種到5ml含氨芐青霉素鈉(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)15h。利用高純度質(zhì)粒小提試劑盒(購自康為世紀(jì))提取質(zhì)粒，獲得分別含有R66的重鏈(RH66)、R66的輕鏈(RK66)的質(zhì)粒，并送樣測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果顯示單克隆抗體R66的重鏈可變區(qū)、輕鏈(KAPPA)可變區(qū)的核酸序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，其相應(yīng)的重鏈可變區(qū)、輕鏈(KAPPA)可變區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

實(shí)施例2單克隆抗體R66的表達(dá)和純化

用實(shí)施例1中獲得的含有R66的重鏈(RH66)的質(zhì)粒和含有R66的輕鏈(RK66)的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。先用Opti-MeM(1X)buffer分別稀釋質(zhì)粒和PEI，然后將PEI-Opti-MeM混合物緩慢加入到質(zhì)粒-Opti-MeM混合物管中，室溫靜置20分鐘后，再將PEI和質(zhì)?；旌衔锛尤氲郊?xì)胞懸液中。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞濃度為0.25～0.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml，每孔細(xì)胞的轉(zhuǎn)染使用2.5μg含有R66重鏈的質(zhì)粒+2.5μg含有R66輕鏈的質(zhì)粒+10μg PEI。轉(zhuǎn)染結(jié)束后在37℃培養(yǎng)48h后收獲上清，用ELISA檢測(cè)上清。

使用rProtein A Sepharose Fast Flow(GE)純化表達(dá)的抗體蛋白。分別收集表達(dá)R66的293T細(xì)胞培養(yǎng)物上清，10000rpm，4℃離心10min，取上清，將該上清加入到已用平衡緩沖液(20mM磷酸鹽緩沖液，150mM氯化鈉，pH7.4)平衡好的rProtein A Sepharose Fast Flow柱上，用同樣的平衡緩沖液洗10個(gè)床體積，再用洗脫緩沖液(0.1M Gly-HCl緩沖液，pH2.5)流洗5個(gè)床體積，收集前3個(gè)床體積，向收集的洗脫液中加入1/10提及的中和液(1M Tris-HCl緩沖液，pH9.0)混勻，加入到Amicon Ultra-15Centrifugal Filters(Merck Millipore)中，5000G、4℃離心20min，濃縮蛋白，再向Amicon Ultra-15Centrifugal Filters中加入上述平衡緩沖液，5000G、4℃離心20min，更換新的平衡緩沖液，重復(fù)3次，分別獲得濃縮后的R66抗體蛋白，將其分別轉(zhuǎn)到1.5ml離心管中，取樣測(cè)定蛋白質(zhì)含量，然后置于4℃保存。

分別取純化的R66抗體進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖1所示，其中泳道M是標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道R66是純化的R66抗體，有兩個(gè)明顯條帶，分別是約50KDa的重鏈和約22KDa的輕鏈。

實(shí)施例3R66抗體的ELISA檢測(cè)

所用試劑包括：

PBS(1X)：用PBS(10X)和去離子水配置。

PBST：PBS(1X)加Tween-20至終濃度為0.05％。

封閉液：PBS(1X)+2％BSA+2％新生小牛血清，現(xiàn)用現(xiàn)配。

稀釋液：PBST+1％BSA，稀釋抗體用。

終止液：將6ml95％-98％的濃硫酸慢慢加入180ml水中，冷卻后備用。

一抗：本發(fā)明制備得到的R66抗體，稀釋成工作濃度為10μg/ml。

二抗：Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG(H+L)(購自Jackson Immuno Research)，取1.5ml的無RNase水完全溶解后，備用。

用PBS(1X)(pH7.4)緩沖液稀釋RSV-F(Strain A2)和RSV-F(Strain RSS-2)(購自Sino Biological Inc.)作為包被抗原，使包被抗原溶液的終濃度為2ng/μl，吸取100μl包被抗原溶液加入到96孔板的每孔中，2-8℃包被過夜，用PBST清洗5次，然后每孔加入200μl封閉液，37℃封閉2h，封閉結(jié)束后用PBST清洗5次，每次停留1分鐘。

用抗體稀釋液(PBST+1％BSA)將一抗做10倍稀釋：即取7個(gè)高壓滅菌的1.5ml離心管，每一管加入270μl的抗體稀釋液，從工作溶液中取30μl一抗溶液，渦旋震蕩混勻后，標(biāo)記為1:10稀釋，從1:10稀釋的溶液中取30μl放入下一管中，以此類推，分別為：1:10，1:100，1:1000，1:10000，1:100000，1:1000000，1:10000000，分別加到相應(yīng)的孔中，每孔100μl，做兩個(gè)平行，并設(shè)立兩個(gè)空白孔用PBST代替一抗，37℃孵育90min，然后用PBST清洗5遍。

用抗體稀釋液(PBST+1％BSA)將二抗做5000倍稀釋，每孔加入100μl，37℃孵育1h，然后用PBST清洗5遍，加入TMB顯色液，100μl/孔，室溫孵育15min，孵育結(jié)束后加入H₂SO₄終止液終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取OD₄₅₀讀數(shù)。

通過GraphPad Prism軟件分析上述ELISA結(jié)果，獲得R66抗體以及Synagis抗體的EC₅₀值。

結(jié)果顯示，表達(dá)和純化的R66抗體與RSV-F(Strain A2)和RSV-F(Strain RSS-2)的結(jié)合具有劑量依賴性，說明R66抗體與RSV-F(Strain A2)和RSV-F(Strain RSS-2)的結(jié)合是特異性的。

從附圖2可以看出，R66抗體與RSV-F(Strain A2)結(jié)合的EC₅₀值為0.001791μg/mL，均低于Synagis的EC₅₀值(0.004881μg/mL，用Synagis以相同條件進(jìn)行ELISA并用GraphPad Prism軟件分析獲得)。從附圖3可以看出，R66抗體與RSV-F(Strain RSS-2)結(jié)合的EC₅₀值分別為0.001463μg/mL，也低于Synagis的EC₅₀值(0.001878μg/mL，用Synagis以相同條件進(jìn)行ELISA并用GraphPad Prism軟件分析獲得)。由此說明，本發(fā)明的R66抗體比Synagis具有更高的靈敏度。

實(shí)施例4單克隆抗體R66的CDR的測(cè)定：測(cè)定單克隆抗體R66的重鏈CDR和輕鏈CDR

將抗體可變區(qū)域序列信息導(dǎo)入IgBLAST程序(version 1.6.1)中與人類可變區(qū)域原始序列文庫進(jìn)行對(duì)比分析，抗體的可變區(qū)域被進(jìn)一步劃分出3個(gè)構(gòu)架區(qū)(FRs)和2個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)。然后將抗體序列導(dǎo)入IMGT High V-Quest系統(tǒng)中使用之前相同的文庫進(jìn)行比對(duì)確定出CDR3和FR。所有抗體序列的數(shù)字標(biāo)定都是基于KABAT系統(tǒng)。

結(jié)果表明，該單克隆抗體的重鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10，其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列分別為SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9；輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16，其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列分別為SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的上述具體實(shí)施方式僅僅用于示例性說明或解釋本發(fā)明的原理，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。因此，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。此外，本發(fā)明所附權(quán)利要求旨在涵蓋落入所附權(quán)利要求范圍和邊界、或者這種范圍和邊界的等同形式內(nèi)的全部變化和修改例。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津昊免生物技術(shù)有限公司

<120> 一種抗呼吸道合胞病毒的全人源抗體

<130> 1

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 378

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cagggcggtc cctgagactc 60

tcctgtacag cttctggatt cacctttgct gattattcta tgacttgggt ccgccaggct 120

ccaggaaagg ggctggagtg ggtaggtctc attaaaagga atgcttatgg tgggaccaca 180

gaatacgccg cgtctgtgag aggcagattc accatctcaa gagatgattc cagaagcatc 240

gcctatctac aaatgcacag cctgaaaagt gaggatacag ccgtctattt ctgtcttcga 300

ggatatagtg gctatgattg ggaaggtctt gatgcttttg aagtctgggg ccaagggaca 360

atggtcaccg tctcttca 378

<210> 2

<211> 321

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

gacatccaga tgacccagtc tccatctgcc atgtctgcat ctgtaggaga cagggtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca gggcagtagc acttatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagtcc ctaagcgcct gatctatgct gtatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240

gaagattctg caacttatta ctgtctacaa cataatagtt tcccgttgac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

<210> 3

<211> 126

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr

20 25 30

Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Leu Ile Lys Arg Asn Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met His Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Phe Cys Leu Arg Gly Tyr Ser Gly Tyr Asp Trp Glu Gly Leu Asp Ala

100 105 110

Phe Glu Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ser Ser Thr Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

gattattcta tgact 15

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

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1 5

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

ctcattaaaa ggaatgctta tggtgggacc acagaatacg ccgcgtctgt gagaggc 57

<210> 8

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<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

Leu Ile Lys Arg Asn Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser

1 5 10 15

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

ggatatagtg gctatgattg ggaaggtctt gatgcttttg aagtc 45

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

Gly Tyr Ser Gly Tyr Asp Trp Glu Gly Leu Asp Ala Phe Glu Val

1 5 10 15

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 11

cgggcgagtc agggcagtag cacttattta gcc 33

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ala

1 5 10

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 13

gctgtatcca gtttgcaaag t 21

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 14

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1 5

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<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

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<211> 9

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<213> 人(Homo sapiens)

<400> 16

Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Leu Thr

1 5