一種SO32?/HSO3?檢測試劑及其合成方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及亞硫酸根/亞硫酸氫根離子檢測技術(shù)，具體涉及(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛及其合成方法，以及(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛作為試劑在檢測亞硫酸根/亞硫酸氫根離子中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

二氧化硫是一種公認(rèn)的空氣污染物，在中性體系下容易水解成亞硫酸根與亞硫酸氫根(3:1，M/M)。日常生活中，二者被廣泛用作食品、飲料及藥物的抗菌劑，酶抑制劑和抗氧化劑。但是，大量病理學(xué)研究證明大量吸入這兩種離子會(huì)對(duì)細(xì)胞、組織造成危害，導(dǎo)致呼吸道疾病、心血管疾病及神經(jīng)障礙，例如肺癌、哮喘、中風(fēng)、過敏反應(yīng)、偏頭痛、心肌缺血及腦瘤等。正是由于這兩種陰離子對(duì)人體有著很大的危害，因此在食品、飲料及空氣中的量應(yīng)該被嚴(yán)格控制。此外，為了研究二氧化硫衍生物的生物活性，開發(fā)設(shè)計(jì)一種檢測細(xì)胞內(nèi)亞硫酸根/亞硫酸氫根濃度的分析方法具有重要的意義。

到目前為止，已經(jīng)有很多方法用來檢測體內(nèi)及體外亞硫酸根及亞硫酸氫根濃度，如：毛細(xì)管電泳法、色譜分析法及熒光探針。其中，小分子熒光探針檢測由于其具有高靈敏度、高選擇性、非侵入性、操作簡便及實(shí)時(shí)成像的特征已被視為是最有前景的檢測技術(shù)。

在本發(fā)明中，設(shè)計(jì)合成了(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛，通過SO₃^2-/HSO₃^-和化合物在親核加成反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度的變化，實(shí)現(xiàn)SO₃^2-/HSO₃^-的檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種SO₃^2-/HSO₃^-檢測試劑及其合成方法，以及將該檢測試劑用于定量檢測SO₃^2-/HSO₃^-，檢測試劑選擇性高、靈敏度高，檢測方法操作方便。

本發(fā)明提供的一種SO₃^2-/HSO₃^-檢測試劑，是(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛，英文名：(Z)-3-chloro-3-(7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromen-3-yl)acrylaldehyde，結(jié)構(gòu)式為：

(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的合成方法，步驟為：

1)在冰浴下，往等體積的DMF溶液中緩慢滴加三氯氧磷，攪拌半小時(shí)，加入溶解在DMF中的摩爾量為三氯氧磷十分之一的3-(二乙胺基)苯酚，80℃回流5h；反應(yīng)完成后，把反應(yīng)液倒入三倍體積的冰水中，并用Na₂CO₃水溶液調(diào)節(jié)pH至中性，棕色固體析出，抽濾，水洗，最后用乙醇重結(jié)晶得到4-(二乙胺基)-2-間羥基苯甲醛；

2)將4-(二乙胺基)-2-間羥基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯按摩爾比1：1.5混合，在含有少量哌啶的乙醇中回流10小時(shí)，濃縮、冷卻后減壓蒸餾得到黃色固體即為3-乙?；?7-(二乙胺基)-2氫-色烯-2-酮；

3)在冰浴下，將等體積的三氯氧磷緩慢滴加到DMF溶液中，攪拌半小時(shí)，當(dāng)溶液顏色變成橘紅色，加入等體積的3-乙酰基-7-(二乙胺基)-2氫-色烯-2-酮的DMF溶液，繼續(xù)攪拌3h，然后將該體系在80℃回流6h；冷卻到室溫后將體系倒入兩倍體積的冰水中，并用Na₂CO₃水溶液調(diào)節(jié)pH至中性，抽濾，有磚紅色固體析出，然后以二氯甲烷作為洗脫劑柱層析分離得到最終產(chǎn)物，即得到SO₃^2-檢測試劑(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛。

本發(fā)明提供的一種快速檢測SO₃^2-/HSO₃^-的方法，是基于(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛，在pH為7.4的HEPES緩沖溶液和DMSO混合溶液中定量地檢測SO₃^2-/HSO₃^-的含量；具體步驟為：

(1)、配制pH＝7.4、濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，配制2mM的(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的DMSO溶液；

(2)、將1000μL pH 7.4的HEPES緩沖溶液、1000μL DMSO溶液和5μL(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的DMSO溶液加到干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，486nm的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；

(3)、將1000μL pH 7.4的HEPES緩沖溶液、1000μL DMSO溶液和5μL(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的DMSO溶液加到另外七個(gè)熒光比色皿中，分別再加入體積為0.5、1、1.5、2、4、6、8μL的SO₃^2-溶液，在熒光分光光度儀上測定486nm對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度F為493、792、1061、1327、2355、3250、4338，以SO₃^2-濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)繪制圖，得到SO₃^2-濃度的工作曲線；線性回歸方程為：F＝509.94c+257.86，c的單位為μM；

(4)、將1000μL pH 7.4的HEPES緩沖溶液、1000μL DMSO溶液和5μL(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的DMSO溶液加到干凈的熒光比色皿中，用微量進(jìn)樣器吸取VμL待測樣品溶液，加入到此干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，將測得的熒光強(qiáng)度代入步驟(3)的線性回歸方程，得到濃度c，待測樣品C_待測樣＝2000μL×c×10^-6/VμL,即可求得SO₃^2-/HSO₃^-的濃度。

該檢測方法對(duì)SO₃^2-/HSO₃^-顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測過程簡便、快速，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果：1、試劑合成簡單，檢測體系成本低廉；2、本發(fā)明的檢測方法，對(duì)SO₃^2-/HSO₃^-顯示了高的靈敏性和選擇性；3、檢測手段簡單，只需要借助熒光分光光度儀即可實(shí)現(xiàn)。

附圖說明：

圖1實(shí)施例1制備的(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的核磁氫譜

圖2實(shí)施例1制備的(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的核磁碳譜

圖3實(shí)施例1制備的(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的質(zhì)譜

圖4實(shí)施例2試劑與SO₃^2-/HSO₃^-作用的熒光發(fā)射圖

圖5實(shí)施例3試劑與各種分析物的熒光柱狀圖

圖6實(shí)施例4測定SO₃^2-/HSO₃^-的工作曲線

圖7實(shí)施例5測定樣品的熒光發(fā)射圖

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的合成及表征

在冰浴下，往10mL DMF溶液中緩慢滴加10mL三氯氧磷，攪拌半小時(shí)，加入溶解在DMF中的20mmoL 3-(二乙胺基)苯酚，80℃回流5h；反應(yīng)完成后，把反應(yīng)液倒入60mL冰水中，并用Na₂CO₃水溶液調(diào)節(jié)pH至中性，棕色固體析出，抽濾，水洗，最后用乙醇重結(jié)晶得到4-(二乙胺基)-2-間羥基苯甲醛；

將4-(二乙胺基)-2-間羥基苯甲醛(1.93g,10mmol)、乙酰乙酸乙酯(1.95g,15mmol)在0.2mL哌啶催化下在乙醇中回流10小時(shí)，濃縮、冷卻后減壓蒸餾得到黃色固體即為3-乙?；?7-(二乙胺基)-2氫-色烯-2-酮。

在冰浴下，往10mL DMF溶液中緩慢滴加10mL三氯氧磷，攪拌半小時(shí)，當(dāng)溶液顏色變成橘紅色，加入溶解在10mL DMF中的3-乙?；?7-(二乙胺基)-2氫-色烯-2-酮繼續(xù)攪拌3h，后將該體系在80℃回流6h。冷卻到室溫后將體系倒入60mL冰水中，并用Na₂CO₃水溶液調(diào)節(jié)pH至中性，抽濾，有磚紅色固體析出，然后以二氯甲烷作為洗脫劑柱層析分離得到最終產(chǎn)物，得到(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛。

¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz):δ10.15(d,39H,J＝6.9),9.51(d,8H,J＝7.4),8.66(s,42H),8.26(s,6H),7.72(d,44H,J＝9.0),7.56(d,11H,J＝9.0),7.46(d,40H,J＝6.9),6.82(dd,55H,J＝8.2),6.62(s,47H),6.50(d,6H,J＝7.3),4.13-3.72(m,27H),3.63(s,38H),3.50(dq,232H,J＝7.0),4.13-3.35(m,235H),4.13-3.35(m,236H),4.13-2.55(m,423H),2.51(s,212H),1.15(q,269H,J＝6.7Hz,),1.15(q,290H,J＝6.7Hz),1.15(q,371H,J＝6.7Hz,),1.08(d,20H,J＝41.0Hz),0.90--0.35(m,95H),-0.01--0.35(m,18H)(圖1).¹³C NMR(DMSO-d₆,151MHz):d＝192.42,158.43,157.10,153.41,146.31,146.02,132.39,125.04,111.44,110.86,108.52,96.17,44.95,12.84(圖2).ESI-MS m/z:[C₁₆H₁₆ClNO₃+H]⁺，m/z 306.0891(圖3).

實(shí)施例2

配制pH＝7.4、濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，并用DMSO配制2mM(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的溶液；把2mL的HEPES-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液及5μL(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的DMSO溶液加到干凈的熒光比色皿中，取SO₃^2-的溶液，逐漸用微量進(jìn)樣器加到此比色皿中，邊加樣邊在熒光分光光度儀上檢測，隨著SO₃^2-的加入，486nm處熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。熒光發(fā)射圖見圖4。

實(shí)施例3

配制pH＝7.4、濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，并用DMSO配制2mM的(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛溶液；在14個(gè)熒光比色皿中，各加入2mL的HEPES-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和5μL的試劑的DMSO溶液，再分別加入14μL SO₃^2-，以及140μL的各種分析物：F^-,Cl^-,Br^-,I^-,N₃^-,NO₃^-,H₂PO₄^-,NO₂^-,S₂O₃^2-,AcO^-,SO₄^2-,HS^-,HCO₃^-和GSH在熒光分光光度儀上檢測，繪制不同分析物對(duì)應(yīng)的486nm相對(duì)熒光強(qiáng)度的柱狀圖，(見圖5)。SO₃^2-使得試劑的熒光強(qiáng)度由177變到5813，其它的分析物基本沒有引起試劑熒光強(qiáng)度的變化。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，其它分析物不干擾體系對(duì)SO₃^2-的測定。

實(shí)施例4

配制pH＝7.4、濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，并用DMSO配制2mM的(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛溶液，用蒸餾水配制20mM的SO₃^2-溶液；把2mL HEPES-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和5μL的試劑的DMSO溶液加到熒光比色皿中，分別再加入體積為0.5、1、1.5、2、4、6、8μL的SO₃^2-溶液，在熒光分光光度儀上測定486nm對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度F為493、792、1061、1327、2355、3250、4338，以SO₃^2-濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)繪制圖，得到SO₃^2-濃度的工作曲線(見圖6)；線性回歸方程為：F＝509.94c+257.86，c的單位為μM；

實(shí)施例5

配制pH＝7.4的HEPES(10mM)緩沖溶液，配制20mM的SO₃^2-水溶液，并用DMSO配制2mM的(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛溶液；把2mL的HEPES-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和5μL的(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氫-色烯-3-基)丙烯醛的DMSO溶液加到干凈的熒光比色皿中，取SO₃^2-的溶液5.5μL，用微量進(jìn)樣器加到此比色皿中，同時(shí)在熒光光譜儀上測定486nm的對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度F為3083，通過實(shí)施例4的線性回歸方程，求得c＝5.5401×10^-5mol/L，偏差為0.73％。見圖7。