本發(fā)明涉及一種細菌檢測方法，具體是一種食品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
鼠傷寒沙門氏菌是常見的沙門氏菌致病的血清型之一，以嬰幼兒感染最常見，臨床癥狀主要為發(fā)熱、惡心、嘔吐和腹瀉。該菌為革蘭氏陰性桿菌，屬沙門氏菌B群，不形成芽孢，無莢膜，有鞭毛。該菌在自然界分布廣泛，在外界環(huán)境中抵抗力較強，常溫下可迅速繁殖，耐低溫、干燥，不耐熱，對酸、紫外線和各種化學(xué)消毒劑均敏感。該菌可分608個噬菌體型，20個不同的生化型，在自然界進化過程中，形成了哥本哈根變種、賓斯變種及O型變種三個變種。
鼠傷寒沙門氏菌的檢測主要是依靠傳統(tǒng)的培養(yǎng)的方法(可參見國標(biāo)GB/T4789.4-2008)，正如劉振湘在《特產(chǎn)研究》2007年第1期第56～57頁發(fā)表的題為“白鷺鼠傷寒沙門氏菌的分離與鑒”文中提及，該方法需經(jīng)選擇性增菌培養(yǎng)，并通過生化反應(yīng)及血清學(xué)測試來鑒定，雖然結(jié)果可靠，但是操作復(fù)雜，費時費力，通常要3～5天才能得出檢測結(jié)果，不利于及時診斷病因，查找病源，控制病情的蔓延。為了能夠快速、準(zhǔn)確、簡便的檢驗鼠傷寒沙門氏菌，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法在實踐檢驗中不斷取得新進展，成為取代傳統(tǒng)檢測方法最具潛力的檢測方法之一。PCR技術(shù)以其操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強等特點，逐步應(yīng)用于沙門氏菌的檢疫之后，對沙門氏菌病的診斷和防治工作起到了積極作用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡單、使用方便的食品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種食品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以鼠傷寒沙門氏菌spvC基因特異序列為靶序列，SYBER Green II為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到NB營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)溫度為25-30℃，培養(yǎng)時間為18-24h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取質(zhì)粒，使用溶菌酶和EDTA處理細菌，加入SDS裂解并通過氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心獲得質(zhì)粒；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II熒光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶 15U，磷酸氫二鈉溶液 1.5μL，枸櫞酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸鐵溶液1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7-1.9；
所述SYBER Green II熒光染料為80-100倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸銨；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氫二鈉溶液的濃度為8-15mmol/L；
所述枸櫞酸鈉溶液的濃度為15-35mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7-1.9；
所述硫酸鐵溶液的濃度為10-15mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，90-96℃變性1-2min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（1）中培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為21h。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述DNA模板的OD260/OD280值為1.8。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述SYBERGreenII熒光染料為90倍稀釋。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述磷酸氫二鈉溶液的濃度為11mmol/L。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述枸櫞酸鈉溶液的濃度為25mmol/L。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述DNA引物的OD260/OD280值為1.8。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述硫酸鐵溶液的濃度為13mmol/L。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（3）中93℃變性1.5min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明提供的針對鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法，具有簡便、快速、特異、靈敏和經(jīng)濟的優(yōu)點，結(jié)果判斷方法簡便，適合于臨床或者基層實驗室使用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。
實施例1
一種食品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以鼠傷寒沙門氏菌spvC基因特異序列為靶序列，SYBER Green II為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到NB營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)時間為18h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取質(zhì)粒，使用溶菌酶和EDTA處理細菌，加入SDS裂解并通過氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心獲得質(zhì)粒；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II熒光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶 15U，磷酸氫二鈉溶液 1.5μL，枸櫞酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸鐵溶液1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7；
所述SYBER Green II熒光染料為80倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸銨；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氫二鈉溶液的濃度為8mmol/L；
所述枸櫞酸鈉溶液的濃度為15mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7；
所述硫酸鐵溶液的濃度為10mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，90℃變性1min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
實施例2
一種食品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以鼠傷寒沙門氏菌spvC基因特異序列為靶序列，SYBER Green II為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到NB營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)溫度為26℃，培養(yǎng)時間為20h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取質(zhì)粒，使用溶菌酶和EDTA處理細菌，加入SDS裂解并通過氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心獲得質(zhì)粒；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II熒光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶 15U，磷酸氫二鈉溶液 1.5μL，枸櫞酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸鐵溶液1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7；
所述SYBER Green II熒光染料為85倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸銨；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氫二鈉溶液的濃度為9mmol/L；
所述枸櫞酸鈉溶液的濃度為20mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7；
所述硫酸鐵溶液的濃度為11mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，91℃變性1min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
實施例3
一種食品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以鼠傷寒沙門氏菌spvC基因特異序列為靶序列，SYBER Green II為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到NB營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為21h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取質(zhì)粒，使用溶菌酶和EDTA處理細菌，加入SDS裂解并通過氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心獲得質(zhì)粒；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II熒光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶 15U，磷酸氫二鈉溶液 1.5μL，枸櫞酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸鐵溶液1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.8；
所述SYBER Green II熒光染料為90倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸銨；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氫二鈉溶液的濃度為11mmol/L；
所述枸櫞酸鈉溶液的濃度為25mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.8；
所述硫酸鐵溶液的濃度為13mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，93℃變性1.5min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
實施例4
一種食品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以鼠傷寒沙門氏菌spvC基因特異序列為靶序列，SYBER Green II為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到NB營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)溫度為29℃，培養(yǎng)時間為22h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取質(zhì)粒，使用溶菌酶和EDTA處理細菌，加入SDS裂解并通過氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心獲得質(zhì)粒；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II熒光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶 15U，磷酸氫二鈉溶液 1.5μL，枸櫞酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸鐵溶液1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.9；
所述SYBER Green II熒光染料為95倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸銨；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氫二鈉溶液的濃度為13mmol/L；
所述枸櫞酸鈉溶液的濃度為32mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.9；
所述硫酸鐵溶液的濃度為13mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，95℃變性2min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
實施例5
一種食品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以鼠傷寒沙門氏菌spvC基因特異序列為靶序列，SYBER Green II為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到NB營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為24h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取質(zhì)粒，使用溶菌酶和EDTA處理細菌，加入SDS裂解并通過氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心獲得質(zhì)粒；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II熒光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶 15U，磷酸氫二鈉溶液 1.5μL，枸櫞酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸鐵溶液1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.9；
所述SYBER Green II熒光染料為100倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸銨；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氫二鈉溶液的濃度為15mmol/L；
所述枸櫞酸鈉溶液的濃度為35mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.9；
所述硫酸鐵溶液的濃度為15mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，96℃變性2min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明，但是本專利并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。