本發(fā)明涉及微生物活菌制劑應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及副干酪乳桿菌KL1活菌制劑應(yīng)用于生產(chǎn)低膽固醇雞蛋。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)KL1是從藏靈菇中分離篩選出來的一種具有降低膽固醇作用的益生乳酸菌。
藏靈菇(又稱開菲爾粒)，是傳統(tǒng)乳制品開菲爾的發(fā)酵劑，它是由多種微生物通過共生作用形成的特殊粒狀或片狀結(jié)構(gòu)，這些微生物主要是乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等。用開菲爾乳飲品具有改善機(jī)體消化能力，提高鈣的利用率，調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血脂和膽固醇、抗癌癥、抗氧化等作用。近年來，研究者已從藏靈菇中分離鑒定出副干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種等菌屬，這些菌都不同程度的具有降低膽固醇的作用。
本發(fā)明從藏靈菇中分離純化得到的副干酪乳桿菌KL1，在生長代謝過程中產(chǎn)生大量高活力的膽鹽水解酶，經(jīng)過體外牛津杯試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明有降低機(jī)體血清總膽固醇含量的功效。
本發(fā)明將副干酪乳桿菌KL1的活菌制劑添加到蛋雞飼料中，達(dá)到降低雞蛋膽固醇的目的。目前，國內(nèi)申請關(guān)于降低雞蛋膽固醇飼料添加劑的專利也有很多，但這些飼料添加劑大多是中草藥成分，而微生物方法降低雞蛋膽固醇的專利較少，如青島農(nóng)業(yè)大學(xué)的朱連勤等申請的“一種低膽固醇雞蛋的生產(chǎn)方法(CN104171582A)”是先將按1∶1混合的植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵飼料，再將發(fā)酵的飼料飼喂給蛋雞，達(dá)到降低雞蛋膽固醇的目的；王冰申請的“一種低膽固醇雞蛋的生產(chǎn)方法(CN105230563A)”是在蛋雞飼料中加入本地土著益生菌及本地中藥成分，抑制雞體內(nèi)膽固醇的產(chǎn)生和沉積。與以上專利不同的是，本專利是用純粹一種產(chǎn)膽鹽水解酶的副干酪乳桿菌直接添加到飼料中降低雞蛋膽固醇的方法，即飼料不用乳酸菌發(fā)酵，也不與中藥成分復(fù)配，就能達(dá)到降低雞蛋膽固醇的效果。因此本專利操作簡單，成本低廉，適合規(guī)?；B(yǎng)殖生產(chǎn)低膽固醇雞蛋。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠降低雞蛋膽固醇含量的方法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
所述方法中，提供的菌種是：副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)KL1，分離篩選自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏靈菇(又稱開菲爾粒)，并已于2015年10月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)為：CGMCC No.11533(菌株KL1)。
所述方法中，副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)KL1在含有碳酸鈣和納他霉素的MRS選擇性培養(yǎng)基上，菌株的菌落大小2～3mm，表面粗糙如雪花狀，邊緣不規(guī)則，無光澤，扁平，灰白色，半透明，菌落有較高黏性；個(gè)體形態(tài)呈桿狀，長短不等，短鏈狀排列，有時(shí)菌體呈球形，G+無芽孢桿菌。
為了確定副干酪乳桿菌在生產(chǎn)低膽固醇雞蛋中的作用，將該菌制成活菌制劑進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。
所述方法中，選擇體重相近、健康無病的30周齡的120只農(nóng)大3號(hào)矮小蛋雞，隨機(jī)分為4組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)有蛋雞10只；空白對照組不添加副干酪乳桿菌KL1活菌制劑，只飼喂基礎(chǔ)日糧；試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加活菌數(shù)為5.4×1010CFU/g以上的副干酪乳桿菌KL1活菌制劑，并按低、中、高劑量活菌制劑，每個(gè)試驗(yàn)組每只蛋雞攝入副干酪乳桿菌KL1的活菌數(shù)分別為105CFU/d、106CFU/d、107CFU/d，飼喂添加菌劑飼料的時(shí)間為每天上午8:00～9:00，提前將120只雞禁食1h，確保其盡快將含菌飼料攝入，避免菌體在飼料中繁殖，以保證每日菌劑攝入量一致。采用三層階梯式單雞籠養(yǎng)雞舍飼養(yǎng)蛋雞，高床平養(yǎng)，每日光照16h。控溫風(fēng)機(jī)縱向負(fù)壓通風(fēng)，飲水器為乳頭式，人工喂料和撿蛋，自由采食、自由飲水。動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行11周，期間測定雞蛋膽固醇含量和血清中膽固醇含量。
所述方法中，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，將活菌數(shù)為5.4×1010CFU/g以上的副干酪乳桿菌KL1活菌制劑添加到蛋雞基礎(chǔ)日糧中，添加量為每只蛋雞每日攝入106CFU、107CFU，飼喂含菌劑飼料至8～10周，能夠顯著降低蛋黃膽固醇含量，降低雞蛋黃中的膽固醇含量近11％。
所述方法中，所得產(chǎn)膽鹽水解酶的副干酪乳桿菌活菌制劑的活菌數(shù)量可達(dá)5.4×1010CFU/g以上。由于此種活菌制劑活菌含量較高，作為蛋雞生物飼料添加劑，既可提高蛋雞的產(chǎn)蛋率、蛋殼質(zhì)量和蛋黃相對重量，又可利用副干酪乳桿菌產(chǎn)生膽鹽水解酶的特性，達(dá)到降低雞蛋膽固醇含量的目的。本發(fā)明不僅具有提高蛋雞生產(chǎn)性能的效果，而且具有增強(qiáng)蛋雞抗氧化力，減輕蛋雞脂肪肝的作用，同時(shí)操作簡單，成本低廉，適合規(guī)模化養(yǎng)殖生產(chǎn)低膽固醇雞蛋。
上述方法，利用高活菌數(shù)產(chǎn)膽鹽水解酶的副干酪乳桿菌KL1活菌制劑降低雞蛋膽固醇的方法與專用生產(chǎn)菌株屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明而不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為體積分?jǐn)?shù)。
1、菌種的活化和擴(kuò)大培養(yǎng)
將甘油冷凍保藏管保種的副干酪乳桿菌KL1菌種，以改良MRS液體培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)12～14h，活化2～3代，冷藏備用；將活化好的菌液以2％的接種量移種至改良培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)12～14h，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液。
改良MRS培養(yǎng)基成分：葡萄糖10g、大豆蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母干粉5g、檸檬酸二銨2g、磷酸氫二鉀2g、乙酸鈉5g、七水合硫酸鎂0.58g、四水合硫酸錳0.25g、吐溫-80 1mL、蒸餾水1 000mL，調(diào)節(jié)pH為6.4，115℃滅菌20min。
2、高密度發(fā)酵
將2L改良MRS培養(yǎng)基加入到5L全自動(dòng)發(fā)酵罐中，利用發(fā)酵罐滅菌系統(tǒng)于115℃滅菌15min，利用冷水機(jī)將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基冷卻至發(fā)酵溫度。將KL1菌株擴(kuò)大培養(yǎng)液按3％(V/V，體積分?jǐn)?shù))的接種量移種至改良MRS培養(yǎng)基中，于40℃發(fā)酵20h，發(fā)酵過程中以流加10％(W/V，質(zhì)量體積比濃度)的滅菌Na2CO3溶液控制發(fā)酵液pH6.4，攪拌轉(zhuǎn)速為55r/min，采用改良MRS瓊脂培養(yǎng)基以傾注平板培養(yǎng)法檢測發(fā)酵液中的活菌數(shù)量，每個(gè)稀釋度設(shè)3次重復(fù)，測定發(fā)酵液中KL1菌株活菌數(shù)為(8.0～8.2)×109CFU/mL。
3、活菌制劑的制備
取1L副干酪乳桿菌KL1發(fā)酵液于4℃、5000r/min離心15min，棄上清液，收集菌泥；將凍干保護(hù)劑分裝于600mL的凍干瓶中，每個(gè)凍干瓶裝量為100mL；每瓶加入1L發(fā)酵液離心所得的菌泥(即凍干保護(hù)劑∶離心前發(fā)酵液＝1∶10體積)，混合均勻后，得到濃縮活菌制劑；將濃縮活菌制劑于-34℃低溫冰箱中預(yù)凍15h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù)凍活菌制劑。利用6L LABCONCO真空冷凍干燥機(jī)(美國)將預(yù)凍活菌制劑于-55℃、真空度0.16mBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)，得到凍干活菌制劑，于-35℃低溫保藏待用。
以改良MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注平板培養(yǎng)法測定凍干菌粉的活菌數(shù)量，取10-7、10-8、10-9三個(gè)稀釋度設(shè)3次重復(fù)，37℃恒溫箱培養(yǎng)24～36h，計(jì)數(shù)活菌制劑中KL1菌株的活菌數(shù)為5.4×1010CFU/g。
4、動(dòng)物試驗(yàn)
選擇體重相近、健康無病的30周齡的120只農(nóng)大3號(hào)矮小蛋雞，隨機(jī)分為4組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)有蛋雞10只；空白對照組不添加副干酪乳桿菌KL1活菌制劑，只飼喂基礎(chǔ)日糧；試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加活菌數(shù)為5.4×1010CFU/g以上的副干酪乳桿菌KL1活菌制劑，并按低、中、高劑量活菌制劑，每個(gè)試驗(yàn)組每只蛋雞攝入副干酪乳桿菌KL1的活菌數(shù)分別為105CFU/d、106CFU/d、107CFU/d，飼喂添加菌劑飼料的時(shí)間為每天上午8:00～9:00，提前將120只蛋雞禁食1h，確保其盡快將含菌飼料攝入，避免菌體在飼料中繁殖，以保證每日菌劑攝入量一致。
試驗(yàn)采用三層階梯式單雞籠養(yǎng)雞舍飼養(yǎng)蛋雞，高床平養(yǎng)，每日光照16h?？販仫L(fēng)機(jī)縱向負(fù)壓通風(fēng)，飲水器為乳頭式，人工喂料和撿蛋，自由采食、自由飲水。正式試驗(yàn)期為11周。每兩周采集雞蛋樣品，測定其蛋黃膽固醇含量。采集血清樣品，測定其血清膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量。試驗(yàn)結(jié)果如下：
(1)蛋黃膽固醇含量
表1 副干酪乳桿菌KL1對蛋黃中膽固醇含量的影響(n＝15)(mg/g蛋黃)
注：*代表與空白對照組比較P＜0.05，差異顯著；**代表與空白對照組比較P＜0.01，差異極顯著。
由表1可見，隨著飼喂副干酪乳桿菌KL1活菌制劑的周期時(shí)間延長，各試驗(yàn)組蛋雞的蛋黃膽固醇含量呈下降趨勢。至8～10周，低、中、高劑量試驗(yàn)組蛋黃中的膽固醇含量極顯著低于空白對照組(P＜0.01)，最終趨于一個(gè)近似值。其中，中、高劑量試驗(yàn)組蛋黃中的膽固醇含量降低了近11％，表明蛋雞日糧中添加量為每只雞每日攝入106、107CFU時(shí)，能夠顯著降低雞蛋黃膽固醇含量。
(2)蛋雞血清膽固醇、甘油三酯、高密度膽固醇、低密度膽固醇含量
1)副干酪乳桿菌KL1對血清總膽固醇(TC)的影響
表2 副干酪乳桿菌KL1對血清總膽固醇含量的影響(n＝12)(mmol/L)
注：*代表與空白對照組比較P＜0.05，差異顯著；**代表與空白對照組比較P＜0.01，差異極顯著。
由表2可知，隨著飼喂副干酪乳桿菌KL1活菌制劑的周期時(shí)間延長，蛋雞血清總膽固醇明顯呈下降趨勢。至10周，高、中、低劑量試驗(yàn)組極顯著低于空白對照組(P＜0.01)。試驗(yàn)最后階段，低、中、高劑量3個(gè)試驗(yàn)組蛋雞血清總膽固醇含量相對于空白對照組分別降低了32.9％、30.6％、32.9％。
2)副干酪乳桿菌KL1對血清甘油三酯(TG)的影響
表3 副干酪乳桿菌KL1對血清甘油三酯含量的影響(n＝12)(mmol/L)
注：*代表與空白對照組比較P＜0.05，差異顯著；**代表與空白對照組比較P＜0.01，差異極顯著。
由表3可見，隨著飼喂副干酪乳桿菌KL1活菌制劑的周期時(shí)間延長，蛋雞血清甘油三酯明顯呈下降趨勢。至10周，高、中、低劑量試驗(yàn)組極顯著低于空白對照組(P＜0.01)。試驗(yàn)最后階段，低、中、高劑量3個(gè)試驗(yàn)組蛋雞血清甘油三酯含量相對于空白對照組分別降低了36.5％、34.0％、39.2％。
3)副干酪乳桿菌KL1對血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的影響
表4 副干酪乳桿菌KL1對血清高密度脂蛋白膽固醇含量的影響(n＝12)(mmol/L)
注：*代表與空白對照組比較P＜0.05，差異顯著；**代表與空白對照組比較P＜0.01，差異極顯著。
由表4可知，隨著飼喂副干酪乳桿菌KL1活菌制劑的周期時(shí)間延長，試驗(yàn)組蛋雞血清高密度脂蛋白膽固醇基本呈增長趨勢。至10周，高劑量試驗(yàn)組極顯著高于空白對照組(P＜0.01)，中劑量試驗(yàn)組顯著高于空白對照組(P＜0.05)。試驗(yàn)最后階段，低、中、高劑量3個(gè)試驗(yàn)組蛋雞血清高密度脂蛋白膽固醇含量相對于空白對照組分別提高了8.3％、12.5％、19.4％。
4)副干酪乳桿菌KL1對血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的影響
表5 副干酪乳桿菌KL1對低密度脂蛋白膽固醇含量的影響(n＝12)(mmol/L)
注：*代表與空白對照組比較P＜0.05，差異顯著。
由表5可見，隨著飼喂副干酪乳桿菌KL1活菌制劑的周期時(shí)間延長，試驗(yàn)組蛋雞血清低密度脂蛋白膽固醇基本呈下降趨勢。至10周，高劑量試驗(yàn)組顯著低于空白對照組(P＜0.05)。試驗(yàn)最后階段，低、中、高劑量3個(gè)試驗(yàn)組蛋雞血清低密度脂蛋白膽固醇含量相對于空白對照組分別降低了11.9％、22.0％、23.7％。
綜上所述，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明將活菌數(shù)為5.4×1010CFU/g以上的副干酪乳桿菌KL1活菌制劑添加于蛋雞基礎(chǔ)日糧中，添加量為106CFU/(只·d)、107CFU/(只·d)，飼喂含菌劑飼料至8～10周，能夠顯著降低蛋黃膽固醇含量，降低雞蛋黃中的膽固醇含量近11％。顯示本發(fā)明所述副干酪乳桿菌KL1活菌制劑具有良好降低蛋黃膽固醇作用，對生產(chǎn)低膽固醇雞蛋具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
本專利所屬項(xiàng)目1：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)“抗病轉(zhuǎn)基因羊新品種培育”
項(xiàng)目編號(hào)：2014ZX08008-005
項(xiàng)目起止時(shí)間：2014.01-2015.12
項(xiàng)目負(fù)責(zé)人：劉慧
本專利所屬項(xiàng)目2：北京市自然科學(xué)基金“藏靈菇益生菌產(chǎn)生物活性物質(zhì)及生理功能的研究”
項(xiàng)目編號(hào)：5062006
項(xiàng)目起止時(shí)間：2006.01-2008.12
項(xiàng)目負(fù)責(zé)人：劉慧