一種提高青蒿中青蒿素含量的方法與流程

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種采用四個關鍵酶基因ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1共轉(zhuǎn)化提高青蒿中青蒿素含量的方法以及制備的轉(zhuǎn)基因青蒿。

背景技術：

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯化合物——青蒿素，是目前應用最廣泛，療效最好的抗瘧疾藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，青蒿素聯(lián)合療法(ACTs)是世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量很低，尚無法完全滿足全球的市場需求。青蒿具有分泌型腺毛(glandular trichomes)和非分泌型腺毛(non-glandular trichomes)。在青蒿葉片的近軸面和遠軸面、莖稈、花上都大量存在分泌型腺毛，這里是大量次生代謝物的合成和累積場所，青蒿素也被認為合成和儲存于此處。

目前，青蒿素的主要來源是從植物青蒿中提取獲得，作為青蒿中重要的一種植物次生代謝產(chǎn)物，其在青蒿中的含量非常低，大約為青蒿葉片干重的0.1％-1％，且青蒿素含量與青蒿品種、季節(jié)、生長環(huán)境、生長時期等密切相關。極低的生物含量與極大的市場需求，導致青蒿素價格居高不下。

雖然目前通過合成生物學化學半合成青蒿素獲得較大突破，將青蒿素生物合成途徑中的多步關鍵酶基因?qū)虢湍富蚪M，成功在酵母中獲得高產(chǎn)量的青蒿酸，青蒿酸再在體外經(jīng)過化學方法合成獲得青蒿素，該方法在實驗室階段獲得成功，但是通過酵母發(fā)酵半合成前期設備成本較大，維護較難，且產(chǎn)量有限，不能完全滿足市場需求。因此通過雜交育種，分子育種，基因工程育種等生物技術手段提高植物青蒿中青蒿素含量的方法仍然具有很大的競爭力和應用價值。

因此，本領域的技術人員致力于開發(fā)一種基因工程方法，打破青蒿素生物合成限速瓶頸，從而獲得青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株，為規(guī)?；a(chǎn)青蒿素提供一條新途徑。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種提高青蒿中青蒿素含量的方法及轉(zhuǎn)基因青蒿。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一方面提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，將紫穗槐二烯合成酶ADS基因、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶CYP71AV1基因、細胞色素P450還原酶CPR基因和乙醛脫氫酶ALDH1基因共轉(zhuǎn)化青蒿。

進一步地，ADS基因的序列如SEQ ID No.1所示，CYP71AV1基因的序列如SEQ ID No.2所示，CPR基因的序列如SEQ ID No.3所示，ALDH1基因的序列如SEQ ID No.4所示。

進一步地，該方法包括步驟：

1)采用基因克隆方法獲得ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因；

2)將ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因連接于表達調(diào)控序列，形成含ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因的植物表達載體；

3)將含ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因的植物表達載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因的植物表達載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；

4)將含ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因的植物表達載體的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得轉(zhuǎn)基因青蒿植株。

進一步地，步驟2)中，含ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因的植物表達載體的構(gòu)建包括如下步驟：分別將ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因連接到中間載體上，經(jīng)雙酶切后將ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因分別連入表達載體上，獲得CaMV 35S-ADS-nos、CaMV 35S-CYP71AV1-nos、CaMV 35S-CPR-nos和CaMV 35S-ALDH1-nos表達盒；通過無縫克隆技術將CaMV 35S-ADS-nos、CaMV 35S-CYP71AV1-nos、CaMV35S-CPR-nos和CaMV 35S-ALDH1-nos表達盒連入另一表達載體中，獲得所述植物表達載體。

優(yōu)選地，所述中間載體為pMD18T，所述表達載體為pCAMBIA1304，所述另一表達載體為pCAMBIA2300。

進一步地，步驟3)中，采用凍融法將所述植物雙元表達載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。

進一步地，步驟4)中，根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，包括外植體培養(yǎng)；根癌農(nóng)桿菌菌株與外植體的共培養(yǎng)；抗性再生植株的篩選；其中，共培養(yǎng)時，將外植體轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，滴加根癌農(nóng)桿菌，使外植體與菌液充分接觸；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為1/2MS+AS 100μmol/L。

進一步地，該方法還包括步驟5)，對獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中的青蒿素含量進行高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器測定，獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。

進一步地，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器測定包括：色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相為甲醇：水，其中，甲醇：水的體積比為60：40，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進樣量20μL，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40℃，載氣壓力5bar。

本發(fā)明的另一方面提供了一種青蒿素含量提高的青蒿，該青蒿中共轉(zhuǎn)化有ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因。

本發(fā)明采用基因工程手段，將ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因共轉(zhuǎn)化青蒿，增強了青蒿的代謝途徑，打破青蒿素生物合成限速瓶頸，從而獲得青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株，為規(guī)?；a(chǎn)青蒿素提供一條新途徑。并且ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因按該順序依次連接到載體中進行轉(zhuǎn)化后，能篩選獲得青蒿含量更高的青蒿植株。

以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術效果作進一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說明

圖1本發(fā)明的一個較佳實施中的雙元表達載體p2300：ADS+CYP+CPR+ALDH1的載體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2本發(fā)明的一個較佳實施中的獨立的轉(zhuǎn)基因青蒿株系中目的基因PCR檢測結(jié)果圖；其中，M為DL 2000DNA marker；PC為質(zhì)粒；NC為陰性對照；WC為水對照；3、22、46、63、67、70為選取的轉(zhuǎn)基因青蒿株系；

圖3本發(fā)明的一個較佳實施的青蒿中青蒿素含量檢測結(jié)果圖；其中CK為空白對照。

具體實施方式

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1、青蒿ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的克隆

紫穗槐二烯合酶(ADS)是青蒿素生物合成特有途徑的第一個關鍵酶，是ADS酶的催化作用，將青蒿中的萜類代謝流向了青蒿素合成的方向。P450家族的單加氧酶CYP71AV1(紫穗槐-4,11-二烯氧化酶)是一個多功能酶，在青蒿素合成途徑中能連續(xù)三步催化，將紫穗槐二烯最終催化生成青蒿酸。其分子伴侶CPR酶(細胞色素P450還原酶)在體外實驗中發(fā)現(xiàn)能幫助CYP71AV1酶催化上述反應過程。乙醛脫氫酶ALDH1能將二氫青蒿醛轉(zhuǎn)變成二氫青蒿酸。

本實施例采用基因克隆的方法從青蒿中獲得序列正確的青蒿素生物合成關鍵酶基因ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1，為通過四個關鍵酶基因共同轉(zhuǎn)化策略提高青蒿中青蒿素含量提供了四個重要的關鍵酶基因。

1.青蒿基因組總RNA的提取

取青蒿葉片組織，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)離心管中，充分振蕩后，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA濃度與純度。

2.青蒿ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的克隆

以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA；根據(jù)青蒿ADS基因的編碼序列(SEQ ID No.1所示)，CYP71AV1基因的編碼序列(SEQ ID No.2所示)，CPR基因的編碼序列(SEQ ID No.3所示)和ALDH1基因的編碼序列(SEQ ID No.4所示)分別設計擴增出完整的編碼框的上下游引物，即ADS-F和ADS-R、CYP71AV1-F和CYP71AV1-R、CPR-F和CPR-R以及ALDH1-F和ALDH1-R，這些引物的具體序列如表1所示。擴增反應體系如表4所示。

通過PCR，使用高保真酶、引物ADS-F和ADS-R、CYP71AV1-F和CYP71AV1-R、CPR-F和CPR-R、ALDH1-F和ALDH1-R從總cDNA中分別擴增ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因并測序。DNA測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。測序結(jié)果表明，所克隆的序列與GenBank中所報道的青蒿ADS基因的編碼序列(SEQ ID No.1所示)，CYP71AV1基因的編碼序列(SEQ ID No.2所示)，CPR基因的編碼序列(SEQ ID No.3所示)和ALDH1基因的編碼序列(SEQID No.4所示)的一致。

表1：PCR引物

實施例2、含ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的植物表達載體的構(gòu)建

1、中間載體的構(gòu)建

選用pMD18T載體(Takara,Dalian)作為克隆載體，構(gòu)建中間載體pMD18T-ADS、pMD18T-CYP71AV1、pMD18T-CPR和pMD18T-ALDH1。在ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因兩側(cè)分別通過引物ADS-SpeI-F和ADS-BstEII-R、CYP71AV1-SpeI-F和CYP71AV1-BstEII-R、CPR-SpeI-F和CPR-BstEII-R以及ALDH1-SpeI-F和ALDH1-BstEII-R引入SpeI和BstEII酶切位點，引物序列如表2所示。本領域技術人員可知，限制性內(nèi)切酶位點也可以根據(jù)后續(xù)適用載體的不同而有所變化。

將帶有酶切位點的全長基因通過T4連接酶連接到pMD18T載體上，測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

表2：PCR引物

2、植物基因表達盒的構(gòu)建

以pCAMBIA1304為表達載體，將ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1分別連入其對應的酶切位點位置。具體地，分別用SpeI和BstEII雙酶切中間載體pMD18T-ADS、pMD18T-CYP71AV1、pMD18T-CPR和pMD18T-ALDH1以及表達載體pCAMBIA1304，純化ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1片段以及pCAMBIA1304大片段。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑取單克隆，做PCR菌液檢測單克隆，陽性單克隆送測序。測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。此方法可獲得ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1的基因表達盒：CaMV 35S-ADS-nos、CaMV 35S-CYP71AV1-nos、CaMV 35S-CPR-nos和CaMV 35S-ALDH1-nos。

3、植物表達載體的構(gòu)建

將以上構(gòu)建的CaMV 35S-ADS-nos、CaMV 35S-CYP71AV1-nos、CaMV35S-CPR-nos和CaMV 35S-ALDH1-nos表達盒依次連接于表達載體pCAMBIA2300中即可得到植物表達載體pCAMBIA2300+ADS+CYP71AV1+CPR+ALDH1。具體地，應用無縫克隆技術將CaMV 35S-ADS-nos、CaMV 35S-CYP71AV1-nos、CaMV35S-CPR-nos和CaMV 35S-ALDH1-nos表達盒分別連入pCAMBIA2300的EcoRI、BamHI、XbaI和PstI酶切位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，測序。引物序列如表3所示，測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。構(gòu)建的植物表達載體示意圖如圖1所示。

表3 PCR引物

表4 PCR的反應體系

本實施例將青蒿素生物合成途徑關鍵酶基因ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1可操作性連接于表達調(diào)控序列，形成含ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的植物表達載體，該表達載體可用于通過代謝工程策略來提高青蒿中青蒿素的含量。

實施例3、根癌農(nóng)桿菌介導ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因遺傳轉(zhuǎn)化青蒿獲得轉(zhuǎn)基因植株

1.含ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因植物表達載體根癌農(nóng)桿菌工程菌的獲得

將實施例2中獲得的含ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的植物表達載體采用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105，為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambar 1)，并進行PCR驗證。結(jié)果表明，含ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的植物表達載體已成功轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌菌株中。

在采用凍融法將植物表達載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中時，在冰浴融化的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中加入植物表達載體后，先在42℃水浴30秒，然后轉(zhuǎn)到37℃水浴5分鐘，能更將轉(zhuǎn)化率提高大約25％。

2.根癌農(nóng)桿菌介導ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因轉(zhuǎn)化青蒿

2.1.外植體的預培養(yǎng)

青蒿種子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡10min，無菌水沖洗3-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固體培養(yǎng)基中，25℃、16h/8h(光/暗)光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。

2.2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)

將所述的葉片外植體，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的植物表達載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28℃暗培養(yǎng)3天。以滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對照。

2.3.抗性再生植株的篩選

將所述的共培養(yǎng)3天的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h(光/暗)光照培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培養(yǎng)至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。

在2.2步驟農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)中，意外的發(fā)現(xiàn)當在活化好的含ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的植物表達載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液中加入2％的PEG2000，再與外植體充分接觸共培養(yǎng)時，能得到更多的Kan抗性再生青蒿植株，相對于不添加PEG2000的共培養(yǎng)獲得的Kan抗性再生青蒿植株多約20％。

3.轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測

根據(jù)目的基因所在表達盒上游的35S啟動子區(qū)域和ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1分別設計正向引物設計對目的基因進行檢測。設計的引物序列如下所示：

35SF：ATGCCATCATTGCGATAAAGG

ADSR：CTAGCCCGGGAATACTGTGGCT

CYPR：AGGTTAACCGGTCTCCCTGAACC

CPRR：CCTTTCTCTTCACCCTCGG

ALDH1R：TTCATCGATCAAGTCTGCG。

結(jié)果表明，利用所設計的PCR特異引物，能擴增出特異DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段，結(jié)果如圖2所示。

本實施例將所述的植物表達載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的植物表達載體的根癌農(nóng)桿菌菌株，利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。

實施例4、利用HPLC測定轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量

1.HPLC條件及系統(tǒng)適用性以及標準溶液的配制

HPLC：采用water alliance 2695系統(tǒng)，使用Waters C18柱，青蒿素測定流動相使用甲醇：水體積比60％：40％；柱溫為30℃，流速為1.0mL/min；ELSD檢測系統(tǒng)為water alliance 2420，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度為40℃，放大系數(shù)為7，載氣壓力5bar；青蒿素出峰時間為7min左右。青蒿素進樣體積為20uL。根據(jù)標準品的濃度和峰面積計算出樣品中的青蒿素含量，再除以青蒿粉末干重，從而計算出青蒿素占樣品干重的含量。精密稱取青蒿素標準品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素標準品溶液，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.樣品的制備

選取實施例3中獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿植株中的3株進行測定，以不含ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化青蒿植株為陰性對照，在青蒿植株的上、中和下部取新鮮的青蒿葉片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后從烘干的枝條上敲下葉片，磨成粉末。稱取約0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL甲醇，用40W超聲波處理30min，5000rpm離心10min，取上清用0.22μm濾膜過濾，即可用于HPLC測定。

本發(fā)明中共轉(zhuǎn)化ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因顯著提高了青蒿中青蒿素的含量，結(jié)果如圖3所示。共轉(zhuǎn)化ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的青蒿中青蒿素的含量最高可達到27mg/g DW，是非轉(zhuǎn)化普通青蒿(mg/g DW)的3.4倍。

本實施例采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器HPLC-ELSA法測定了轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量，采用共轉(zhuǎn)化ADS、CYP71AV1、CPR和ALDH1基因的代謝工程策略獲得了青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株，為規(guī)?；a(chǎn)青蒿素提供了一種理想方法。

以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權(quán)利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。

序列表

<110> 上海交通大學

<120> 一種提高青蒿中青蒿素含量的方法

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1641

<212> DNA

<213> 青蒿（Artemisia annua L.）

<400> 1

atgtcactta cagaagaaaa acctattcgc cccattgcca actttcctcc aagcatttgg 60

ggagatcagt ttctcatcta tgaaaagcaa gtagagcaag gggtggaaca gatagtgaat 120

gatttaaaaa aagaagtgcg gcaactacta aaagaagctt tggatattcc tatgaaacat 180

gccaatttat tgaagctgat tgatgaaatc caacgccttg gaataccgta tcactttgaa 240

cgggagattg atcatgcatt gcaatgtatt tatgaaacat atggtgataa ctggaatggt 300

gaccgctctt ccttatggtt ccgtcttatg cgaaagcaag gatattatgt tacatgtgat 360

gttttcaata actataaaga caaaaatgga gcgttcaagc aatcgttagc taatgatgtt 420

gaaggtttgc ttgagttgta cgaagcaact tctatgaggg tacctgggga gattatatta 480

gaagatgctc ttggttttac acgatctcgt cttagcatta tgacaaaaga tgctttttct 540

acaaaccccg ctctttttac cgaaatacaa cgggcactaa agcaacccct ttggaaaagg 600

ttgccaagaa tagaggcggc gcagtacatt cctttctatc aacaacaaga ttctcataac 660

aagactttac ttaaacttgc taagttagag ttcaatttgc ttcagtcatt gcacaaggaa 720

gagctcagcc atgtgtgcaa atggtggaaa gctttcgata tcaagaagaa cgcaccttgt 780

ttaagagata gaattgttga atgctacttt tggggactag gttcaggcta tgagccacag 840

tattcccggg ctagagtttt cttcacaaaa gctgttgctg ttataactct tatagatgac 900

acttatgatg cgtatggtac ttatgaagaa cttaagatct ttactgaagc tgttgaaagg 960

tggtcaatta catgcttaga cacacttcca gaatacatga aaccgatata caaattattc 1020

atggatacat acacagaaat ggaagaattt cttgcaaagg agggaagaac agatctattt 1080

aactgcggca aagaatttgt gaaagagttt gttagaaacc tgatggttga agcaaaatgg 1140

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aaggaagtag aagatgtgtg gaaagatata aaccgagagt acctcacaac taaaaacatt 1500

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gtttatccta tgagtatatg a 1641

<210> 2

<211> 1488

<212> DNA

<213> 青蒿（Artemisia annua L.）

<400> 2

atgaagagta tactaaaagc aatggcactc tcactgacca cttccattgc tcttgcaacg 60

atccttttgt tcgtttacaa gttcgctact cgttccaaat ccaccaaaaa aagccttcct 120

gagccatggc ggcttcccat tattggtcac atgcatcact tgattggtac aacgccacat 180

cgtggggtta gggatttagc cagaaagtat ggatctttga tgcatttaca gcttggtgaa 240

gttccaacaa tcgtggtgtc atctccgaaa tgggctaaag agattttgac aacgtacgac 300

attacctttg ctaacaggcc cgagacttta actggtgaga ttgttttata tcacaatacg 360

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gttttcaagt tgattgcaac gatacttagt agagccgcat ttgggaaagg gatcaaggac 600

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gcagatatct ttccttcaaa gaaatttctt catcatcttt cgggcaagag agctcggtta 720

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ggcacagaca cttcctcatc cacaatcgaa tgggcgattt cggaactcat aaagtgtccg 960

aaagcaatgg agaaagtaca agcggaattg aggaaagcat tgaacggaaa agaaaagatc 1020

catgaggaag acattcaaga actaagctac ttgaacatgg taatcaaaga aacattgagg 1080

ttgcaccctc cactaccctt ggttctgcca agagagtgcc gccaaccagt caatttggct 1140

ggatacaaca tacccaataa gaccaaactt attgtcaacg tctttgcgat aaatagggac 1200

cctgaatatt ggaaagacgc tgaagctttc atccctgaac gatttgaaaa tagttctgca 1260

actgtcatgg gtgcagaata cgagtatctt ccgtttggag ctgggagaag gatgtgtcct 1320

ggagccgcac ttggtttagc taacgtgcag ctcccgctcg ctaatatact atatcatttc 1380

aactggaaac tccccaatgg tgtgagctat gaccagatcg acatgaccga gagctctgga 1440

gccacgatgc aaagaaagac tgagttgtta ctcgttccaa gtttctag 1488

<210> 3

<211> 2115

<212> DNA

<213> 青蒿（Artemisia annua L.）

<400> 3

atgcaatcaa caacttccgt taagttatct cccttcgatc taatgacggc gttacttaac 60

ggcaaggtat cgttcgacac atcaaacaca tccgatacga atattccgtt agcggtgttt 120

atggagaatc gtgagctttt gatgatttta actacttcag ttgcggtgtt gatcggatgc 180

gttgtggtgc ttgtgtggag acggtcgtcg tcggcggcga agagagcggc ggagtcgccg 240

gtgattgttg tgccgaagaa agtgacggag gatgaggttg atgatggacg gaagaaagtt 300

actgtgtttt ttggaactca gactggtact gctgaaggtt ttgctaaggc gcttgttgaa 360

gaagctaaag cgcgatatga aaaggcggtg tttaaagtga ttgatttgga tgattatgct 420

gctgaagatg atgagtatga ggagaagtta aagaaagaat ctcttgcttt tttcttttta 480

gctacgtatg gagatggtga gccgacagat aatgctgcta gattctataa atggtttacc 540

gagggtgaag agaaaggtga atggcttgaa aagcttcaat acgcagtgtt tggacttggt 600

aacagacagt atgagcattt caacaagatt gcgaaggtgg tcgatgaaaa acttacggaa 660

cagggtgcaa agcgccttgt tcctgttggc atgggagacg acgatcaatg tattgaagac 720

gacttcactg catggaaaga gttggtgtgg cctgagttgg atcaattact tcgtgatgag 780

gatgatacat ctgttgccac cccatacaca gctgctgttg cagaataccg tgttgtgttc 840

catgataaac cagagacata tgatcaggat caactgacaa atggccatgc tgttcatgat 900

gctcaacatc catgcagatc caatgtagct gtcaaaaagg agctccattc ccctctatct 960

gaccgttctt gcactcattt ggaatttgat atctctaata ctggattatc gtatgaaact 1020

ggggaccatg ttggagtcta cgttgagaat ctaagtgaag ttgtggacga agctgaaaaa 1080

ttaataggtt taccgccgca cacttatttc tcaatacacg ctgataacga agacgggaca 1140

ccacttggtg gagcctcttt gccacctcct ttccctccat gcactttaag aaaagcattg 1200

gcttcctatg ccgatgtttt gagctctcct aaaaagtcag ctttgcttgc tttagctgct 1260

catgctactg attctactga agctgataga ctgaaatttc ttgcgtctcc tgcgggaaag 1320

gatgaatatg ctcagtggat agttgcaagc cacagaagtc tccttgaggt catggaggcc 1380

ttcccatcag ctaagcctcc gcttggtgtt ttttttgcat ctgtcgcccc acgtttgcag 1440

ccgagatact attccatttc ttcttcccca aagtttgcgc caaataggat tcatgtaact 1500

tgtgcattag tgtatgagca aacaccatca ggccgcgttc acaagggagt ctgttcaaca 1560

tggatgaaga atgctgtgcc tatgacagaa agccaggatt gcagttgggc cccaatttat 1620

gttagaacat ccaatttcag acttccttct gatcctaagg tcccagttat catgattggc 1680

ccaggcactg gattggctcc atttagaggt ttccttcagg aaaggttagc tcagaaggaa 1740

gctgggactg agctcggaac agccatctta ttcttcggat gcaggaatcg caaagtggat 1800

ttcatatatg aggacgagct taataatttc gtggagactg gggctctttc cgagcttgtt 1860

acggccttct ctcgtgaagg tgccactaag gagtacgtgc aacacaagat gactcagaag 1920

acttcggata tctggaattt actctctgag ggagcatatt tgtatgtttg cggtgatgcc 1980

aaaggcatgg ccaaagatgt acatcggact ctgcacacta ttgtgcaaga acagggatct 2040

ctagactcct caaaggcgga gctctacgtg aagaatctac aaatggcagg aagatatctc 2100

cgtgatgtat ggtaa 2115

<210> 4

<211> 1500

<212> DNA

<213> 青蒿（Artemisia annua L.）

<400> 4

atgagctcag gagctaatgg aagttctaag tcagcaagcc ataaaatcaa gttcaccaag 60

ctttttatca atggcgaatt tgttgattct atttcaggaa acacttttga cacgattaat 120

ccagcgacag aagaagtgtt agcaacagtg gccgaaggaa gaaaggaaga cattgatttg 180

gccgttaagg ctgcccgtga agctttcgac aatggacctt ggcctcgcat gtctggcgag 240

gcacgccgaa aaatcatgtt aaagttcgca gacttgatcg atgaaaatgc tgacgagtta 300

accaccttag aagtaatcga tggaggaaaa ttgtttggcc cagtgaggca ctttgaagtc 360

ccggtttcat cagatacatt tcgttacttt gcgggtgcag ccgataaaat ccgtggagca 420

actcttaaaa tgtcaagtaa tattcaagct tatacgctac gtgaacccat cggagtagtt 480

ggtcacatca ttccttggaa tggtcctgcc ttcatgttcg ctacaaaggt tgcaccagct 540

ttagctgctg gctgcaccat ggtcatcaag cctgccgaac atactcccct tacagttctc 600

tttttagctc acctgtcgaa gctggctggt gttcctgatg gcgtgattaa tgtggttaac 660

gggtttggaa aaactgctgg tgctgccgtt agctcgcata tggacattga catggttact 720

tttacgggat ccacagaagt tggccgcacc gtaatgcaag ctgcagctct aagtaatctg 780

aaaccagtgt cactcgaact tggaggaaaa tcgcctttga ttgttttcga tgatgcagat 840

gttgataaag ccgcagaatt tgctattttg ggaaatttta ctaacaaagg tgagatgtgt 900

gtggcagggt ctcgtgtttt cgttcaggaa gggatccatg acgtattcgt aaaaaaattg 960

gaaggagcgg tgaaagcgtg ggcaacaagg gacccttttg atctcgccac tcgtcatgga 1020

cctcagaata acaaacaaca atatgataaa gtactttcat gcatcaacca tggcaaaaag 1080

gaaggtgcga ctttggtaac cggtggtaag ccatttggga agaaaggata ctacattgag 1140

cctactctat ttacaaacgt tacggatgat atgaccatag caaaggaaga aatttttggc 1200

cccgttatat ctgttctcaa gttcaagact gttgaagaag tgattaaaag agcaaatgcc 1260

acaaaatatg gacttgcctc aggtgtattc accaaaaata ttgatgtcgt gaacacagtt 1320

tcgagatcta ttcgagcagg tgctgtttgg gtcaactgtt atttagcact cgaccgggat 1380

gcacctcatg gagggtataa aatgagtggg tttggacgag aacaaggatt agaggcactt 1440

gaacattatc ttcagattaa gacagtggct acacccatat atgattcccc gtggctttaa 1500

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADS-F

<400> 5

atgtcactta cagaagaaaa acc 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADS-R

<400> 6

tcatatactc ataggataaa cgag 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP71AV1-F

<400> 7

atggcactct cactgaccac ttcc 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP71AV1-R

<400> 8

ctagaaactt ggaacgagta acaac 25

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CPR-F

<400> 9

atgcaatcaa caacttccgt taagttatc 29

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CPR-R

<400> 10

ttaccataca tcacggagat atc 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALDH1-F

<400> 11

atgagctcag gagctaatgg aag 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALDH1-R

<400> 12

ttaaagccac ggggaatcat atat 24

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADS-SpeI-F

<400> 13

ggactagtat gtcacttaca gaagaaaaac c 31

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADS-BstEII-R

<400> 14

gggttacctc atatactcat aggataaacg ag 32

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP71AV1-SpeI-F

<400> 15

ggactagtat ggcactctca ctgaccactt cc 32

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP71AV1-BstEII-R

<400> 16

gggttaccct agaaacttgg aacgagtaac aac 33

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CPR-SpeI-F

<400> 17

ggactagtat gcaatcaaca acttccgtta agttatc 37

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CPR- BstEII-R

<400> 18

gggttacctt accatacatc acggagatat c 31

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALDH1-SpeI-F

<400> 19

ggactagtat gagctcagga gctaatggaa g 31

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALDH1- BstEII-R

<400> 20

gggttacctt aaagccacgg ggaatcatat at 32

<210> 21

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADS-cassette-FP

<400> 21

tatgaccatg attacgaatt ccatggagtc aaagattcaa ata 43

<210> 22

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADS-cassette-RP

<400> 22

ccgggtaccg agctcgaatt ccccgatcta gtaacataga tga 43

<210> 23

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP71AV1-cassette-FP

<400> 23

gagctcggta cccggggatc ccatggagtc aaagattcaa ata 43

<210> 24

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP71AV1-cassette-RP

<400> 24

caggtcgact ctagaggatc ccccgatcta gtaacataga tga 43

<210> 25

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CPR-cassette-FP

<400> 25

tagatcgggg gatcctctag acatggagtc aaagattcaa ata 43

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CPR-cassette-RP

<400> 26

tgcctgcagg tcgactctag acccgatcta gtaacataga tga 43

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALDH1-cassette-FP

<400> 27

tagatcgggg tcgacctgca gcatggagtc aaagattcaa ata 43

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALDH1-cassette-RP

<400> 28

gccaagcttg catgcctgca gcccgatcta gtaacataga tga 43

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 35SF

<400> 29

atgccatcat tgcgataaag g 21

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADSR

<400> 30

ctagcccggg aatactgtgg ct 22

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYPR

<400> 31

aggttaaccg gtctccctga acc 23

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CPRR

<400> 32

cctttctctt caccctcgg 19

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALDH1R

<400> 33

ttcatcgatc aagtctgcg 19