用于檢測(cè)豬Delta冠狀病毒抗體的多肽、制備方法及其應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測(cè)豬Delta冠狀病毒抗體的多肽、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

冠狀病毒目前有四個(gè)亞群，分別為Alpha、Beta、Gamma和Delta冠狀病毒。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)均屬于Alpha亞群，Delta亞群最初只在禽類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，豬源Delta冠狀病毒(Deltacoronavirus，縮寫(xiě)為PDCoV)是一種新型的豬源腸道冠狀病毒，最早在2012年香港的一次監(jiān)測(cè)調(diào)查中識(shí)別發(fā)現(xiàn)，2014年2月，在美國(guó)俄亥俄州和印第安納州第一次檢測(cè)出PDCoV。豬源PDCoV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組全長(zhǎng)約25kb，編碼四種主要的結(jié)構(gòu)蛋白：纖突(S)蛋白，囊膜(E)蛋白，膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白。PDCoV能導(dǎo)致感染豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水等癥狀，哺乳仔豬發(fā)病率較高，威脅著豬群的健康，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，針對(duì)PDCoV或其抗體的檢測(cè)方法尚處于發(fā)展階段，操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度較低、特異性較低、準(zhǔn)確性較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是提供用于檢測(cè)豬Delta冠狀病毒抗體的多肽，免疫反應(yīng)性良好，用于檢測(cè)豬Delta冠狀病毒時(shí)，特異性、敏感性高、準(zhǔn)確性高。

本發(fā)明的另一目的是提供所述多肽的制備方法，采用該方法能夠大量可溶性表達(dá)該多肽，且免疫反應(yīng)性良好。

本發(fā)明的再一目的是提供檢測(cè)豬Delta冠狀病毒抗體的試劑盒，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、特異性高、敏感性高、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好。

本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)豬Delta冠狀病毒抗體的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明還提供所述多肽的制備方法，包括將含有所述多肽編碼基因的重組菌在35-40℃條件下采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的步驟，所述重組菌是將所述多肽編碼基因插入pcold 1質(zhì)粒后導(dǎo)入大腸桿菌獲得的。

在本發(fā)明中，以豬Delta冠狀病毒的RNA為模板，通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增獲得所述多肽的編碼基因。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，將所述多肽編碼基因插入pcold 1質(zhì)粒中BamH I和Sal I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述重組菌在35-40℃條件下培養(yǎng)后再進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

本發(fā)明還提供包括采用所述多肽包被的ELISA板條。

在本發(fā)明中，所述試劑盒還包括洗滌液、血清稀釋液、底物顯色液、羊抗豬酶標(biāo)二抗、終止液、PDCoV陽(yáng)性血清和PDCoV陰性血清。

在本發(fā)明中，血清稀釋液是2％脫脂乳粉水溶液，終止液是濃度為2M的H₂SO₄水溶液，洗滌液是添加有0.05％吐溫-20的0.01M、pH7.4磷酸鹽緩沖液。

本發(fā)明用于檢測(cè)豬Delta冠狀病毒抗體的多肽(多肽A)，僅是PDCoV核衣殼(N)蛋白的部分序列，通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)證明免疫反應(yīng)性良好。用于檢測(cè)豬Delta冠狀病毒時(shí)，特異性、敏感性、準(zhǔn)確性高。發(fā)明人采用了多種表達(dá)載體對(duì)多肽A進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)使用常規(guī)的載體常規(guī)方法并不能夠表達(dá)該蛋白，例如采用PET-28a載體在37℃條件下誘導(dǎo)未能成功表達(dá)多肽A；采用pcold 1載體在常規(guī)的誘導(dǎo)溫度(16℃)未能成功表達(dá)多肽A，只有在37℃條件下才實(shí)現(xiàn)了多肽A的可溶性表達(dá)，且表達(dá)的多肽A易于純化，免疫反應(yīng)性良好。本發(fā)明檢測(cè)豬Delta冠狀病毒抗體的試劑盒，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、特異性高、敏感性高、重復(fù)性好。由于本發(fā)明試劑盒采用重組多肽A作為包被抗原，其濃度易于確定與控制，有利于該試劑盒的大量生產(chǎn)與成本控制。

附圖說(shuō)明

圖1 PET-28a-N重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖。1-3：成功構(gòu)建的PET-28a-N重組質(zhì)粒

圖2 PET-28a-N/BL21菌液表達(dá)情況的SDS-PAGE電泳圖。1：導(dǎo)入PET-28a空載體的重組菌(未誘導(dǎo))；2：導(dǎo)入PET-28a空載體的重組菌(誘導(dǎo))；3：PET-28a-N/BL21菌液(未誘導(dǎo))；4-6：誘導(dǎo)6h的PET-28a-N/BL21菌液

圖3 pcold 1-N/BL21菌液在16℃誘導(dǎo)后的SDS-PAGE電泳圖。1：導(dǎo)入pcold 1空載體的重組菌(未誘導(dǎo))；2：導(dǎo)入pcold 1空載體的重組菌(誘導(dǎo))；3：pcold 1-N/BL21菌液未誘導(dǎo)；4-6：在16℃誘導(dǎo)12h的pcold 1-N/BL21菌液

圖4 pcold 1-N重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖。M：DL 10000Marker；1：未構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒；2：成功構(gòu)建的pcold 1-N重組質(zhì)粒；3：未構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒。

圖5多肽A的誘導(dǎo)表達(dá)。M:蛋白Marker；1:導(dǎo)入pcold 1空載體的重組菌(未誘導(dǎo))；2：導(dǎo)入pcold 1空載體的重組菌(誘導(dǎo))；3：pcold 1-N/BL21菌液未誘導(dǎo)；4-9：在37℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)1-6h的pcold 1-N/BL21菌液。

圖6 Western Blot鑒定。M:蛋白Marker；1:純化后的多肽A。

圖7多肽A可溶性表達(dá)鑒定。M:蛋白Marker；1:在37℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)1-6h的pcold 1-N/BL21全菌；2：在37℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)1-6h的pcold 1-N/BL21裂解液上清；3：在37℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)1-6h的pcold 1-N/BL21裂解液沉淀。

圖8純化后的多肽A的SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白Marker；1-2：純化后的多肽A。

通過(guò)下列實(shí)施例將更具體的說(shuō)明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例盡是為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

通過(guò)比對(duì)已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表的豬Delta冠狀病毒N蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)如SEQ ID NO:1所示多肽的同源性較大，將該多肽命名為多肽A。通過(guò)重組表達(dá)方法制備的多肽A具有良好的免疫反應(yīng)性。

1.多肽A編碼基因的獲得

根據(jù)多肽A的氨基酸序列，得到其對(duì)應(yīng)的DNA序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物PDCoV-NF和PDCoV-NR擴(kuò)增多肽A編碼基因。引物的具體序列如下：

PDCoV-NF：5’-TTTGGATCCAACTCCGCCATCAAACCCGTT-3’；

PDCoV-NR：5’-TGTGTCGACTGAACACCAGGCACATGTCT-3’。

引物中劃線的部分分別為BamH I與Sal I酶切位點(diǎn)。

提取豬Delta冠狀病毒的總RNA，以取得的總RNA為模板，使用One-stepRT-PCR SuperMix試劑盒(購(gòu)自TransGen Biotech)，采用PDCoV-NF和PDCoV-NR為引物，擴(kuò)增多肽A的編碼基因。RT-PCR的反應(yīng)參數(shù)是：45℃，30min；94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

將多肽A編碼基因擴(kuò)增片段與pMD19-T載體，在4℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布至氨芐青霉素抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆，于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)8h后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定。將初步鑒定為陽(yáng)性的菌液進(jìn)行測(cè)序。選取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒，命名為pMD19-T-N質(zhì)粒。

2.多肽A的制備

(1)試用PET-28a載體進(jìn)行原核表達(dá)：將pMD19-T-N質(zhì)粒和PET-28a載體分別采用BamH I酶和Sal I酶進(jìn)行雙酶切，然后將兩酶切片段相連，將多肽A編碼基因插入PET-28a載體內(nèi)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒PET-28a-N，經(jīng)雙酶切鑒定為陽(yáng)性質(zhì)粒(圖1)。將質(zhì)粒PET-28a-N轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組菌PET-28a-N/BL21。將重組菌PET-28a-N/BL21于37℃培養(yǎng)，待OD₆₀₀值達(dá)到0.6時(shí)，加入終濃度為1μmol/L的IPTG在37℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)表達(dá)后6h的菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果未表達(dá)出目的蛋白(圖2)。

(2)試用PET-32a載體進(jìn)行原核表達(dá)：將pMD19-T-N質(zhì)粒和PET-32a載體分別采用BamH I酶和Sal I酶進(jìn)行雙酶切，然后將兩酶切片段相連，將多肽A編碼基因插入PET-32a載體內(nèi)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒PET-32a-N，經(jīng)雙酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組菌PET-32a-N/BL21。將重組菌PET-32a-N/BL21于37℃培養(yǎng)，待OD₆₀₀值達(dá)到0.6時(shí)，加入終濃度為1μmol/L的IPTG在37℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)表達(dá)后6h的菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果未表達(dá)出目的蛋白。

(3)試用pcold 1載體，在16℃下誘導(dǎo)表達(dá)：將pMD19-T-N質(zhì)粒和pcold 1載體分別采用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶切，然后將兩個(gè)酶切片段相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5a感受態(tài)細(xì)胞，常規(guī)化選取陽(yáng)性克隆，提取菌體質(zhì)粒酶切鑒定(圖4)。取陽(yáng)性質(zhì)粒，命名為pcold 1-N重組質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒pcold 1-N轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性重組菌pcold 1-N/BL21。將pcold 1-N/BL21在37℃條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀值達(dá)到0.6時(shí)，加入終濃度為1μmol/L的IPTG，在16℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果未表達(dá)出目的蛋白(圖3)。

(4)試用pcold 1載體，在37℃溫度下誘導(dǎo)表達(dá)：將陽(yáng)性重組菌pcold 1-N/BL21在37℃條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀值達(dá)到0.6時(shí)，加入終濃度為1μmol/L的IPTG，在37℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每隔1h取1ml菌液，至誘導(dǎo)后6h。將收集到的菌液4℃、12000r/min離心1min收集沉淀。每管沉淀用100微升的PBS懸起后加入25μl SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴10min，用SDS-PAGE電泳分析。從SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖5)可見(jiàn)，有大量分子量約為28kD的蛋白被表達(dá)，與預(yù)測(cè)的多肽A加his-tag大小一致，說(shuō)明多肽A在大腸桿菌中成功表達(dá)。

取37℃誘導(dǎo)6h的pcold 1-N/BL21菌液1ml，12000rpm離心1min，用100μL PBS緩沖液重懸菌體。超聲破碎，離心分離上清液與包涵體。用100μl PBS緩沖液重懸包涵體沉淀，加入25μl SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴10min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)果(圖7)可見(jiàn)大量多肽A在上清液中表達(dá)，即多肽A實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)。

(5)制備多肽A：將3mL pcold 1-N/BL21菌液加入到300mL氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，在37℃條件下活化培養(yǎng)，當(dāng)OD₆₀₀＝0.6時(shí)，加入終濃度為1μmol/L的IPTG，在37℃條件下誘導(dǎo)6h，誘導(dǎo)后的菌液8000r/min離心10min后獲得菌體沉淀，重懸菌體，超聲波破碎后離心取上清，采用His標(biāo)簽的Ni柱純化重組多肽A。純化后的多肽A蛋白濃度為372.9μg/mL，共獲得1.85mg純化后的多肽A。經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn)，純度約為100％(圖8)，可見(jiàn)多肽A易于制備與純化。

3.重組多肽A的Western Blot實(shí)驗(yàn)

將純化后的多肽A進(jìn)行SDS-PAGE電泳，不染色，使用轉(zhuǎn)印裝置轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素濾膜(NC膜)上，將NC膜取出后放入封閉液中(含3％-5％脫脂奶粉的TBST緩沖液)，4℃封閉過(guò)夜。封閉后放入TBST緩沖液中洗3次，每次10min。將NC膜放入用TBST以1:5000稀釋的His-Tag mAb(組氨酸標(biāo)記的單克隆抗體，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)中，在搖床上室溫低速孵育2h，取出NC膜TBST緩沖液洗3次，每次10min。將NC膜放入用TBST以1:10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG中(購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)，室溫低速孵育1h，取出NC膜TBST緩沖液洗3次，每次10min。采用增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Vazyme公司)進(jìn)行顯色。結(jié)果如圖6，凝膠上在大約28KD大小的位置，出現(xiàn)一條特異性條帶，證明該蛋白是His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，且多肽A具有良好的免疫反應(yīng)性。

實(shí)施例2檢測(cè)豬Delta冠狀病毒抗體的試劑盒

試劑盒組成：洗滌液、血清稀釋液、終止液、底物顯色液、羊抗豬酶標(biāo)二抗、PDCoV陽(yáng)性血清和PDCoV陰性血清、ELISA板條。

(1)洗滌液

洗滌液配制方法：在0.01M、pH7.4磷酸鹽緩沖液中添加終濃度為0.05％(體積百分濃度)的吐溫-20。稱取KH₂PO₄0.2g，KCl 0.2g，Na₂HPO4·12H₂O 2.9g，NaCl 8g，溶于水，然后定容至1000mL，得到0.01M、pH7.4磷酸鹽緩沖液。在0.01M、pH7.4磷酸鹽緩沖液中加入0.5mL吐溫-20，得到洗滌液。

(2)血清稀釋液：2％脫脂乳粉水溶液，配制方法：在洗滌液中添加終濃度為20g/L的脫脂乳粉后獲得的。

(3)終止液：2M硫酸溶液，具體配制方法：11.1mL濃硫酸，用水稀釋后定容至100mL。

(4)底物顯色液：包括顯色液A和B。

顯色液A：21mg TMB(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，購(gòu)自BIOSHARP公司)溶于5ml無(wú)水乙醇，混勻分裝，1ml/支，作為顯色液A。

顯色液B：33mg UHP(過(guò)氧化脲素，購(gòu)自上海晶純生化科技股份有限公司)溶于200ml、pH為5.2的磷酸鹽緩沖液(取2.7g Na₂HPO₄·12H₂O、13.2g KH₂PO₄溶于去離子水，定容至500ml)，加終濃度為25μg/ml的慶大霉素，用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，無(wú)菌分裝，15ml/瓶，作為顯色液B。

在使用前，將顯色液A與顯色液B按照體積比為1:40進(jìn)行混合，得到底物顯色液。

(5)羊抗豬酶標(biāo)二抗：HRP標(biāo)記的羊抗豬lgG，購(gòu)自BETHYL公司。

(6)PDCoV陽(yáng)性血清：使用重組多肽A作為抗原，利用Western Blot方法對(duì)臨床血清進(jìn)行篩選，選取能夠與重組多肽A發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的血清。

(7)PDCoV陰性血清：使用重組多肽A作為抗原，利用Western Blot方法對(duì)臨床血清進(jìn)行篩選，選取不能與重組多肽A發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的血清。

(8)ELISA板條：采用多肽A包被的ELISA板條。

①抗原最適包被濃度和血清最適稀釋度的確定

采用方陣滴定法確定抗原最適包被濃度和血清最適稀釋度。

將純化后的多肽A(372.9μg/mL)作為抗原，用包被液(0.05M、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)依次做1:20、1:40、1:80、1:160、1:320稀釋，各稀釋度按100μl/孔滴加到ELISA板條中，4℃包被過(guò)夜。棄液，用洗滌液洗三次，200μl/孔，每次3-5min。用封閉液(洗滌液中添加終濃度為5％(質(zhì)量百分濃度)的脫脂乳粉)按200μl/孔的量封閉1h，棄去封閉液后按上述方法洗滌。將PDCoV陰陽(yáng)性血清分別用稀釋液依次做1:10、1:20、1:40、1:80、1:160稀釋，組成方陣，100μl/孔，37℃條件下作用1h，棄液后按上述方法洗滌，加入用稀釋液作1:10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬lgG(購(gòu)自BETHYL公司)，100μl/孔，37℃條件下作用1h，棄液，按上述方法洗滌，加入底物顯色液，100μl/孔，室溫避光顯色10min，加入終止液(50μl/孔)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取OD值(OD₄₅₀值)。比較陰陽(yáng)性血清的OD₄₅₀值，選取陽(yáng)性血清OD₄₅₀值為1.0左右，陰性O(shè)D₄₅₀值為0.2以下，且陽(yáng)性與陰性血清OD₄₅₀值之比(P/N)最大時(shí)的抗原包被濃度為抗原最佳包被濃度，對(duì)應(yīng)的陰陽(yáng)性血清稀釋度為血清最佳稀釋度。

方陣滴定結(jié)果(表1)表明，當(dāng)抗原以1:80稀釋(0.466μg/100μl)，血清以1:40稀釋時(shí)，陽(yáng)性血清OD₄₅₀值在1.0以上，陰性血清OD₄₅₀值在0.2以下，且P/N值較大。因此確定重組多肽A的包被最佳濃度為0.466μg/100μl，血清最佳稀釋度為1:40。

表1 ELISA方陣滴定結(jié)果

②包被條件的選擇

按抗原最佳包被濃度，分別考察下述不同包被條件下的包被效果：4℃包被12h、4℃包被12h后37℃包被1h、37℃包被1h或37℃包被2h。按血清最佳稀釋度加入陰陽(yáng)性血清，其他步驟同標(biāo)題①中方法，測(cè)定OD₄₅₀并分析P/N變化情況，分析各條件下的包被效果。包被條件最終選擇：4℃包被12h后37℃包被1h。

③封閉液的選擇

按抗原最佳包被濃度和最佳包被條件包被酶標(biāo)板，分別用5％脫脂乳粉溶液、1％BSA溶液、1％明膠溶液作為封閉液，封閉1h，封閉液的溶劑為洗滌液。血清按照最佳稀釋度稀釋，其他步驟同標(biāo)題①中方法，用陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，分析各封閉液的封閉效果。最終選擇5％脫脂乳粉溶液為封閉液。

④封閉條件的確定

按照上述優(yōu)化后的條件，分別在37℃條件下封閉30min、1h、2h或3h，其他步驟同標(biāo)題①中方法，用陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，分析各條件下的封閉效果。最終確定封閉時(shí)間為1h。

⑤ELISA板條的制備

在ELISA板條的各孔中，加入100μl多肽A(0.466μg/100μl)，在4℃包被12h然后在37℃包被1h；棄液，用洗滌液洗三次，每次洗滌過(guò)程中洗滌液加入量為200μl/孔，洗滌時(shí)間為3-5min。用封閉液(洗滌液中添加終濃度為5％(質(zhì)量百份濃度)的脫脂乳粉)按200μl/孔的量在37℃條件下封閉1h，棄去封閉液，按上述方法洗滌，最后用吸水紙拍干，4℃保存，得到ELISA板條。

實(shí)施例3試劑盒的使用方法

1.最適抗原抗體反應(yīng)時(shí)間的確定

在ELISA板條中，以最佳稀釋度加入100μl/孔PDCoV陰陽(yáng)性血清后，37℃分別孵育30、45、60或75min，棄液后按上述方法洗滌，加入1:10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬lgG，100μl/孔，37℃條件下作用1h，棄液，洗滌，加入底物顯色液，100μl/孔，室溫避光顯色10min，加入終止液(50μl/孔)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取OD值。評(píng)價(jià)不同時(shí)間的反應(yīng)效果。最終確定抗原抗體的最適反應(yīng)時(shí)間為30min，此時(shí)陽(yáng)性血清平均值在1.0以上，陰性血清平均值在0.2以下，且P/N值最大。

2.最適二抗工作濃度的確定

在ELISA板條中，以最佳稀釋度加入PDCoV陰陽(yáng)性血清后，37℃孵育30min，棄液后按上述方法洗滌，加入1:5000、1:7500、1:10000、1:15000或1:20000稀釋的酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記的羊抗豬lgG)，100μl/孔，37℃條件下作用1h，棄液，洗滌，加入底物顯色液，100μl/孔，室溫避光顯色10min，加入終止液(50μl/孔)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取OD值。評(píng)價(jià)不同時(shí)間的反應(yīng)效果。最終確定二抗最適工作濃度為1:10000，此時(shí)陽(yáng)性血清平均值在1.0以上，陰性血清平均值在0.2以下，且P/N值最大。

3.最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間的確定

抗原抗體的最適反應(yīng)時(shí)間為30min，二抗最適工作濃度為1:10000，考察HRP標(biāo)記的羊抗豬lgG在37℃條件下反應(yīng)時(shí)間分別為15、30、45、60min對(duì)OD₄₅₀值的影響，其他步驟同本實(shí)施例標(biāo)題1中方法。最終確定二抗最佳反應(yīng)時(shí)間為30min，此時(shí)陽(yáng)性血清平均值在1.0以上，陰性血清平均值在0.2以下，且P/N值最大。

4.最適顯色時(shí)間的確定

抗原抗體的最適反應(yīng)時(shí)間為30min，二抗最適工作濃度為1:10000，二抗反應(yīng)時(shí)間為30min，考察顯色時(shí)間為3、4、5、6、8、10、12或15min對(duì)反應(yīng)效果的影響，其他同本實(shí)施例標(biāo)題1中方法。結(jié)果如表2，最佳顯色時(shí)間為10min，此時(shí)，陽(yáng)性血清平均值在1.0以上，陰性血清平均值在0.2以下，且P/N值最大。

表2 最適顯色時(shí)間的確定

5.本發(fā)明試劑盒的ELISA操作程序的確定

按以上各項(xiàng)所確定的最佳操作條件，確定ELISA操作程序?yàn)椋喝〕鲆寻徊⒎忾]好的ELISA板條，用血清稀釋液將待檢血清做1:40稀釋，加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μL，每份待檢血清與PDCoV陰性、陽(yáng)性血清各加2孔，37℃反應(yīng)30分鐘；棄去孔內(nèi)液體，每孔用200μL洗滌液洗滌3次，每次5分鐘，最后一次洗滌完后，在吸水紙上拍打，棄盡孔內(nèi)液體；每孔加入1:10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬lgG100μL，37℃反應(yīng)30分鐘；棄去孔內(nèi)液體，每孔用200μL洗滌液洗滌3次，每次5分鐘，最后一次洗滌完后，在吸水紙上拍打，棄盡孔內(nèi)液體；每孔加入100μL底物顯色液后，室溫避光顯色10分鐘后，加入終止液50μL/孔終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)讀取各孔OD值，計(jì)算待檢血清的S/P值，待檢血清的S/P值＝(待檢血清OD₄₅₀值-陰性血清OD₄₅₀值)/(陽(yáng)性血清OD₄₅₀值-陰性血清OD₄₅₀值)。

6.陰陽(yáng)性臨界值的確定

在包被好的ELISA板條中，按本實(shí)施例標(biāo)題5中間接ELISA方法篩選臨床血清，選取其中OD₄₅₀值<0.2的樣品血清，計(jì)算S/P值，S/P值＝(樣品血清OD₄₅₀值-陰性血清OD₄₅₀值)/(陽(yáng)性血清OD₄₅₀值-陰性血清OD₄₅₀值)，計(jì)算各血清S/P值的平均值X及標(biāo)準(zhǔn)方差SD，當(dāng)樣品S/P值<X+2SD時(shí)，判為陰性；樣品S/P值>X+3SD時(shí)判為陽(yáng)性；X+2SD≤樣品S/P值≤X+3SD時(shí)，判為疑似。

經(jīng)計(jì)算，84份樣品血清的S/P值的平均數(shù)X＝0.126，S/P值的標(biāo)準(zhǔn)方差SD＝0.058。因此，X+3SD＝0.3，X+2SD＝0.242。

當(dāng)待檢血清S/P值<0.242時(shí)，判為陰性；待檢血清S/P值>0.3時(shí)判為陽(yáng)性；0.242≤待檢血清S/P值≤0.3時(shí)，判為疑似。

實(shí)施例4試劑盒的特異性、敏感性和重復(fù)性

1.特異性實(shí)驗(yàn)

采用實(shí)施例2中試劑盒及實(shí)施例3中使用方法，檢測(cè)已知的CSFV(豬瘟病毒)、PRRSV(豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒)、PRV(豬偽狂犬病病毒)、FMDV(口蹄疫病毒)、PCV2(豬圓環(huán)病毒2型)、PEDV(豬流行性腹瀉病毒)、TGEV(豬傳染性胃腸炎病毒)陽(yáng)性豬血清，每份血清設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)立PDCoV陰陽(yáng)性血清對(duì)照。測(cè)定各孔OD₄₅₀值，判定其陰陽(yáng)性，分析該ELISA方法的特異性。

結(jié)果表明，采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)PDCoV抗體與其它常見(jiàn)病毒的陽(yáng)性血清均沒(méi)有交叉反應(yīng)，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒的特異性較好。

2.敏感性實(shí)驗(yàn)

采用實(shí)施例2中試劑盒及實(shí)施例3中使用方法，將3份PDCoV陽(yáng)性血清從1:40開(kāi)始倍比稀釋，在酶標(biāo)儀下測(cè)定各孔OD₄₅₀值，分析本發(fā)明試劑盒的敏感性。

結(jié)果表明，3份陽(yáng)性血清分別在血清稀釋度為1:640、1:320、1:320時(shí)變?yōu)殛幮?，表明本次試?yàn)建立的ELISA方法敏感性較好。

3.重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

(1)批內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)：

取同批誘導(dǎo)純化制備的多肽A制備檢測(cè)PDCoV抗體的試劑盒，在不同時(shí)間分別檢測(cè)8份隨機(jī)選擇的PDCoV抗體水平不同的血清及標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清，測(cè)定各孔OD₄₅₀值，計(jì)算各份血清S/P值，以及每份血清S/P值的平均值X，標(biāo)準(zhǔn)差SD，變異系數(shù)CV，分析批內(nèi)重復(fù)的效果。

結(jié)果如表3，可見(jiàn)8份血清在不同時(shí)間檢測(cè)的變異系數(shù)在0.33％～9.47％之間，表明同批多肽A包被的ELISA板在不同時(shí)間檢測(cè)的重復(fù)性良好。

表3 批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(2)批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)：

使用不同批次誘導(dǎo)純化制備的多肽A制備試劑盒，同時(shí)檢測(cè)8份隨機(jī)選擇的PDCoV抗體水平不同的血清及標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清。計(jì)算各份血清S/P值，以及每份血清S/P值的平均值X，標(biāo)準(zhǔn)差SD，變異系數(shù)CV，分析批間重復(fù)的效果。

結(jié)果如表4，可見(jiàn)8份血清檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)在0.76％～8.83％之間，表明不同批次多肽A作為抗原檢測(cè)的重復(fù)性良好。

表4 批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 用于檢測(cè)豬Delta冠狀病毒抗體的多肽、制備方法及其應(yīng)用

<130> 20161111

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 204

<212> PRT

<213> 豬Delta冠狀病毒

<400> 1

Asn Ser Ala Ile Lys Pro Val Glu Asn His Gly Tyr Trp Leu Arg Tyr

1 5 10 15

Thr Arg Gln Lys Pro Gly Gly Thr Pro Ile Pro Pro Ser Tyr Ala Phe

20 25 30

Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Arg Gly Asn Leu Lys Tyr Gly Glu Leu

35 40 45

Pro Pro Asn Asp Thr Pro Ala Thr Thr Arg Val Thr Trp Val Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ala Asp Thr Ser Ile Lys Pro His Val Ala Lys Arg Asn Pro

65 70 75 80

Asn Asn Pro Lys His Gln Leu Leu Pro Leu Arg Phe Pro Thr Gly Asp

85 90 95

Gly Pro Ala Gln Gly Phe Arg Val Asp Pro Phe Asn Ala Arg Gly Arg

100 105 110

Pro Gln Glu Arg Gly Ser Gly Pro Arg Ser Gln Ser Val Asn Ser Arg

115 120 125

Gly Thr Gly Asn Gln Pro Arg Lys Arg Asp Gln Ser Ala Pro Ala Ala

130 135 140

Val Arg Arg Lys Thr Gln His Gln Ala Pro Lys Arg Thr Leu Pro Lys

145 150 155 160

Gly Lys Thr Ile Ser Gln Val Phe Gly Asn Arg Ser Arg Thr Gly Ala

165 170 175

Asn Val Gly Ser Ala Asp Thr Glu Lys Thr Gly Met Ala Asp Pro Arg

180 185 190

Ile Met Ala Leu Ala Arg His Val Pro Gly Val Gln

195 200