一株降解除草劑乙草胺和雜草焚的細(xì)菌的制作方法

技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域中一株降解除草劑乙草胺和雜草焚的細(xì)菌。
背景技術(shù)：
：乙草胺，英文通用名稱acetochlor，化學(xué)名稱是2-乙基-6甲基-N-乙氧基甲基-α-氯代乙酰替苯胺。乙草胺是內(nèi)吸性酰胺類除草劑，是選擇性的芽前除草劑。能被雜草的幼芽和幼根吸收，抑制雜草蛋白質(zhì)合成，而使雜草死亡。主要用于大豆、花生、玉米、棉花等作物防除一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草，對(duì)大豆菟絲子有良好防效，對(duì)多年生雜草無(wú)效。雜草焚，又名三氟羧草醚，英文名稱acifluorfen，化學(xué)名稱5-(2-氯-α，α，α-三氟對(duì)甲苯氧基)2-硝基苯甲酸。雜草焚是二苯醚類除草劑，屬接觸性除草劑，是原卟啉氧化酶抑制劑。通常采用25％水劑進(jìn)行大豆苗前表土處理及苗后經(jīng)葉噴霧，可有效防除大豆田闊葉雜草如蒼耳、苘麻、龍葵、莧、藜、蓼、牽牛、豚草、曼陀羅、馬齒莧、鐵莧菜、鬼針草、鼬瓣花、鴨跖草等，苗后早期處理也可防除包括狗尾草在內(nèi)的一年生禾本科雜草。噴藥后，大豆會(huì)不同程度受害，表現(xiàn)為葉片黃化、皺縮、褐變等，但6～7d后恢復(fù)正常。乙草胺和雜草焚半衰期較短，一直被認(rèn)為是一種低毒的環(huán)境友好型農(nóng)藥，但近年來(lái)頻繁、過(guò)量或使用不當(dāng)，對(duì)農(nóng)田土壤和地下水等造成了不同程度的污染，對(duì)后茬作物的危害也越來(lái)越嚴(yán)重。研究表明，在環(huán)境中大量施用乙草胺和雜草焚造成一定的殘留毒性，其在地下水、地表水中可以殘留數(shù)年，進(jìn)入到環(huán)境中通過(guò)食物鏈在生物體內(nèi)不斷富集，對(duì)魚類有較強(qiáng)的毒性，對(duì)環(huán)境污染很大。尤其乙草胺可以引起生物體的內(nèi)分泌紊亂，造成不育、不正常的性別差異甚至致癌，已被美國(guó)環(huán)保局定為致癌物。自然界除草劑殘留的降解主要依靠土壤中微生物來(lái)完成，但自然降解十分緩慢。因此，有針對(duì)性地篩選高效微生物菌株，研制微生物修復(fù)劑，通過(guò)人工接種加速土壤除草劑殘留的降解消除農(nóng)田除草劑殘留藥害是一項(xiàng)十分必要的工作和切實(shí)可行的途徑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何降解除草劑乙草胺和雜草焚。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一株可以降解除草劑乙草胺和雜草焚的細(xì)菌。本發(fā)明提供的細(xì)菌是根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47，該菌株已于2014年10月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCCNo.9867。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867。上述菌劑可為下述1)或2)所述菌劑：1)用于降解除草劑乙草胺和/或雜草焚的菌劑；2)用于修復(fù)土壤除草劑乙草胺和/或雜草焚污染的菌劑。所述菌劑還可以包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體可為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為有機(jī)溶劑、植物油、礦物油或水；所述有機(jī)溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培養(yǎng)的活細(xì)胞、活細(xì)胞的發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)物的濾液或細(xì)胞與濾液的混合物的形式存在。所述組合物的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。根據(jù)需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩(wěn)定劑(如抗氧化劑)、pH調(diào)節(jié)劑等。所述的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867或以根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867為活性成分的菌劑在降解除草劑乙草胺和/或雜草焚中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867或以根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867為活性成分的菌劑在修復(fù)土壤除草劑乙草胺和/或雜草焚污染中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種培養(yǎng)根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867的方法。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867的方法，包括將根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867在用于培養(yǎng)根瘤菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種以根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867為活性成分的菌劑的制備方法。本發(fā)明所提供上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：將所述的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867作為活性成分，得到所述菌劑。本發(fā)明是從長(zhǎng)期受到除草劑污染的農(nóng)田采集土樣，并從中分離篩選得到的除草劑乙草胺和/或雜草焚降解菌根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867。實(shí)驗(yàn)證明，該菌株在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中7天對(duì)50mg/L乙草胺降解率達(dá)到73.65％；對(duì)100mg/L雜草焚的降解率達(dá)到9.04％。這表明該菌株能降解除草劑乙草胺和/或雜草焚，在修復(fù)土壤除草劑乙草胺和雜草焚污染方面具有廣闊的應(yīng)用前景。保藏說(shuō)明菌種名稱：根瘤菌拉丁名：(Rhizobiumsp.)菌株編號(hào)：198-R-47保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱：CGMCC地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)保藏日期：2014年10月28日保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCCNo.9867附圖說(shuō)明圖1為乙草胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為雜草焚標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基如下：無(wú)氮液體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為蔗糖10g/L，NaCl0.12g/L，K2HPO4·3H2O0.5g/L，CaCO31g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.2。無(wú)氮固體培養(yǎng)基：向無(wú)氮液體培養(yǎng)基中加瓊脂至其含量為15-20g/L得到的培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.2。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L、瓊脂15-20g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.2。無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為NH4Cl1.0g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCl0.5g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.0。無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基：向無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加瓊脂至其含量為2％得到的培養(yǎng)基。下述實(shí)施例中的根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616CGMCCNo.7775(簡(jiǎn)稱根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616)已在中國(guó)發(fā)明專利文獻(xiàn)CN103343100B中公開。實(shí)施例1、根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867的分離與鑒定一、乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47的分離1、在100ml無(wú)菌水中加入10g土壤樣品(采自中國(guó)黑龍江黑河受除草劑污染的農(nóng)田)，振蕩培養(yǎng)30min制成混濁液。吸取1ml上述混濁液加入盛有9ml無(wú)菌水中的試管中充分混勻(此時(shí)稀釋度記為10-1)，然后從此試管中吸取1ml加入到另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中混合均勻，以此類推制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀釋度的菌懸液。將各稀釋度取0.1ml均勻涂布在無(wú)氮固體培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫靜置培養(yǎng)2—3天。待菌落形成后，在無(wú)氮固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行菌種純化。2、對(duì)除草劑乙草胺、雜草焚、普施特和氯嘧磺隆降解能力的初步篩選采用平板透明圈法。將乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka公司產(chǎn)品)加入無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基使其含量為1000mg/L，得到乙草胺平板；將雜草焚標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka公司產(chǎn)品)加入無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基使其含量為1000mg/L，得到雜草焚平板；將普施特標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka公司產(chǎn)品)加入無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基使其含量為1000mg/L，得到普施特平板；將氯嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka公司產(chǎn)品)加入無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基使其含量為1000mg/L，得到氯嘧磺隆平板。將乙草胺平板、雜草焚平板、普施特平板和氯嘧磺隆平板進(jìn)行分區(qū)，吸取步驟1純化得到的每株菌的菌懸液10μL和本實(shí)驗(yàn)室的根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616的菌懸液10μL(各種菌株菌懸液的菌體含量相同)分別點(diǎn)種到四種平板上(每株菌在一個(gè)平板上重復(fù)3次)，28℃培養(yǎng)、觀察。篩選到一株在乙草胺平板和雜草焚平板上均能形成較大透明圈的菌株，將該菌株其命名為乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47。乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47在普施特平板和氯嘧磺隆平板均不能形成透明圈。根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616只在氯嘧磺隆平板上形成較大透明圈，在普施特平板、乙草胺平板和雜草焚平板上均不能形成透明圈。說(shuō)明乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47能降解乙草胺和雜草焚，不能降解氯嘧磺隆和普施特；根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616能降解氯嘧磺隆，不能降解普施特、乙草胺和雜草焚。表1.乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47和根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616對(duì)四種除草劑降解能力初篩結(jié)果菌株編號(hào)普施特乙草胺氯嘧磺隆雜草焚乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47－+－+根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616－-+－注：“+”表示形成較大透明圈，“－”表示無(wú)透明圈形成。二、乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47的鑒定從以下幾個(gè)方面鑒定步驟一分離并純化得到的乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47：1、形態(tài)學(xué)鑒定將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且菌落大小穩(wěn)定，上述步驟一分離并純化得到的乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47進(jìn)行單菌落狀態(tài)觀察，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、濕潤(rùn)度、菌落表面狀態(tài)(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(tài)(是否整齊、不規(guī)則、放射狀等)。結(jié)果表明，上述步驟一分離并純化得到的乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47菌落圓形凸起，乳白色，濕潤(rùn)不透亮，邊緣規(guī)則，直徑0.8-1.5mm。2、生理生化特征分析參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè).北京:科學(xué)出版社，2011.)和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)測(cè)定上述乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47的生理生化特征。所述乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47的生理生化特征測(cè)定結(jié)果如表2所示：表2.乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47的生理生化特征注：“+”表示陽(yáng)性，“－”表示陰性。3、16SrDNA序列同源性分析常規(guī)方法培養(yǎng)上述步驟一分離純化得到的乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47，提取菌株的總DNA作為基因擴(kuò)增模板，以細(xì)菌16SrDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系采用上海生物工程有限公司PCR擴(kuò)增試劑盒。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)。DNA測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar軟件完成，基因比對(duì)通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和EzTaxon在線完成。PCR基因擴(kuò)增得到乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47的16SrDNA基因片段約1.3kb，測(cè)定序列后與NCBI和EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中已公開的16SrDNA序列進(jìn)行在線同源性比對(duì)，結(jié)果顯示乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47與根瘤菌屬RhizobiumpusenseNRCPB10T同源性最高，達(dá)到99.31％。乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47的16SrDNA序列詳見序列1。鑒于上述形態(tài)、生理生化特征分析和16SrDNA序列同源性分析結(jié)果，將步驟一分離純化得到的乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47鑒定為根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)。該乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47已于2014年10月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCCNo.9867。乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47的全稱為根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867，簡(jiǎn)稱為根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47。實(shí)施例2、根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解乙草胺能力定量測(cè)定一、乙草胺測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線制作準(zhǔn)確稱取乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka公司產(chǎn)品)10.0mg于10mL容量瓶中，用少量甲醇溶解，將容量瓶放在超聲波浴槽中振蕩10min，然后用甲醇定容至10mL，搖勻，配成1000mg/L乙草胺母液。然后用甲醇稀釋獲得濃度分別為10、20、40、60、80、100mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定不同濃度乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，3次重復(fù)。以乙草胺的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制乙草胺標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。檢測(cè)條件如下：檢測(cè)系統(tǒng)：Agilent1100Series。色譜柱：C18DiamosilTM反相柱，250mm×4.6mm，粒徑5μm。色譜條件：流動(dòng)相：甲醇：水＝80：20(v/v)，水用冰醋酸調(diào)至pH＝3；檢測(cè)波長(zhǎng)，215nm；流速，1.0mL/min；進(jìn)樣體積，20μL；柱溫30℃。所得乙草胺測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝55.363x+144.5(R2＝0.9999)。其中，y為峰面積，x為乙草胺濃度。二、根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解乙草胺能力定量測(cè)定根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47處理：將根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867接種在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，挑取1環(huán)接種在5mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，180r/min培養(yǎng)12h，離心去掉培養(yǎng)基，用無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到OD600值為1.0。吸取0.2mL菌懸液(1×109cfu/ml)接種到5mL含乙草胺50mg/L的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(向無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入乙草胺(Fluka公司產(chǎn)品)使乙草胺的濃度為50mg/L得到的培養(yǎng)基)的試管中，28℃，180r/min培養(yǎng)7天，得到降解液，按照如下方法測(cè)定乙草胺殘留量：取3mL降解液至50mL離心管中，8000r/min離心5min收集上清液，加入3mL二氯甲烷，劇烈振蕩5min，靜置10min，待水相和有機(jī)相分層，加入少量無(wú)水硫酸鈉對(duì)有機(jī)相進(jìn)行脫水，準(zhǔn)確吸取800μL有機(jī)相于1.5mL的離心管中，用氮吹儀吹干，加入400μL甲醇，在超聲波清洗器中超聲10min，用0.22μm的有機(jī)相針刺式濾器過(guò)濾至液相色譜樣品瓶，按照上述HPLC法測(cè)定乙草胺。根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616處理：除將上述根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47處理中的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867替換為根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616CGMCCNo.7775，其余均相同。空白對(duì)照處理：同時(shí)，以未接種根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867的上述含乙草胺50mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，按照上述方法測(cè)定乙草胺的濃度。乙草胺降解率：X＝(1-A/B)×100％，式中X為降解率(％)，A為根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47處理液中殘留的乙草胺濃度或根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616處理液中殘留的乙草胺濃度，B為未接菌空白對(duì)照處理液中殘留的乙草胺濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)每個(gè)處理接種10個(gè)試管。表3.根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解乙草胺功效結(jié)果顯示，乙草胺初始濃度為50mg/L，7天后所述根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867對(duì)乙草胺的降解率達(dá)到73.65％(如表3所示)；根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616對(duì)乙草胺的降解率達(dá)到0％。這一結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867可降解乙草胺。實(shí)施例3、根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解雜草焚能力定量測(cè)定一、雜草焚測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取雜草焚標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka公司產(chǎn)品)10.0mg于10mL容量瓶中，用少量甲醇溶解，將容量瓶放在超聲波浴槽中振蕩10min，然后用甲醇定容至10mL，搖勻，配成1000mg/L雜草焚母液。然后用甲醇稀釋獲得濃度分別為10、20、40、60、80、100mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定不同濃度雜草焚標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，3次重復(fù)。以雜草焚濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制雜草焚標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。檢測(cè)條件如下：檢測(cè)系統(tǒng)：Agilent1100Series。色譜柱：C18DiamosilTM反相柱，250mm×4.6mm，粒徑5μm。色譜條件：流動(dòng)相：乙腈：水(冰乙酸調(diào)pH3.0)＝40:60(v/v)；檢測(cè)波長(zhǎng)，258nm；流速，1.0mL/min；進(jìn)樣體積，10μL；柱溫30℃。所得雜草焚測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝7.3196x+2.1212(R2＝0.9875)。其中，y為峰面積，x為雜草焚濃度。二、根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解雜草焚能力定量測(cè)定根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47處理：在試管中準(zhǔn)確加入5mL含雜草焚100mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(向無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入雜草焚使雜草焚的濃度為100mg/L得到的培養(yǎng)基)，再加入0.2ml的OD600值為1.0的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867菌液(1×109cfu/ml)，28℃、200r/min培養(yǎng)7天，得到降解液。取4mL降解液至50mL離心管中，加入4mL乙腈，振蕩2min，靜置10min，加入少許無(wú)水硫酸鈉。準(zhǔn)確吸取800μL有機(jī)相轉(zhuǎn)移至1.5mLEP離心管中，在氮吹儀上吹干，加入400μL甲醇(色譜級(jí))，在超聲波作用下使雜草焚完全溶解，用液譜過(guò)濾器過(guò)濾收集至樣品瓶中，按照上述HPLC法測(cè)定雜草焚。根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616處理：除將上述根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47處理中的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867替換為根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616CGMCCNo.7775，其余均相同?？瞻讓?duì)照處理：同時(shí)，以未接種根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867的上述含雜草焚100mg/L的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，按照上述方法測(cè)定雜草焚的濃度。雜草焚降解率：X＝(1-A/B)×100％，式中X為降解率(％)，A為根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47處理液中殘留的雜草焚濃度或根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616處理液中殘留的雜草焚濃度，B為未接菌空白對(duì)照處理液中殘留的雜草焚濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)每個(gè)處理接種10個(gè)試管。測(cè)定結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示，雜草焚初始濃度為100mg/L，7天后所述根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867對(duì)雜草焚的降解率9.04％；根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616對(duì)雜草焚的降解率為0.02％(如表4所示)。這一結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867可降解雜草焚。表4.根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解雜草焚功效<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所<120>一株降解除草劑乙草胺和雜草焚的細(xì)菌<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1300<212>DNA<213>根瘤菌(Rhizobiumsp.)<400>1cagacgggtgagtaacgcgtgggaatctacccatctctgcggaatagctctgggaaactg60gaattaataccgcatacgccctacgggggaaagatttatcggggatggatgagcccgcgt120tggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccatagctggtctgag180aggatgatcagccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtg240gggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgagtgatgaaggcc300ttagggttgtaaagctctttcaccgatgaagataatgacggtagtcggagaagaagcccc360ggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgttcggaattac420tgggcgtaaagcgcacgtaggcggatatttaagtcaggggtgaaatcccgcagctcaact480gcggaactgcctttgatactgggtatcttgagtatggaagaggtaagtggaattccgagt540gtagaggtgaaattcgtagatattcggaggaacaccagtggcgaaggcggcttactggtc600cattactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagt660ccacgccgtaaacgatgaatgttagccgtcgggcagtatactgttcggtggcgcagctaa720cgcattaaacattccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacg780ggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttacc840agctcttgacattcggggtatgggcattggagacgatgtccttcagttaggctggcccca900gaacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgca960acgagcgcaaccctcgcccttagttgccagcatttagttgggcactctaaggggactgcc1020ggtgataagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgg1080gctacacacgtgctacaatggtggtgacagtgggcagcgagacagcgatgtcgagctaat1140ctccaaaagccatctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaagttggaatc1200gctagtaatcgcagatcagcatgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgc1260ccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggtagtgc1300當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3