一種單克隆抗體及其制備方法與流程

本發(fā)明屬于醫(yī)藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種單克隆抗體及其制備方法。

背景技術(shù)：

抗體的主要功能是與抗原(包括外來的和自身的)相結(jié)合，從而有效地清除侵入機(jī)體內(nèi)的微生物、寄生蟲等異物，尤其是單克隆抗體，由于其高度均一、針對某一特定抗原表位，因此，廣泛用于免疫學(xué)分析、放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療等領(lǐng)域。單克隆抗體的發(fā)展經(jīng)歷了四個階段，分別為：鼠源性單克隆抗體、嵌合性單克隆抗體、人源化單克隆抗體和全人源單克隆抗體。鼠源性單克隆抗體：鼠雜交瘤單克隆抗體主要是將來源于免疫接種過的小鼠的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，繼而篩選出既能無限增殖又能分泌抗體的鼠雜交融合細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)行篩選、抗體制備和抗體純化。

嵌合性單克隆抗體：指用人的恒定區(qū)取代小鼠的恒定區(qū)，保留鼠單抗的可變區(qū)序列，形成一個人-鼠雜合的抗體。其研制程序快，可大幅度降低異源抗體的免疫原性，卻幾乎保持親本鼠單抗全部的特異性和親和力。另外，它還具有人抗體的效應(yīng)功能，如補(bǔ)體固定、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)等。

人源化單克隆抗體：利用現(xiàn)有的無數(shù)已詳細(xì)分析過的小鼠抗體，取其與抗原直接接觸的那段抗體片段(互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)與人的抗體框架嫁接，經(jīng)親和力重塑，可維持其特異性和大部分的親和力，同時幾乎去除免疫原性和毒副作用。

全人源單克隆抗體：其抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗體制備的相關(guān)技術(shù)主要有：人雜交瘤技術(shù)、EBV轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞技術(shù)、噬菌體顯示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠抗體制備技術(shù)和單個B細(xì)胞抗體制備技術(shù)等。

由人源化和全人源抗體制備的人源化和全人源抗體藥物因其具有高親和力、高特異性、毒副作用小的特點(diǎn)，克服了動物源抗體及嵌合抗體的各種缺點(diǎn)，已經(jīng)成為了治療性抗體藥物發(fā)展的必然趨勢。

現(xiàn)有技術(shù)中一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，包括以下步驟：(1)傳染病病原體抗原的制備：以常規(guī)方法在真核或原核細(xì)胞中生產(chǎn)并純化重組傳染病病原體抗原蛋白；(2)抗體的標(biāo)記：將上步純化的重組傳染病病原體抗原蛋白以熒光或生物素標(biāo)記；(3)B細(xì)胞的獲取、富集與純化：從傳染病患者或疫苗免疫者外周血分離單核的B細(xì)胞，采用密度梯度離心純化；(4)標(biāo)記抗原與特異性B細(xì)胞的結(jié)合：將步驟(2)中標(biāo)記的重組傳染病病原體抗原蛋白與步驟(3)中的B細(xì)胞進(jìn)行特異性結(jié)合；(5)抗原特異性B細(xì)胞的獲?。焊鶕?jù)標(biāo)記，以流式細(xì)胞儀篩選、分離出上步中抗原特異性的單個B細(xì)胞，即單個標(biāo)記的B細(xì)胞；(6)擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因：采用特異性的混合引物，應(yīng)用單細(xì)胞巢式RT-PCR從所述單個標(biāo)記的B細(xì)胞中克隆輕鏈和重鏈的可變區(qū)基因；(7)構(gòu)建表達(dá)載體：將上步所克隆的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因插入包含人輕鏈和重鏈恒定區(qū)基因的載體，構(gòu)建人源抗體真核高效表達(dá)載體，成功連接后轉(zhuǎn)化活化的大腸桿菌株，培養(yǎng)含有正確克隆的細(xì)菌，離心收集細(xì)菌并采用質(zhì)粒DNA純化試劑盒純化表達(dá)載體DNA；(8)重組抗體表達(dá)與純化：以上步純化后的表達(dá)載體DNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，培養(yǎng)使其獲得表達(dá)后經(jīng)分離純化得重組抗體。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)抗體不具有高親和力、不具有高特異性、毒副作用大，現(xiàn)有技術(shù)制備方法中獲得的重組抗體濃度偏低，成本高，不適合工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種單克隆抗體及其制備方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)抗體不具有高親和力、不具有高特異性、毒副作用大，現(xiàn)有技術(shù)制備方法中獲得的重組抗體濃度偏低，成本高，不適合工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種單克隆抗體，該單克隆抗體包括抗PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11；

所述抗PGAM的核苷酸序列為SEQ ID NO1；

所述CoIα的核苷酸序列為SEQ ID NO2；

所述Trx的核苷酸序列為SEQ ID NO3；

所述PGAM13的核苷酸序列為SEQ ID NO4；

所述CoIα12的核苷酸序列為SEQ ID NO5；

所述Trx11的核苷酸序列為SEQ ID NO6。

本發(fā)明另一目的在于提供一種單克隆抗體的制備方法，該單克隆抗體的制備方法包括以下步驟：

通過脾內(nèi)包埋用PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11免疫小鼠；

取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合；

用間接ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清。

通過脾內(nèi)包埋用PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11免疫小鼠方法為：

(1)將高壓滅菌過的濾紙片剪成1mm×3mm大小紙條，浸入免疫原PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-KLH、CoIα12-KLH、Trx11-KLH液體中；

(2)用小鼠板固定小鼠，眼眶采血后打開腹腔；

(3)游離脾臟，將濾紙條植入脾臟內(nèi)；

(4)關(guān)腹，縫合，創(chuàng)可貼包扎切口；

(5)將小鼠松開，標(biāo)記免疫時間、免疫原名稱、操作者，單獨(dú)放入小鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)；

(6)一周后腹部皮下加強(qiáng)免疫一次。

進(jìn)一步，取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合前需進(jìn)行：

SP2/0細(xì)胞的準(zhǔn)備，包括以下步驟：

1)取1管凍存的SP2/0細(xì)胞，置于37℃水浴1min，用滴管移入10ml離心管內(nèi)加入5ml不全1640培養(yǎng)液，1500rpm離心5min，棄上清；

2)加入5ml完全1640培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

3)于融合前48小時～36小時，將骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)；

4)融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁輕輕吹下，收集于50ml離心管內(nèi)；

5)1500rpm離心5min，棄去上清；

6)加入30ml不完全培養(yǎng)液，1500rpm離心5min，棄去上清；

7)加入10ml不完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；

8)取細(xì)胞懸液行細(xì)胞計(jì)數(shù)；細(xì)胞計(jì)數(shù)時，取細(xì)胞懸液0.1ml加入0.9ml不全1640培養(yǎng)液中，混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；

計(jì)算細(xì)胞數(shù)目的公式為：每毫升細(xì)胞數(shù)＝4個大方格細(xì)胞數(shù)×10⁵/4；或每毫升細(xì)胞數(shù)＝5個中方格細(xì)胞數(shù)×10⁶/2。

進(jìn)一步，取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合前還需進(jìn)行：

制備免疫脾細(xì)胞懸液：包括以下步驟：

(a)取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清；

(b)通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，于解剖臺板上固定后掀開左側(cè)腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺中用無菌手術(shù)剪開腹膜，取出脾臟置于已盛有10ml不完全培養(yǎng)液的平皿中，輕輕洗滌，并細(xì)心剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織；

(c)將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養(yǎng)液的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟或用注射器內(nèi)芯擠壓脾臟，使脾細(xì)胞進(jìn)入平皿中的不完全培養(yǎng)液；用吸管吹打數(shù)次，制成單細(xì)胞懸液；用200目銅網(wǎng)過濾；

(d)收獲脾細(xì)胞懸液，1500rpm離心5min，用不完全培養(yǎng)液離心洗滌3次，然后將細(xì)胞重懸于10ml不完全培養(yǎng)液；

(e)取上述懸液，行細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用；通常每只小鼠可獲得1×10⁸～2.5×10⁸個脾細(xì)胞。

進(jìn)一步，取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合前還需進(jìn)行：

飼養(yǎng)細(xì)胞的制備，包括以下步驟：

(A)取BALB/c小鼠，拉頸處死小鼠浸泡于75％乙醇1min；

(B)將小鼠移入超凈工作臺內(nèi)，以仰臥位固定在解剖板上，用眼科剪剪開胸部皮膚，用兩手縱向拉開皮膚，暴露腹部，并用酒精棉球擦拭腹膜消毒；

(C)用注射器抽取5ml不完全培養(yǎng)液注入腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1～2min，隨后吸出細(xì)胞懸液，移入離心管中；

(D)加不全1640培養(yǎng)液5ml，1500rpm離心5min，棄上清；用5ml HAT培養(yǎng)液將沉淀細(xì)胞重懸，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加HAT培養(yǎng)液，使細(xì)胞濃度為2×10⁵個/ml，一般每只小鼠得2～5×10⁶個巨噬細(xì)胞；

(E)將步驟(D)得到的細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml，然后置37℃5％CO₂及飽和濕度條件下培養(yǎng)，次日供融合實(shí)驗(yàn)用。

進(jìn)一步，取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合方法為：

(一)、將配好的50％PEG4000置于37℃孵箱中預(yù)溫；

(二)、將1×10⁸脾細(xì)胞與2×10⁷～5×10⁷骨髓瘤細(xì)胞SP2/0在50ml尖底離心管中混勻，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)液至30ml；

(三)、1500rpm離心5min，棄上清液；

(四)、用食指輕彈離心管底部，使細(xì)胞沉淀團(tuán)塊稍松散；置40℃水浴中預(yù)熱；

(五)、一手均勻轉(zhuǎn)動離心管，另一手用1ml吸管邊滴邊輕輕攪動，同時在1min內(nèi)加50％PEG4000 0.7ml；

(六)、第2min：繼續(xù)攪拌；第3min：加入1mlRPMI 1640培養(yǎng)液；第4min：加入3mlRPMI 1640培養(yǎng)液；第5min：加總液體量至30ml；

(七)、800rpm離心5min，棄去上清；

(八)、加入20ml HAT培養(yǎng)液，重懸沉淀細(xì)胞；

(九)、接種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.2ml；然后將培養(yǎng)板置37℃，5％CO₂及飽和濕度下培養(yǎng)；

(十)、融合后7d～10d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液行半量換液；

(十一)、2W后用HT培養(yǎng)液換出HAT培養(yǎng)液；3W后換完全1640培養(yǎng)液；

(十二)、培養(yǎng)8d～12d，克隆可長至孔底面積的1/3～1/2，此時可取培養(yǎng)上清液，進(jìn)行抗體檢測。

進(jìn)一步，用間接ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清方法，包括以下步驟：

一)、PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-BSA、CoIα12-BSA、Trx11-BSA分別溶于pH9.6的碳酸鹽緩沖液，濃度20μg/ml，100μl/孔,4℃過夜；

二)、棄孔內(nèi)液體，PBST洗3次，拍干；

三)、每孔加200μl封閉液，4℃過夜；

四)、棄孔內(nèi)液體，PBST洗3次，拍干；

五)、每孔加100μl待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時設(shè)立陽性、陰性對照和空白對照；37℃孵育2小時；

六)、棄孔內(nèi)液體，PBST洗3次，拍干；

七)、每孔加HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG100μl，37℃孵育30min；棄孔內(nèi)液體，PBST洗8次，拍干；

八)、每孔加TMB 50μl，H₂O₂ 50μl，室溫避光孵育30min；

九)、每孔加2mol/L H₂SO₄，終止反應(yīng)；

十)判定結(jié)果：若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔呈黃色，試驗(yàn)孔的顏色與陽性孔的顏色基本一樣，可判定為陽性；酶標(biāo)儀測定各孔OD_450nm值，以P/N≥2.1，或P≥N+3SD為陽性。

進(jìn)一步，克隆方法包括以下步驟：

A、取正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種96孔培養(yǎng)板，每孔0.1ml，含2×10⁴個巨噬細(xì)胞；

B、用彎吸管吹打雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)板中孔內(nèi)的克隆，懸浮于完全1640培養(yǎng)液中；

C、取樣，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至100、50、10個/ml；

D、分別將三種密度的雜交瘤細(xì)胞懸液接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔加0.1ml，理論上每孔分別含10、5、1個細(xì)胞；

E、在37℃，5％CO₂及飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，10d后半量換液，培養(yǎng)10～14d后取培養(yǎng)上清液進(jìn)行抗體檢測；

F、對陽性單克隆再克隆化培養(yǎng)，直到100％的克隆分泌特異性抗體為止；

G、將陽性克隆進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存。

進(jìn)一步，細(xì)胞的凍存方法包括以下步驟：

a、將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞吹打下來后，移入離心管中；

b、1500rpm離心10min，棄上清；

c、加入細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度為10⁶～10⁷個/ml；

d、分裝細(xì)胞于細(xì)胞凍存管，1ml/管，標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存日期；

e、將細(xì)胞凍存管放入一帶收口繩的小布袋內(nèi)，布袋上表明凍存號、細(xì)胞名稱等，立即將布袋放入吸管筒內(nèi)，置-70℃冰箱；

f、2小時～4小時后從-70℃冰箱取出吸管筒，將盛有細(xì)胞布袋移入液氮罐；在布袋的線繩上作好標(biāo)記或代碼；最后在液氮凍存簿上作詳細(xì)記錄。

本發(fā)明用PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-KLH、CoIα12-KLH、Trx11-KLH通過脾內(nèi)包埋免疫BALB/c小鼠取得了較好的免疫應(yīng)答；應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，常規(guī)細(xì)胞融合，用ELISA法進(jìn)行抗體篩選，選擇陽性較強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞孔內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行了克??；

獲得三株針對PGAM的雜交瘤細(xì)胞株，兩株針對CoIα的雜交瘤細(xì)胞株，五株針對Trx的雜交瘤細(xì)胞株，三株針對PGAM13的雜交瘤細(xì)胞株，四株針對CoIα12的雜交瘤細(xì)胞株，三株針對Trx11的雜交瘤細(xì)胞株。

本發(fā)明分別獲得了3、2、5、3、4、3株抗PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11的單克隆抗體，抗體同型均為IgM。

本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)抗體不具有高親和力、不具有高特異性、毒副作用大，現(xiàn)有技術(shù)制備方法中獲得的重組抗體濃度偏低，成本高，不適合工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的問題。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的單克隆抗體的制備方法流程圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

本發(fā)明實(shí)施例提供的單克隆抗體，包括抗PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11；

所述抗PGAM的核苷酸序列為SEQ ID NO1為：

所述CoIα的核苷酸序列為SEQ ID NO2為：

所述Trx的核苷酸序列為SEQ ID NO3為：

所述PGAM13的核苷酸序列為SEQ ID NO4為：

CSAQGVTEAEQAG。

所述CoIα12的核苷酸序列為SEQ ID NO5為：

CLRMRYKRSAVV。

所述Trx11的核苷酸序列為SEQ ID NO6為：

CEF KVNKSETI。

如圖1所示：本發(fā)明實(shí)施例提供的單克隆抗體的制備方法包括以下步驟：

S101：通過脾內(nèi)包埋用PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11免疫小鼠；

S102：取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合；

S103：用間接ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清。

下面結(jié)合試驗(yàn)及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料與試劑

(1)PGAM13(CSAQGVTEAEQAG)、CoIα12(CLRMRYKRSAVV)、Trx11(CEF KVNKSETI)多肽由invitrogen公司合成，并分別偶聯(lián)載體蛋白KLH、BSA；

(2)BALB/c小鼠，雌性，體重18～22g，鼠齡6～8周，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，飼以標(biāo)準(zhǔn)食料；

(3)SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞株為本室保存；

(4)1640培養(yǎng)粉購自sigma公司；

(5)H(次黃嘌呤)、A(氨基喋呤)、T(胸腺嘧啶核苷)購自sigma公司；

(6)細(xì)胞培養(yǎng)板購自costar公司；

(7)新生牛血清購自Gibco公司；

(8)降植烷購自sigma公司；

(9)HRP標(biāo)記的鼠人IgG購自invitrogen公司；

(10)PEG4000購自Merck公司；

(11)抗體亞類分型試劑盒購自sigma公司；

(12)DMSO購自sigma公司；

(13)福氏不完全佐劑購自sigma公司；

(14)其余試劑均為市售分析純。

1.1.2主要儀器

1.1.3主要試劑

(1)不完全RPMI-1640培養(yǎng)基：

(2)完全RPMI-1640培養(yǎng)基：不完全RPMI-1640培養(yǎng)基80ml，小牛血清15～20ml。

(3)HT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640培養(yǎng)基99ml，HT貯存液1ml。

(4)HAT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640培養(yǎng)基98ml，HT貯存液1ml，A貯存液1ml。

(5)A貯存液(×100，4×10^-5mol/L)：稱取1.76mg氨基喋呤(Aminopterin,MW 440.4)，溶于90ml超純水中，滴加1mol/L HCl 0.5ml中和，再補(bǔ)加超純水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶(2ml/瓶)，-20℃保存。

(6)HT貯存液(×100,H：10^-2mol/L，T：1.6×10^-3mol/L)：稱取136.1mg次黃嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超純水至100ml，置45～50℃水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶(2ml/瓶)，-20℃凍存。

(7)L-谷氨酰氨(L-glutamine，L.G.)溶液(×100，0.2mol/L)稱取2.92g L-谷氨酰氨(MW 146.15)，用100ml超純水溶解，過濾除菌，分裝小瓶(4ml/瓶)，-20℃凍存。

(8)青、鏈霉素(雙抗)溶液(100×)：取青霉素G(鈉鹽)100萬單位和鏈霉素(硫酸鹽)1g，溶于100ml滅菌超純水中，分裝小瓶(4ml/瓶)，-20℃凍存。

(9)7.5％NaHCO₃溶液：稱取NaHCO₃ 7.5g，溶于100ml超純水中，過濾除菌，分裝小瓶(4ml/瓶)，蓋緊瓶塞，4℃保存。

(10)HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸，MW 238.3)溶液(1mol/L)：稱取23.83g HEPES溶于100ml超純水中，過濾除菌，分裝小瓶(4ml/瓶)，4℃保存。

(11)50％PEG：稱取PEG4000 2g放入青霉素小瓶，加膠塞并插一針頭，356.18kPa高壓蒸汽15min，即刻加入2ml完全培養(yǎng)液(其中含0.3ml二甲基亞砜)。

(12)碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na₂CO₃ 8ml，0.2mol/L NaHCO₃ 17ml混合，再加75ml蒸餾水，調(diào)pH至9.6。

(13)Tris-HCl緩沖液(pH8.0，0.02mol/L)：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，補(bǔ)加蒸餾水至1000ml。

(14)洗滌緩沖液(PH7.4的PBST)：

(15)封閉液：牛血清白蛋白(BSA)0.1g，加洗滌液至100ml。

(16)酶反應(yīng)終止液(2mol/L H₂SO₄)：取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸

(98％)21.7ml。

(17)底物緩沖液(pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液)：

0.2mol/L Na₂HPO₄ 25.7ml

0.1ml/L檸檬酸 24.3ml

蒸餾水 50ml

(18)底物使用液：TMB底物使用液：TMB(1mg/ml)1.0ml，底物緩沖液10ml。

(19)秋水仙素溶液： 秋水仙素 10mg

生理鹽水 100ml

過濾除菌，-20℃保存。

(20)固定液：3份甲醇加1份冰醋酸，臨用前配制。

(21)1：10Giemsa染色液：1份Giemsa原液加9份1/15mol/L,pH6.8磷酸鹽緩沖液。

1.2方法

1.2.1小鼠免疫

(1)將高壓滅菌過的濾紙片剪成1mm×3mm大小紙條，浸入免疫原(PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-KLH、CoIα12-KLH、Trx11-KLH)液體中；

(2)用小鼠板固定小鼠，眼眶采血后打開腹腔；

(3)游離脾臟，將濾紙條植入脾臟內(nèi)；

(4)關(guān)腹，縫合，創(chuàng)可貼包扎切口；

(5)將小鼠松開，標(biāo)記免疫時間、免疫原名稱、操作者，單獨(dú)放入小鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)；

(6)一周后腹部皮下加強(qiáng)免疫一次。

1.2.2SP2/0細(xì)胞的準(zhǔn)備

(1)取1管凍存的SP2/0細(xì)胞，置于37℃水浴1min，用滴管移入10ml離心管內(nèi)加入5ml不全1640培養(yǎng)液，1500rpm離心5min，棄上清；

(2)加入5ml完全1640培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

(3)于融合前48～36小時，將骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)；

(4)融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁輕輕吹下，收集于50ml離心管內(nèi)；

(5)1500rpm離心5min，棄去上清；

(6)加入30ml不完全培養(yǎng)液，1500rpm離心5min，棄去上清；

(7)加入10ml不完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；

(8)取細(xì)胞懸液行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)時，取細(xì)胞懸液0.1ml加入0.9ml不全1640培養(yǎng)液中，混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)算細(xì)胞數(shù)目的公式為：每毫升細(xì)胞數(shù)＝4個大方格細(xì)胞數(shù)×10⁵/4；或每毫升細(xì)胞數(shù)＝5個中方格細(xì)胞數(shù)×10⁶/2。

1.2.3制備免疫脾細(xì)胞懸液

(1)取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清；

(2)通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，于解剖臺板上固定后掀開左側(cè)腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺中用無菌手術(shù)剪開腹膜，取出脾臟置于已盛有10ml不完全培養(yǎng)液的平皿中，輕輕洗滌，并細(xì)心剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織；

(3)將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養(yǎng)液的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟(也可用注射器內(nèi)芯擠壓脾臟)，使脾細(xì)胞進(jìn)入平皿中的不完全培養(yǎng)液。用吸管吹打數(shù)次，制成單細(xì)胞懸液。用200目銅網(wǎng)過濾。

(4)收獲脾細(xì)胞懸液，1500rpm離心5min，用不完全培養(yǎng)液離心洗滌3次，然后將細(xì)胞重懸于10ml不完全培養(yǎng)液；

(5)取上述懸液，行細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。通常每只小鼠可獲得1×10⁸～2.5×10⁸個脾細(xì)胞。

1.2.4飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

(1)取BALB/c小鼠，拉頸處死小鼠浸泡于75％乙醇1min；

(2)將小鼠移入超凈工作臺內(nèi)，以仰臥位固定在解剖板上，用眼科剪剪開胸部皮膚，用兩手縱向拉開皮膚，暴露腹部，并用酒精棉球擦拭腹膜消毒；

(3)用注射器抽取5ml不完全培養(yǎng)液注入腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1～2min，隨后吸出細(xì)胞懸液，移入離心管中；

(4)加不全1640培養(yǎng)液5ml，1500rpm離心5min，棄上清。用5ml HAT培養(yǎng)液將沉淀細(xì)胞重懸，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加HAT培養(yǎng)液，使細(xì)胞濃度為2×10⁵個/ml，一般每只小鼠可得2～5×10⁶個巨噬細(xì)胞；

(5)將上述細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml，然后置37℃5％CO₂及飽和濕度條件下培養(yǎng)，次日可供融合實(shí)驗(yàn)用。

1.2.5細(xì)胞融合

(1)將配好的50％PEG4000置于37℃孵箱中預(yù)溫；

(2)將1×10⁸脾細(xì)胞與2×10⁷～5×10⁷骨髓瘤細(xì)胞SP2/0在50ml尖底離心管中混勻，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)液至30ml；

(3)1500rpm離心5min，棄上清液；

(4)用食指輕彈離心管底部，使細(xì)胞沉淀團(tuán)塊稍松散；置40℃水浴中預(yù)熱。

(5)一手均勻轉(zhuǎn)動離心管，另一手用1ml吸管邊滴邊輕輕攪動，同時在1min內(nèi)加50％PEG4000 0.7ml；

(6)第2min：繼續(xù)攪拌；第3min：加入1mlRPMI 1640培養(yǎng)液；第4min：加入3mlRPMI 1640培養(yǎng)液；第5min：加總液體量至30ml；

(7)800rpm離心5min，棄去上清；

(8)加入20ml HAT培養(yǎng)液，重懸沉淀細(xì)胞；

(9)接種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.2ml；然后將培養(yǎng)板置37℃，5％CO₂及飽和濕度下培養(yǎng)。

(10)融合后7～10d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液行半量換液；

(11)2W后用HT培養(yǎng)液換出HAT培養(yǎng)液；3W后換完全1640培養(yǎng)液；

(12)培養(yǎng)8～12d，克隆可長至孔底面積的1/3～1/2，此時可取培養(yǎng)上清液，進(jìn)行抗體檢測。

1.2.6單克隆抗體的檢測(ELISA法)

(1)PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-BSA、CoIα12-BSA、Trx11-BSA分別溶于pH9.6的碳酸鹽緩沖液，濃度20μg/ml，100μl/孔,4℃過夜；

(2)棄孔內(nèi)液體，PBST洗3次，拍干；

(3)每孔加200μl封閉液，4℃過夜；

(4)棄孔內(nèi)液體，PBST洗3次，拍干；

(5)每孔加100μl待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時設(shè)立陽性、陰性對照和空白對照；37℃孵育2小時；

(6)棄孔內(nèi)液體，PBST洗3次，拍干；

(7)每孔加HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG100μl，37℃孵育30min；

(8)棄孔內(nèi)液體，PBST洗8次，拍干；

(9)每孔加TMB 50μl，H₂O₂ 50μl，室溫避光孵育30min；

(10)每孔加2mol/L H₂SO₄，終止反應(yīng)；

(11)判定結(jié)果：若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔呈黃色，試驗(yàn)孔的顏色與陽性孔的顏色基本一樣，可判定為陽性。酶標(biāo)儀測定各孔OD_450nm值，以P/N≥2.1，或P≥N+3SD為陽性。

1.2.7亞克隆(有限稀釋法)

(1)取正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種96孔培養(yǎng)板，每孔0.1ml，含2×10⁴個巨噬細(xì)胞；

(2)用彎吸管吹打雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)板中孔內(nèi)的克隆，懸浮于完全1640培養(yǎng)液中；

(3)取樣，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至100、50、10個/ml；

(4)分別將三種密度的雜交瘤細(xì)胞懸液接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔加0.1ml，理論上每孔分別含10、5、1個細(xì)胞；

(5)在37℃，5％CO₂及飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，10d后半量換液，培養(yǎng)10～14d后取培養(yǎng)上清液進(jìn)行抗體檢測；

(6)對陽性單克隆再克隆化培養(yǎng)，直到100％的克隆分泌特異性抗體為止；

(7)將陽性克隆進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存。

1.2.8細(xì)胞的凍存

(1)將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞吹打下來后，移入離心管中；

(2)1500rpm離心10min，棄上清；

(3)加入細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度為10⁶～10⁷個/ml；

(4)分裝細(xì)胞于細(xì)胞凍存管，1ml/管，標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存日期；

(5)將細(xì)胞凍存管放入一帶收口繩的小布袋內(nèi)，布袋上表明凍存號、細(xì)胞名稱等，立即將布袋放入吸管筒內(nèi)，置-70℃冰箱；

(6)2-4小時后從-70℃冰箱取出吸管筒，將盛有細(xì)胞布袋移入液氮罐；在布袋的線繩上作好標(biāo)記或代碼；最后在液氮凍存簿上作詳細(xì)記錄。

1.2.9凍存細(xì)胞的復(fù)蘇(見1.2.2)

1.2.10單克隆抗體的大量制備(腹水法)

(1)取BALB/c小鼠，腹腔注射降植烷0.5ml+福氏不完全佐劑0.5ml；

(2)收集生長良好的雜交瘤細(xì)胞，離心洗滌1次，重懸于無血清培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度為(1～2)×10⁶個/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml細(xì)胞懸液；

(3)接種細(xì)胞7～12d，可見小鼠腹部明顯膨大。消毒腹部皮膚，用5ml注射器接8號針頭，刺入腹腔，卸下注射器，太高小鼠頭部，使腹水滴入離心管中；

(4)3000rpm離心15min，棄去上層油脂，吸取淡黃色腹水，分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.11腹水純化(高速離心加二氧化硅吸附法)

(1)取腹水適量，10000rpm 15min；

(2)取上層清亮的腹水，等量加入pH7.2巴比妥緩沖鹽水(VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg²⁺，0.3mmol/L Ca²⁺)稀釋；

(3)每10ml腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30min，不時搖動；

(4)3000rpm離心20min。

1.2.12染色體分析(秋水仙素法)

(1)取對數(shù)生長期細(xì)胞，用含10％新生牛血清的完全1640培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，接種于25ml培養(yǎng)瓶中，移入CO₂孵箱培養(yǎng)54h；

(2)終止培養(yǎng)前4～6h，將秋水仙素加入培養(yǎng)液中(終濃度0.04～0.8μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4～6h；

(3)用吸管輕輕吹打分裂相細(xì)胞，移入10ml離心管中；

(4)1000rpm離心10min，棄上清液；

(5)逐滴加入0.5ml預(yù)溫37℃的0.075mol/L KCl混勻，隨即補(bǔ)加至5～10ml，用吸管輕輕吹打均勻，37℃孵育20～30min；

(6)向離心管中加入1ml新鮮固定液；

(7)1000rpm離心10min，棄上清液；

(8)沿離心管管壁緩緩加入新鮮固定液8～10ml，用吸管吹打均勻，固定15min；

(9)1000rpm離心10min，棄上清液；

(10)緩緩加入新鮮固定液，用吸管吹打均勻，固定30min；

(11)1000rpm離心10min，棄上清液；視細(xì)胞量再加入0.5～1ml新鮮固定液，吹打均勻；

(12)取0℃冰凍的載玻片，距離玻片15cm高度，向玻片滴1～2滴細(xì)胞懸液，空氣中干燥；

(13)用新鮮Giemsa染色液染15min，流水沖洗玻片背面，晾干；

(14)鏡下觀察染色體形態(tài)，數(shù)量。

1.2.13單克隆抗體亞型鑒定

應(yīng)用IsoStrip單抗亞型鑒定試條，將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清1:50稀釋，從中取出150μl加入試管，然后再加等量的新鮮稀釋液入試管，室溫孵育30s后快速搖勻；將單抗亞型鑒定試條插入試管中，黑端向下，5～10min后觀察藍(lán)色條帶的位置。

2結(jié)果

2.1抗原的制備

PGAM、CoIα、Trx蛋白研究三中已經(jīng)原核表達(dá)成功。

2.2雜交瘤細(xì)胞的染色體分析

用秋水仙素阻抑法對雜交瘤細(xì)胞株的核型分別進(jìn)行了分析，細(xì)胞的染色體數(shù)分別為105、109、108、108、110、106，均約為小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)(分別為42和70)之和，證明確為兩親本細(xì)胞融合后的雜交體。

2.3雜交瘤細(xì)胞株的建立

用PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-KLH、CoIα12-KLH、Trx11-KLH通過脾內(nèi)包埋免疫BALB/c小鼠取得了較好的免疫應(yīng)答。應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，常規(guī)細(xì)胞融合，用ELISA法進(jìn)行抗體篩選，選擇陽性較強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞孔內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。

獲得了3株針對PGAM的雜交瘤細(xì)胞株，2株針對CoIα的雜交瘤細(xì)胞株，5株針對Trx的雜交瘤細(xì)胞株，3株針對PGAM13的雜交瘤細(xì)胞株，4株針對CoIα12的雜交瘤細(xì)胞株，3株針對Trx11的雜交瘤細(xì)胞株，分別選擇其中陽性反應(yīng)最強(qiáng)的1株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，序號分別為：4G5、4F4、5A2、5C3、4H7、5B2，分別命名為：NP61、NP62、NP63、NP71、NP72、NP73；其克隆化結(jié)果見表1～6。余者凍存。在半年內(nèi)對獲得的細(xì)胞株進(jìn)行反復(fù)凍融，其分泌抗體的穩(wěn)定性和能力均無改變。

表1 雜交瘤細(xì)胞株P(guān)GAM4G5克隆化結(jié)果

表2 雜交瘤細(xì)胞株CoIα4F4克隆化結(jié)果

表3 雜交瘤細(xì)胞株Trx5A2克隆化結(jié)果

表4 雜交瘤細(xì)胞株P(guān)GAM13 5C3克隆化結(jié)果

表5 雜交瘤細(xì)胞株CoIα12 4H7克隆化結(jié)果

表6 雜交瘤細(xì)胞株Trx11 5B2克隆化結(jié)果

2.4單克隆抗體的Ig類、亞類鑒定

IsoStrip單抗亞型鑒定試條檢測結(jié)果顯示：抗PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11的單克隆抗體均屬于IgM。

2.5腹水抗體效價的測定

上述單克隆抗體分別經(jīng)腹腔誘導(dǎo)法制備高滴度特異性的單抗腹水。用間接非競爭性ELISA檢測方法測定腹水抗體稀釋度：抗PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11腹水單克隆抗體的稀釋度分別為：1：6.0×10⁶、1：2.0×10⁶、1：8.0×10⁶、1：3.0×10⁶、1：9.0×10⁵、1：6.0×10⁶；參考工作濃度分別為：1：6.0×10⁵、1：6.0×10⁵、1：6.0×10⁵、1：6.0×10⁵、1：6.0×10⁵、1：6.0×10⁵。

2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線

PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11的最低檢出限均為5μg/L，線性范圍50～500μg/L，線性方程Y＝-0.582X+1.793(r＝0.99，P＜0.05)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110> 申請人名稱:濱州醫(yī)學(xué)院

<120>一種單克隆抗體及其制備方法

<160> 6

<210>1

<211> 753

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

ATGGCTCCCT ACAAAATTGT ATTCATTCGT CATGGGGAGA GTGTTTACAA TGAAGAAAAT

AGATTCTGTG GTTGGCATGA TGCAGACCTT TCAGCGCAAG GTGTCACCGA AGCTGAACAA

GCTGGTCAAT TACTCCACCA AAATCAGTTC ACATTTGACA CTGCCTATAC AAGTGTTCTA

AAAAGAGCTA TTAAAACGTT AAACTTTGTT TTAGACAAAC TCGATCTTAA CTGGATACCT

GTAACGAAAA CGTGGCGTCT AAATGAAAGA ATGTACGGTG CTCTCCAGGG ACTTAATAAG

TCTGAAACTG CTGCTAAACA TGGTGAGCAA CAAGTTAAGA TATGGAGACG TGCATATGAT

ATACCTCCTC CTCCTGTTGA TATTTCGGAC CCTCGCTTCC CTGGTAATGA AGCTAAGTAT

GCTTTACTTG ACTCTTCTTG CATACCACGT ACTGAATGCT TAAAGGACAC TGTACAACGT

GTACTACCAT TCTGGTTTGA TACTATTTCT GCTGATATTA AGAGCTGCAA ACGTGTTCTT

ATTGTCGCTC ACGGTAACAG TTTACGAGCG CTCATTAAGT ACTTGGATAA TACATCTGAT

TCGGATATAG TGGAGCTTAA TATACCTACT GGTATTCCAC TCGTTTATGA ACTAGATGCA

AACCTAAGGC CAATCAAACA CTATTATCTT GCGGATGAAG CAACAGTTGC AGCTGCTATA

GATCGTGTAG CGAATCAAGG AAAGAAGAAA TAA

<210>2

<211> 1317

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

ATGCAAGCGC CGCACAGGTT GTTAATAATG TTGGCTTTAC GTCTTCAAGT TCGAAGATCT

CTGACTAGGA ATATTTCAGG ATGGTCAGAT AATTTGCGTA AGCAATCGAA ACTTTCTGAA

GTTGTTTATT CACGCGAAGA TAAATATGGA GCACACAATT ACCACCCTCT ACCAGTAGCA

TTATCAAAAG GCAAAGGAAT TTATGTGTGG GATGTTGAGG GAAACTGTTA TATGGATTTC

TTGAGCGCTT ATAGTGCTGT TAACCAAGGG CACTGTCATC CACGTATTGT TGATGCAATT

AAAACCCAAT CGGAAACACT AACCCTTACT TCACGAGCAT TCTATAATGT TGTTTTGGGA

GAATTTGAGG AAATGGCTAC AAAAATGTTT GGTTATGACA AGGTGTTACC CATGAATTCA

GGTGTTGAAG CTGGTGAAAC CTCTCTAAAA CTTGCACGTA AATGGGGTTA TAAGGTAAAG

AAAATTCCTG ATGGACAAGC CAGAGTTATA TTTGCTGAAG GAAATTTCTG GGGTCGTACG

TTAGCTGCAT GCTCTTCATC CACTGATCCT GCATGCTACT CAGGATTTGG ACCATTTATG

CCAGGCTTTG TAATTGTCCC TTATGATGAC TTAAATGCTC TTGAAGTTGA ATTAAAAAAT

CCAAATACGT GCGCATTTAT GGTGGAACCA ATTCAAGGTG AAGCTGGCGT TCGTACACCA

TCAGATGGTT ATTTAAAGGG TGTACGAAAA TTGTGTACTA AATATAATGT ACTATTTATT

GCAGATGAAA TACAAACTGG TTTAGGCAGA ACAGGAAAAC GACTTTGTGT AAATCATGAA

GATGTTCGAC CAGACATTGT TTTACTTGGC AAAGCTTTAT CAGGAGGAAT GCTTCCAATC

TCTGCTGTTC TTGCCGATGA TGAAGTAATG CTGACTATTC AACCTGGGGA ACATGGGTCA

ACTTATGGTG GTAATCCATT AGCATGTAGA GTTGCTATGG CCGCTTTACG TGTTTTAGAA

GAGGAAGGTT TAGCAGAACG TGCACAGAAA TTGGGTGAAA TCTTCCGCAA TGAATTGAGT

AAACTCCCAA AATCTGTAGT TGAATTATAT CGTGGCAAAG GGCTTTTAAA CGCTATTGTA

ATTCGTCAAG GATTCAATGC ATGGGATGTT TGTTTAAAGT TACGCGATCA TGGTTTATTG

GCTAAGCCTA CACACGACAC AATAATTCGA TTAGCCCCAC CTTTAGTTAT TAAAGAAGAT

GAGTTGCATA AAGCGGCAGA GATTATGCAC AAAGTGATTG GTTCGTTGAG TAATTAG

<210>3

<211>261

<212> RNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

ATGAGTAACG TACTGCATAT AGAAACCGAT GACGATTTTG ATTCTTTCTT AAAGGAAAAT

AAGGATAAAT TAATTGTTGT TGATTTTTTC GCAACTTGGT GTGGGCCGTG TAAAAAAATA

GCTCCTGCTT TCGAAGCGTT GAGCGCTGAT CGTTCGGCAT TATATGTGAA GGTTGACGTG

GATAAACTTG AAGAAACTGC CAAAAGATAC GATGTAACAG CTATGCCGAC GTTTGTTGTG

ATAAAAAATG GCGAAAAAGT CGATACAGTG GTTGGAGCTT CTATAGAAAA TGTTGAAGCT

GTGATCCGGA AACACAAATG A

<210>4

<211>13

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

CSAQGVTEAEQAG；

<210>5

<211>12

<212> RNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

CLRMRYKRSAVV；

<210>6

<211> 11

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

CEF KVNKSETI。