一株產γ?氨基丁酸的植物乳桿菌SG5的制作方法

本發(fā)明涉及微生物技術領域，更具體地，涉及一種產γ-氨基丁酸的植物乳桿菌SG5。

背景技術：

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡稱GABA)是哺乳動物神經中樞的一種抑制性遞質，具有調節(jié)血壓、促使精神安定、促進腦部血流、增進腦活力、營養(yǎng)神經細胞、增加生長激素分泌、健肝利腎、促進乙醇代謝(醒酒)等多種功效。2009年衛(wèi)生部已正式批準GABA為新資源食品，富集GABA的原料可應用于生產功能性食品，通過飲食來降低和預防高血壓。GABA的獲取方法有化學合成法和生物法?；瘜W合成法成本較高，產品中易殘留化學物質，不屬于天然產物，應用有條件限制。生物法主要從植物體和微生物發(fā)酵液中獲取，相對于植物富集法的成本高、產率低和局限性大的缺點，微生物發(fā)酵法更有優(yōu)越性，它不受空間、環(huán)境和資源的限制，具有成本低、無化學殘留和產量高等顯著優(yōu)點，是富集γ-氨基丁酸的理想途徑。

現有技術分離得到的產γ-氨基丁酸的微生物多為真菌，真菌生長較為緩慢，不能滿足生產需要。

技術實現要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種γ-氨基丁酸的植物乳桿菌SG5。

本發(fā)明第二個目的是提供含有所述植物乳桿菌SG5的微生物制劑。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案予以實現的：

一種產γ-氨基丁酸的植物乳桿菌SG5，該植物乳桿菌SG5保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏地址是廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年3月16日，保藏編號為GDMCC No：60020。

菌株菌落形態(tài)鑒定：在MRS培養(yǎng)基上菌落較小、圓形、中間隆起，表面濕潤光滑，不透明，乳白色，邊緣整齊；革蘭氏陽性菌，成對或鏈狀。菌株形態(tài)呈兩端鈍圓的短桿狀，長短不一，無芽孢，細胞大小為(0.5～1)μm×(2～3)μm，該菌株為兼性厭氧菌，API50鑒定結果與植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的ID為99.9％。

所述植物乳桿菌SG5的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明植物乳桿菌SG5可在MRS培養(yǎng)基上生長，其中培養(yǎng)基的最佳配方為20g/L酵母膏、20g/L葡萄糖、10g/L丁二酸鈉、5mg/mL L-谷氨酸、1mg/L磷酸吡哆醛及1mg/mL Ca²⁺。

植物乳桿菌SG5的最適生長溫度30℃，最適合生長環(huán)境的pH值為6.8；可高產γ-氨基丁酸的最佳發(fā)酵時間為48h，菌體接種量為2％。

γ-氨基丁酸作為新型功能因子，具有降低血壓的作用，因此，本發(fā)明還提供一種含有所述植物乳桿菌SG5的微生物制劑。

本發(fā)明還提供所述植物乳桿菌SG5在產γ-氨基丁酸方面的應用。

具體地，所述應用是將植物乳桿菌SG5在TYG培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48h，pH值為6.8，所述植物乳桿菌SG5的接種量為2％(×10⁶cfu/mL)。

更具體地，所述TYG培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有20g/L酵母膏、20g/L葡萄糖、10g/L丁二酸鈉、5mg/mL L-谷氨酸、1mg/L磷酸吡哆醛及1mg/mL Ca²⁺。

與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種產γ-氨基丁酸的植物乳桿菌SG5，該植物乳桿菌SG5保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏地址是廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年3月16日，保藏編號為GDMCC No：60020；利用該菌進行發(fā)酵GABA的含量可達59μg/mL，GABA具有降血壓、促進生長激素分泌和降低膽固醇等多種有益的保健功能，為開發(fā)新的富含γ-氨基丁酸的保健食品提供依據，將所述植物乳桿菌SG5應用于食品、保健品的開發(fā)，具有廣泛的應用前景。

附圖說明

圖1為基于16SrDNA基因序列建立的乳桿菌屬系統發(fā)育樹。

圖2為發(fā)酵液超高效液相色譜-質譜圖；其中，A—GABA標準品的峰圖；B—GABA標準品分子質量圖譜；C—發(fā)酵液樣品超高效液相色譜圖；D—發(fā)酵液樣品的分子質量圖譜。

圖3為SG5在MRS培養(yǎng)基(A)及乳酸菌分離培養(yǎng)基(含溴甲酚綠)平板(B)上的菌落形態(tài)圖。

圖4為菌株SG5革蘭氏染色的細胞形態(tài)。

圖5為SG5菌體投射電鏡圖。

具體實施方式

下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1菌株的分離、篩選與鑒定

菌株分離：選取新鮮完整的桑葉先用自來水沖洗干凈，在無菌超凈臺內用無菌水再沖洗及用無菌濾紙吸干水分，剪碎；將剪碎的桑葉置于MRSG液體培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基中加入2％v/v，1mg/mL的谷氨酸鈉)中，于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，待桑葉碎片周圍長出菌體，挑取菌體在MRS固體培養(yǎng)基上多次劃線分離純化；將純化后的菌株于斜面培養(yǎng)基(MRS)培養(yǎng)，挑單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基TYG中30℃培養(yǎng)48h后做薄層定性，初步鑒定分離可知所得菌株可產γ-氨基丁酸。

陰性對照：為了檢查桑葉表面除菌是否徹底，取最后一次無菌水沖洗液涂布在MRS固體培養(yǎng)基上作對照，另將無菌水清洗后的桑葉材料在MRS固體培養(yǎng)基上作對照，于相同的條件下培養(yǎng)。

經過多次重復，對照的平板培養(yǎng)基均無任何菌落長出，證明桑葉表面除菌徹底，分離到的菌是桑葉內細菌，而不是植株表面的附生菌。

菌株的篩選：以功能活性物質—γ-氨基丁酸為指標，采用響應面分析法優(yōu)化菌株發(fā)酵條件。將-80℃保存的分離所得菌株于MRS液體培養(yǎng)基中30℃，120r/min培養(yǎng)16h，活化兩次，接種于TYG發(fā)酵培養(yǎng)基中富集GABA。根據單因素實驗結果對4個主要因素(底物濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間)進行響應面優(yōu)化實驗，建立實驗模型，若實驗模型顯著，利用響應面優(yōu)化試驗方法，最終設計三因素三水平的響應面實驗，以底物濃度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間3個因素為自變量，GABA產量為響應值，確定最優(yōu)發(fā)酵條件。用Berthelot比色法或HPLC法對發(fā)酵液中富集的GABA定量分析，最終確定高產GABA菌株(簡稱為SG)。

菌株分子鑒定：對篩選得到的高產GABA菌株進行分子鑒定，按以下步驟進行：提取菌株的基因組DNA，利用細菌16S rDNA的通用引物，以基因組DNA為模板進行PCR擴增。然后利用膠回收試劑盒回收純化PCR產物，之后進行克隆、轉化，篩選陽性克隆的菌落，經擴大培養(yǎng)后委托廣州華大基因技術有限公司進行測序。

測序可知菌株的16S rDNA序列長度為1371bp，其序列如SEQ ID NO：1所示，將測序結果與GenBank中的16S rDNA序列進行同源性比對，然后用軟件構建系統發(fā)育樹(如圖1所示)，以確定菌株的種屬關系。同源性分析結果表明，該序列與Lactobacillus plantarum(植物乳桿菌)的同源性達99％，因此將該高產GABA的菌株屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。

菌株菌落形態(tài)鑒定：在MRS培養(yǎng)基上菌落較小、圓形、中間隆起，表面濕潤光滑，不透明，乳白色，邊緣整齊；在乳酸菌分離培養(yǎng)基(含溴甲酚綠)平板，30℃培養(yǎng)48h，出現圓形乳白或黃色菌落，周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步確定為乳酸菌(如圖3所示)。菌體形態(tài)經革蘭氏染色后用顯微鏡于100倍的油鏡下觀察并拍照。如圖4所示，可知其為革蘭氏陽性菌，成對或鏈狀。菌株細胞經透射電鏡(TEM,Tenai 12,Holland)觀察，見圖5，形態(tài)呈兩端鈍圓的短桿狀，長短不一，無芽孢，細胞大小為(0.5～1)μm×(2～3)μm。

菌落生理生化鑒定：參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第九版)、《常見細菌系統鑒定手冊》和法國生物梅里埃API鑒定系統對植物乳桿菌進行鑒定，其結果如表1所示：

表1菌株SG-5的API 50CHL檢測結果

注：“﹣”表示陰性，“﹢”表示陽性。

由表1結果再次驗證，植物乳桿菌SG5API的ID與Lactobacillus plantarum(植物乳桿菌)為99％，將其命名為該植物乳桿菌SG5，該植物乳桿菌SG5保藏在廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，保藏地址是廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年3月16日，保藏編號為GDMCC No：60020。

實施例2菌株的培養(yǎng)

植物乳桿菌SG5可在MRS培養(yǎng)基上生長，MRS培養(yǎng)基(1000mL)由20g酵母膏、20g葡萄糖、10g丁二酸鈉、5mg/mL L-谷氨酸(0.5％v/v)、1mg磷酸吡哆醛(生長因子)及1mg/mL Ca²⁺和余量的蒸餾水組成，調節(jié)pH值6.8～7.0，于121℃高壓滅菌20min。

1、植物乳桿菌SG5的活化：在超凈工作臺中無菌操作。用接種環(huán)挑取植物乳桿菌SG5，在MRS固體培養(yǎng)基上用接種環(huán)劃線，在30℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)2d。

2、植物乳桿菌SG5發(fā)酵樣品的制備：將分離得到的植物乳桿菌SG5接種于MRS液體培養(yǎng)基中，作3個重復，置于150r/min，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16～18h取出，作為種子液；將種子液按2％的接種量接種到裝有50mL TYG液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于150r/min 30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，得發(fā)酵液(經優(yōu)化得植物乳桿菌SG5的最適生長溫度為30℃，最適生長環(huán)境的pH值為6.8)。

3、用超高效液相-質譜聯用法對發(fā)酵液樣品中GABA進行定性及定量的檢測：GABA標準品購至Sigma公司，乳酸菌發(fā)酵液樣品的超高效液相色譜-質譜分析圖與標準品GABA相比較見圖2。

由圖2可以看出標準品GABA的出峰時間在0.4～0.6min，其相對分子質量為104.0707；檢測發(fā)酵液樣品GABA相對分子質量為104.1072，與標準品GABA的相對分子質量十分接近，發(fā)酵液樣品的出峰時間較標樣的略寬些，還有一個小的雜峰出現，有可能是受到其他基質的干擾。該結果證實了發(fā)酵液中含有GABA。

4、高效液相色譜法(HPLC)測定發(fā)酵液GABA含量

將SG5的發(fā)酵液沸水浴10min后，以12000r/min離心10min，用微量進樣器吸取上清液用高效液相色譜法(HPLC)法分別測定初篩的五個樣品發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的濃度(優(yōu)化得植物乳桿菌SG5產γ-氨基丁酸的最佳液體發(fā)酵時間為48h，GABA的含量可達59μg/mL)。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農業(yè)大學

<120> 一株產γ-氨基丁酸的植物乳桿菌SG5

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1371

<212> DNA

<213> 植物乳桿菌SG5的16S rDNA序列

<400> 1

gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 60

gcgattccga cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc cgaactgaga atggctttaa 120

gagattagct tactctcgcg agttcgcaac tcgttgtacc atccattgta gcacgtgtgt 180

agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 240

ccggcagtct caccagagtg cccaacttaa tgctggcaac tgataataag ggttgcgctc 300

gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 360

atccatgtcc ccgaagggaa cgtctaatct cttagatttg catagtatgt caagacctgg 420

taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 480

tcaattcctt tgagtttcag ccttgcggcc gtactcccca ggcggaatgc ttaatgcgtt 540

agctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc attcatcgtt tacggtatgg 600

actaccaggg tatctaatcc tgtttgctac ccatactttc gagcctcagc gtcagttaca 660

gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt tcaccgctac 720

acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc agtttccgat gcacttcttc 780

ggttgagccg aaggctttca catcagactt aaaaaaccgc ctgcgctcgc tttacgccca 840

ataaatccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 900

gtggctttct ggttaaatac cgtcaatacc tgaacagtta ctctcagata tgttcttctt 960

taacaacaga gttttacgag ccgaaaccct tcttcactca cgcggcgttg ctccatcaga 1020

ctttcgtcca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct 1080

cagtcccaat gtggccgatt accctctcag gtcggctacg tatcattgcc atggtgagcc 1140

gttaccccac catctagcta atacgccgcg ggaccatcca aaagtgatag ccgaagccat 1200

ctttcaagct cggaccatgc ggtccaagtt gttatgcggt attagcatct gtttccaggt 1260

gttatccccc gcttctgggc aggtttccca cgtgttactc accagttcgc cactcagtca 1320

aatgtaaatc atgatgcaag caccaatcaa taccagagtt cgttcgactg c 1371