本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域的一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一，廣泛分布于自然界，是一種可以引起人類和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。目前在食品、化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中已將金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)作為常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目。
金黃色葡萄球菌多以凍干粉的形式供應(yīng)市場，國內(nèi)外廣泛采用的金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑有可溶性淀粉、脫脂奶粉、海藻糖、乳糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉、抗壞血酸鈉、維生素C等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以脫脂奶粉為單一保護(hù)劑，凍干后金黃色葡萄球菌存活率不足50%，而以可溶性淀粉、脫脂奶粉、海藻糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉、抗壞血酸鈉、磷酸鹽緩沖液作為菌種復(fù)方冷凍干燥保護(hù)劑，凍干后金黃色葡萄球菌存活率也只有51.74%。這些保護(hù)劑的保護(hù)效果都不夠理想，而實(shí)際上，凍干保護(hù)劑的作用會(huì)隨保護(hù)劑的組成和配比表現(xiàn)出一定的差異性，因此，開發(fā)性質(zhì)獨(dú)特、作用高效的金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在提供一種能有效提高金黃色葡萄球菌凍干制備過程存活率的新型復(fù)合保護(hù)劑。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑，包括海藻糖、谷氨酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽和牛血清白蛋白。
一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑，以質(zhì)量體積百分比計(jì)，包括以下組分：
海藻糖2%-6%、谷氨酸鈉12%-18%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5%-1.5%、牛血清白蛋白0.25%-0.75%。
所述的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑，優(yōu)選，以質(zhì)量體積百分比計(jì)，包括以下組分：
海藻糖2%、谷氨酸鈉15%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5%、牛血清白蛋白0.5%。
本發(fā)明中涉及到的百分號“%”，若未特別說明，均指質(zhì)量體積百分比；溶液的百分比，除另有規(guī)定外，均指溶液100ml中含有溶質(zhì)若干克。
若未特別說明，本發(fā)明中涉及到的溶液的溶劑均為水。
本發(fā)明的一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的有益效果如下：
復(fù)合保護(hù)劑中加入海藻糖可以替代細(xì)胞中的水分子與細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)上的親水基團(tuán)形成水合鍵，保證了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，同時(shí)海藻糖還可以提高菌懸液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，使菌懸液形成玻璃態(tài)，使敏感性物質(zhì)嵌入到玻璃態(tài)中，從而保護(hù)細(xì)胞；谷氨酸鈉在凍干過程中可以與水作用使干粉保留微量的水分，以滿足微生物細(xì)胞維持生命的最低需求，此外谷氨酸鈉還具有抗氧化的作用，抑制三酰甘油的氧化和自由基的形成，防止對細(xì)胞膜造成不可逆的破壞；L-半胱氨酸是唯一具有活性巰基（-SH）的氨基酸，具有還原性，在凍干過程中，氨基酸的氨基團(tuán)與微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)的羰基作用，可以使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；血清白蛋白是一種經(jīng)典、優(yōu)良的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，可以使蛋白質(zhì)活性不受損失，對凍干過程中的大多數(shù)蛋白都具有保護(hù)作用。
綜上，本發(fā)明提供的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑，結(jié)合糖類、蛋白類保護(hù)劑和抗氧化劑，使其達(dá)到增效、協(xié)同的作用，有效提高了金黃色葡萄球菌凍干粉的存活率，可以達(dá)到99.82%。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和實(shí)質(zhì)的前提下，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行的修飾或者替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范疇中。
實(shí)施例中涉及到的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC 21600）由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。
在實(shí)施例中，菌粉的制備及凍干存活率的計(jì)算采用如下方式：在常規(guī)的適宜條件下轉(zhuǎn)接復(fù)活菌株后搖瓶擴(kuò)增，將穩(wěn)定初期菌懸液6000rpm離心10min，棄上清，留菌泥用等量生理鹽水洗滌，6000rpm離心10min，棄上清，將得到的菌泥與保護(hù)劑混勻，取1ml按10倍遞增稀釋法稀釋，選擇適宜稀釋度傾注法計(jì)數(shù)，其余菌液分裝西林瓶， -80℃預(yù)凍2-3h，然后真空冷凍干燥16-18h，壓蓋，下機(jī)，-20℃保藏。結(jié)束干燥后，隨機(jī)取3瓶立即復(fù)水，用1.1ml生理鹽水使其溶解完全，取1ml按前述方法計(jì)數(shù)，計(jì)算凍干前后的活菌數(shù)之比，即保護(hù)劑對于菌種的凍干存活率。
實(shí)施例1
本實(shí)施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的組成為：海藻糖2g、谷氨酸鈉12g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、牛血清白蛋白0.25g、蒸餾水100ml。
其制備方法：
1）按量在蒸餾水中添加2g的海藻糖、12g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；
2）按量將0.5g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.25g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過濾除菌；
3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調(diào)整水的總質(zhì)量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌復(fù)合凍干保護(hù)劑。
將金黃色葡萄球菌活化培養(yǎng)、離心、洗滌后，收集菌泥，在凍干前與保護(hù)劑混合，分裝，于-80℃預(yù)凍3h，然后冷凍干燥18h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經(jīng)檢測金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為94.10%。
實(shí)施例2
本實(shí)施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的組成為：海藻糖4g、谷氨酸鈉12g、L-半胱氨酸鹽酸鹽1g、牛血清白蛋白0.75g、蒸餾水100ml。
其制備方法：
1）按量在蒸餾水中添加4g的海藻糖、12g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；
2）按量將1g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.75g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過濾除菌；
3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調(diào)整水的總質(zhì)量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑。
將金黃色葡萄球菌活化培養(yǎng)、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護(hù)劑混合，分裝，于-80℃預(yù)凍3h，然后冷凍干燥16h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經(jīng)檢測金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為71.40%。
實(shí)施例3
本實(shí)施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的組成為：海藻糖6g、谷氨酸鈉18g、L-半胱氨酸鹽酸鹽1g、牛血清白蛋白0.25g、蒸餾水100ml。
其制備方法：
1）按量在蒸餾水中添加6g的海藻糖、18g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；
2）按量將1g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.25g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過濾除菌；
3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調(diào)整水的總質(zhì)量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑。
將金黃色葡萄球菌活化培養(yǎng)、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護(hù)劑混合，分裝，于-80℃預(yù)凍3h，然后冷凍干燥17h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經(jīng)檢測金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為77.88%。
實(shí)施例4
本實(shí)施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的組成為：海藻糖2g、谷氨酸鈉15g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、牛血清白蛋白0.5g、蒸餾水100ml。
其制備方法：
1）按量在蒸餾水中添加2g的海藻糖、15g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；
2）按量將0.5g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.5g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過濾除菌；
3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調(diào)整水的總質(zhì)量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑。
將金黃色葡萄球菌活化培養(yǎng)、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護(hù)劑混合，分裝，于-80℃預(yù)凍3h，然后冷凍干燥18h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經(jīng)檢測金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為99.82%。
實(shí)施例5
本實(shí)施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的組成為：海藻糖6g、谷氨酸鈉15g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、牛血清白蛋白0.75g、蒸餾水100ml。
其制備方法：
1）按量在蒸餾水中添加6g的海藻糖、15g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；
2）按量將0.5g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.75g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過濾除菌；
3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調(diào)整水的總質(zhì)量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑。
將金黃色葡萄球菌活化培養(yǎng)、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護(hù)劑混合，分裝，于-80℃預(yù)凍3h，然后冷凍干燥18h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經(jīng)檢測金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為93.87%。