一種蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin?ccm3及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于凝集素領(lǐng)域，特別涉及一種蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

凝集素(lectin)是一類(lèi)能選擇性地識(shí)別糖并與之非共價(jià)可逆結(jié)合的非抗體蛋白質(zhì)。因其能凝集紅細(xì)胞，故名凝集素(Barcmdes，1988)。1995年P(guān)eumans和Van Damme提出了植物凝集素的新定義，即凝集素蛋白含有至少一個(gè)可與專(zhuān)一性單糖或低聚(寡)糖可逆性結(jié)合的、非催化結(jié)構(gòu)域(Peumans，1995)。

細(xì)胞凝集是最容易直觀表征凝集素與細(xì)胞結(jié)合的現(xiàn)象。凝集素一般具有兩個(gè)或兩個(gè)以上的糖結(jié)合位點(diǎn)，因此可以與多個(gè)特異性細(xì)胞同時(shí)結(jié)合，從而使游離的細(xì)胞聚集成團(tuán)而產(chǎn)生凝集效應(yīng)。研究表明，凝集素不僅可以與紅細(xì)胞結(jié)合，還可以與細(xì)菌、淋巴細(xì)胞、生殖細(xì)胞等其它細(xì)胞結(jié)合。

蘑菇凝集素可凝集各種血紅細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等。凝集素的細(xì)胞凝集作用是凝集素分子的一個(gè)亞基與一個(gè)細(xì)胞表面的凝集素專(zhuān)一識(shí)別的糖基結(jié)合，另一個(gè)亞基與另一個(gè)細(xì)胞上的糖基結(jié)合，從而通過(guò)凝集素的架橋作用而導(dǎo)致的(劉艷如，2003)。

糙皮側(cè)耳凝集素對(duì)肝細(xì)胞瘤H-22(Wang,2000)、薄蓋靈芝凝集素對(duì)白血病L1210和M1細(xì)胞和肝癌(HepG2)細(xì)胞(Ngai,2004)、牛舌菌凝集素FHL對(duì)HeLa細(xì)胞等均具有明顯的抑制作用(林玉滿(mǎn)，2004)。植物凝集素在植物的防御反應(yīng)中起重要作用，具有抗細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)，甚至阻止被動(dòng)物獵食的功能(Peumans,1995)。有研究結(jié)果顯示大型真菌凝集素在真菌體內(nèi)可能與植物凝集素相似，在真菌的防御反應(yīng)中具有重要的作用(孫慧，2003)。

對(duì)蛹蟲(chóng)草中凝集素的分子生物學(xué)研究還未見(jiàn)報(bào)道，蛹蟲(chóng)草基因組已經(jīng)測(cè)序完成，將注釋為凝集素合成基因進(jìn)行原核表達(dá)，構(gòu)建凝集素高效表達(dá)的菌株，明確蛹蟲(chóng)草凝集素的生物活性，為蛹蟲(chóng)草里的凝集素的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3及其制備方法和應(yīng)用，該蛋白能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)、抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖等生物活性，因此，在抗菌抗癌方面具有應(yīng)用潛力。

本發(fā)明提供了一種蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本發(fā)明又提供了一種編碼蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3的基因，所述基因的序列如SEQID NO.2所示。

該蛋白屬于一種新型的真菌凝集素蛋白。將其cDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與其相似的基因序列，而將其氨基酸序列在NCBI的無(wú)冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)(nr)中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白與來(lái)源于布氏蟲(chóng)草(Cordyceps brongniartii)凝集素蛋白的相似性達(dá)到84.79％，與來(lái)自于球孢白僵菌(Beauveria bassiana)凝集素蛋白的相似性為85.19％，與來(lái)自于綠僵菌(Metarhizium brunneum)凝集素蛋白的相似性為51.49％。說(shuō)明Lectin-ccm3是一種新的真菌凝集素蛋白，其編碼的基因是一個(gè)新的基因。

本發(fā)明又提供了一種蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3基因的載體。

優(yōu)選的，所述載體為pET-32a。

最優(yōu)選的，將蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3基因插入到pET-32a上的EcoRI限制性酶切位點(diǎn)上，得到重組載體pET-Lectin-ccm3。

本發(fā)明又提供了一種含蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3基因的重組菌株。

優(yōu)選的，所述重組菌株為BL21-Lectin-ccm3。

本發(fā)明的一種蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3的制備方法，包括：

(1)將蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白的cDNA序列連入載體中，得到重組載體；

(2)將上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到重組菌株；

(3)培養(yǎng)上述重組菌株，誘導(dǎo)重組蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3的表達(dá)；

(4)純化、透析分離獲取所表達(dá)的蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3。

所述步驟(2)中的宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21細(xì)胞。

本發(fā)明的一種蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3的應(yīng)用，所述蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3用于制備抗菌抗癌藥物。

有益效果

本發(fā)明通過(guò)體外重組得到的蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)、抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖等生物活性，因此，在抗菌抗癌方面具有應(yīng)用潛力。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3氨基酸序列與其它真菌凝集素蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果；

圖2為本發(fā)明pET-Lectin-ccm3質(zhì)粒圖譜；

圖3為本發(fā)明蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3表達(dá)的SDS-PAGE分析；其中，1為空載體，2為未誘導(dǎo)菌體，3為菌體破碎沉淀，4為L(zhǎng)ectin-ccm3蛋白，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；

圖4為本發(fā)明蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)；其中，Amp為陽(yáng)性對(duì)照，抑菌圈直徑2.1cm，1為空載體，2為L(zhǎng)ectin-ccm3蛋白，抑菌圈直徑1.2cm；

圖5為本發(fā)明蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3抑制HeLa細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述是實(shí)例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑公司買(mǎi)得。以下實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

1.細(xì)胞株：BL21感受態(tài)，Top10感受態(tài)。

2.試劑盒、酶類(lèi)、生化試劑和儀器：

試劑盒：天根質(zhì)粒提取試劑盒，天根蛋白定量檢測(cè)試劑盒，上海生工PCR產(chǎn)物回收試劑盒，PCR引物合成和基因測(cè)序均由上海生工完成。

酶類(lèi)：Takara常規(guī)內(nèi)切酶，Takara DNA T4連接酶,TaqDNA聚合酶

儀器：艾本德微量加樣器、賽默飛世爾離心機(jī)、上海天能凝膠成像儀、水平電泳槽、垂直電泳槽，江陰諾源恒溫培養(yǎng)搖床，新芝超聲破碎儀，ABI PCR儀，伯樂(lè)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

生化試劑：

國(guó)藥冰乙酸、丙三醇(甘油)、無(wú)水乙醇、異丙醇、甲醇、甘氨酸、Tris、氫氧化鈉、EDTA、氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀；

丙烯酰胺、N,N-亞甲叉丙烯酰胺、IPTG；Oxdine胰蛋白胨、酵母提取物；Solarbio氨芐青霉素、卡那抗生素；SDS、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R-250、AP。

3.培養(yǎng)基：生工LB培養(yǎng)基。

實(shí)施例1

蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3基因序列信息與同源性分析

本發(fā)明蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3序列為1299bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.2所示。根據(jù)cDNA序列推導(dǎo)出Lectin-ccm3氨基酸序列，共432個(gè)氨基酸殘基，分子量48.17kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為7.88，不穩(wěn)定系數(shù)為32.26，脂肪族系數(shù)為79.00，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.1所示。

將蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與來(lái)源于布氏蟲(chóng)草(Cordyceps brongniartii)凝集素蛋白的相似性達(dá)到84.79％，與來(lái)自于球孢白僵菌(Beauveria bassiana)凝集素蛋白的相似性為85.19％，與來(lái)自于綠僵菌(Metarhizium brunneum)凝集素蛋白的相似性為51.49％。如圖1所示。由此可見(jiàn)，蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3與真菌凝集素蛋白家族在蛋白水平上存在較高的同源性，是一種新的真菌凝集素蛋白。

實(shí)施例2

蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3基因的擴(kuò)增與表達(dá)

以蛹蟲(chóng)草mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以上述cDNA為模板擴(kuò)增出凝集素基因Lectin-ccm3，經(jīng)EcoRI酶切，純化后用連接酶(T4ligase)連接到以經(jīng)EcoRI消化的pET32a載體上，表達(dá)載體pET-Lectin-ccm3轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21。挑取單克隆，LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日，菌種以1：50擴(kuò)大培養(yǎng)200mL，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.4-0.6，加入0.2mM的IPTG，16℃誘導(dǎo)表達(dá)12h。

實(shí)施例3

重組蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3的提取

8000rpm、4℃離心5min，收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌株，加1mL破碎液重懸，用液氮速凍后進(jìn)行研磨。12000rpm、4℃離心15min，收集上清和沉淀。SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。目的蛋白Lectin-ccm3以可溶性蛋白形式存在，經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器除菌后-20℃保存。

實(shí)施例4

重組蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3抑制金黃色葡萄球菌增殖試驗(yàn)

固體LB培養(yǎng)基融化后，待溫度降至50℃時(shí)，以1％的接種量加入過(guò)夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液，混勻后立即倒平板，待平板凝固后在表面滴加2ul上述粗蛋白提取液，以空載體表達(dá)產(chǎn)物作為陰性對(duì)照，用氨芐作為陽(yáng)性對(duì)照。將平板置于37℃培養(yǎng)10小時(shí)，觀察結(jié)果。

如圖4所示，純化蛋白對(duì)金黃色葡糖球菌有抑制作用。

實(shí)施例5

重組蛹蟲(chóng)草凝集素蛋白Lectin-ccm3抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖試驗(yàn)

收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5*10⁴個(gè)/mL，加入96孔板，每孔加入100ul。5％CO₂，37℃孵育至細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底，加入上述粗蛋白提取液，每孔加入100ul。5％CO₂，37℃孵育24小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)。每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150ul DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量OD570nm處各孔的吸光值。

如圖5所示，蛋白粗提取液濃度為1.8mg/ml時(shí)，抑制率為17.89％。