一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)生組成型和抗葡萄糖代謝阻遏的堿性β-甘露聚糖酶的嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2，同時涉及嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2的分離篩選方法，還涉及該菌株在苧麻脫膠中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

苧麻是一種蕁麻科植物，其中纖維含量在60％以上，僅次于棉花。它的韌皮纖維長而結(jié)實(shí)，可以代替棉花、亞麻生產(chǎn)各種產(chǎn)品，因此是一種重要的紡織工業(yè)原料。然而苧麻纖維上粘附著大量的膠質(zhì)，主要是果膠、半纖維素、木質(zhì)素等，根據(jù)苧麻品種的不同，其含量可達(dá)24～45％。所以要得到工業(yè)上可利用的纖維，首先必須進(jìn)行脫膠處理。從工業(yè)應(yīng)用的目的看，隨著膠質(zhì)含量的減少，苧麻纖維的物理、化學(xué)性能均得到改善。苧麻脫膠效果的好壞，將直接影響紗制產(chǎn)品的質(zhì)量。

目前本領(lǐng)域中常采用的脫膠方法為化學(xué)燒堿高壓煮煉法。該方法耗用大量的酸堿，隨著酸堿原料大幅度漲價，導(dǎo)致成本成倍上漲；同時，化學(xué)法脫膠產(chǎn)生的大量酸堿廢水，可造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。為此，本領(lǐng)域的許多研究人員一直努力尋找苧麻脫膠的新手段，特別是將注意力集中在生物脫膠上。

苧麻生物脫膠主要是利用微生物產(chǎn)生的高度特異性果膠酶、半纖維素酶類水解果膠、半纖維素類物質(zhì)，以達(dá)到脫膠的目的。生物脫膠法減掉了大量的酸堿原料，因而與化學(xué)法相比，具有處理條件溫和(常壓、常溫)，成本低，纖維質(zhì)量好，對環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。目前主要用于苧麻脫膠的微生物為真菌和中性細(xì)菌。1958年，Mchammad(Appl.Microb.6：87，1958)和Betrabet(Ibid，6，89，1958)分別報導(dǎo)了多粘芽孢桿菌和假單胞菌的浸解活性。藤重升永進(jìn)而公開了一種利用微生物進(jìn)行苧麻脫膠的方法(日本專利，特開昭51—149976)。真菌產(chǎn)生的脫膠酶中，多含有纖維素酶，并且最適作用pH多為酸性，而酸性pH條件則造成纖維強(qiáng)度的下降。另外真菌的生長速度慢，也導(dǎo)致脫膠周期長(一般為5～7天)。而中性細(xì)菌則容易污染雜菌，造成酶活力下降，脫膠效果不穩(wěn)定。因此目前尚難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)上實(shí)際應(yīng)用的目的。目前用于苧麻生物脫膠技術(shù)的菌株均為真菌和細(xì)菌。

中國專利CN85104285，CN85104284中公開了使用中性芽孢桿菌屬的微生物，利用其產(chǎn)生果膠酶的能力進(jìn)行生物脫膠的方法。中國專利CN89104529公開了利用芽孢桿菌進(jìn)行苧麻生物脫膠的方法。但這些專利沒有說明所說的芽孢桿菌屬的種名及篩選方法，也沒有按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定保藏篩選到的微生物樣品，致使本領(lǐng)域技術(shù)人員不可能再現(xiàn)其發(fā)明。

從目前來看，許多生物脫膠法還無法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，主要是酶活力太低，酶脫膠后的原麻還含有較多的膠質(zhì)，其作用也僅僅相當(dāng)于化學(xué)脫膠的預(yù)處理工藝的效果(俞春華，馮新星，賈長蘭等.苧麻纖維高溫—酶聯(lián)合脫膠技術(shù)[J].紡織學(xué)報，2007，28(6)：79-82.蔡俠，熊和平，嚴(yán)理等，苧麻微生物—蒸汽爆破聯(lián)合脫膠技術(shù)[J].紡織學(xué)報，2011，32(7)：75-79.)。

本發(fā)明利用誘變育種的方法，篩選出一株雙突變的高產(chǎn)組成型和抗葡萄糖代謝阻遏的堿性β-甘露聚糖酶嗜堿芽孢桿菌菌株，應(yīng)用于苧麻纖維的脫膠試驗中，取得了更好的效果；此嗜堿芽孢桿菌的出發(fā)菌株具有產(chǎn)生堿性β-堿性甘露聚糖酶的能力，但是其產(chǎn)生的β-堿性甘露聚糖酶屬于誘導(dǎo)酶，該酶的產(chǎn)生取決于誘導(dǎo)物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的存在；并且該酶還受葡萄糖的代謝阻遏，即當(dāng)環(huán)境中存在葡萄糖時，即使同時存在有該酶的誘導(dǎo)物或底物的結(jié)構(gòu)類似物，該酶也不會被誘導(dǎo)產(chǎn)生；本發(fā)明利用化學(xué)試劑亞硝基胍誘變，篩選利福平抗性突變株，及交替培養(yǎng)的方法，篩選出一株突變株NTT33C6D2，其特征是堿性β-甘露聚糖酶同時解除了對誘導(dǎo)物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的依賴和葡萄糖對其的代謝阻遏作用，即不存在誘導(dǎo)物或底物的結(jié)構(gòu)類似物，并且有葡萄糖存在時，該突變株仍然可以高產(chǎn)率地產(chǎn)生β-堿性甘露聚糖酶；利用此突變菌株進(jìn)行生物脫膠，可以大大縮短了菌株發(fā)酵周期和生物脫膠周期，提高膠質(zhì)去除率；本發(fā)明提供的技術(shù)具有脫膠周期短，比此前本發(fā)明人的專利(申請?zhí)枺篊N97.109044)縮短脫膠周期1倍以上，脫膠效率高，菌種不易被污染，酶活力穩(wěn)定，處理成本低，纖維質(zhì)量好，污水處理極為容易等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供了一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2，該菌株具有產(chǎn)生組成型和抗葡萄糖代謝阻遏的堿性β-甘露聚糖酶的能力，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和發(fā)酵條件下，可高產(chǎn)率產(chǎn)生堿性β-甘露聚糖酶。

本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2的分離篩選方法，以篩選到的嗜堿芽孢桿菌NTT33為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變、初篩、復(fù)篩及交替培養(yǎng)篩選到一株雙突變的高產(chǎn)菌株NTT33C6D2。

本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2在苧麻脫膠中的應(yīng)用，顯著縮短了發(fā)酵周期和生物脫膠周期，提高了膠質(zhì)組分去除率，提高了設(shè)備的利用率。

本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2在苧麻生產(chǎn)中的應(yīng)用，通過該菌株先對苧麻進(jìn)行生物脫膠，并結(jié)合本發(fā)明提供的化學(xué)補(bǔ)充脫膠方法，再按照常規(guī)處理方法可得到符合國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的精苧麻。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2的分離篩選方法，其步驟是：

1、樣品采集：將土壤樣品1g懸于無菌水中，混合均勻，上清液接入葡萄糖固體分離培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24-48小時；葡萄糖培養(yǎng)基成分為：葡萄糖10g；蛋白胨5g；酵母膏5g；K₂HPO₄ 1g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；瓊脂18g；水1000mL；用Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH 10-11。

2、分離純化：挑選分離培養(yǎng)基中單菌落轉(zhuǎn)入槐豆膠固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，選擇菌落周圍產(chǎn)生透明圈的菌株；將這些菌株在液體槐豆膠培養(yǎng)基中，28℃，振蕩培養(yǎng)24-48小時后，測定甘露聚糖酶活性；槐豆膠培養(yǎng)基成分為槐豆膠10g；酵母膏5g；蛋白胨5g；K₂HPO₄1g；MgSO₄·7H₂O 0.1g；水1000mL；用Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH10-11；如是固體培養(yǎng)基，另加入瓊脂18g。

3、菌株鑒定：該菌種的菌體呈桿狀，外形大小為0.5～0.65×2.6～3.4μm，美藍(lán)染色均勻，有運(yùn)動力，鞭毛側(cè)生，內(nèi)生孢子呈橢圓形，孢子囊稍大，好氧；過氧化氫酶陽性，菌落呈圓形，表面光滑，有同心圓，生長于葡萄糖培養(yǎng)基中檢查不出酸的產(chǎn)生，該菌株分解淀粉，但不還原硝酸鹽。特別是該菌株在pH10-11的培養(yǎng)基中生長良好?；谶@些菌學(xué)特征和理化性質(zhì)，參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,9th Edition,the Williams&Wilkins Company,Baltimore,1992)，本發(fā)明人將該菌株確定為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)NTT33。

4、誘變：將嗜堿芽孢桿菌NTT33菌株接種至葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩，180rpm，培養(yǎng)24-48小時；將活化好的出發(fā)菌株NTT33涂布于平皿上，取約1mg的亞硝基胍(Nitrosoguanidine)點(diǎn)在平皿一側(cè)，于37℃培養(yǎng)24-48小時，待平皿上生長出菌苔。

5、初篩：在亞硝基胍顆粒產(chǎn)生的抑菌圈周圍挑取菌苔，接種于上述葡萄糖液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24-48小時后，再于含有利福平(30μg/mL)槐豆膠平皿上涂布，37℃培養(yǎng)24小時后，獲得利福平抗性單菌落。

6、復(fù)篩：對獲得的利福平抗性單菌落突變株進(jìn)行復(fù)篩，其方法是挑取含利福平的初篩槐豆膠平皿上周圍產(chǎn)生透明圈的單菌落，分別接種在槐豆膠液體培養(yǎng)基、槐豆膠液體培養(yǎng)基+葡萄糖培養(yǎng)基和葡萄糖液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，不同時間(每隔4h)取樣，離心，提取上清液為粗酶液，按Akino(Agr.Biol.Chem.,52:773-779，1988)的方法測定甘露聚糖酶活性；3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲取的粗酶液均測到甘露聚糖酶活性者，為產(chǎn)組生成型和抗葡萄糖代謝阻遏的堿性β-甘露聚糖酶的突變株；本發(fā)明將該突變株記為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)NTT33C6D。

7、交替培養(yǎng)篩選雙突變高產(chǎn)菌株：將NTT33C6D進(jìn)行交替培養(yǎng)，其方法是在槐豆膠培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基中交替培養(yǎng)6-10次，以富集組成型突變菌株；然后涂布葡萄糖平皿，挑取單菌落，分別接種在槐豆膠培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基和槐豆膠+葡萄糖混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)；不同時間取樣，離心(8000rpm×10分鐘)提取粗酶液，按Akino(Agr.Biol.Chem.,52:773-779,1988)的方法測定甘露聚糖酶活性；在3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲取的粗酶液測定甘露聚糖酶的產(chǎn)酶進(jìn)程曲線，篩選出產(chǎn)生組成型和抗葡萄糖代謝阻遏的堿性β-甘露聚糖酶的雙突變株嗜堿芽孢桿NTT33C6D2(圖1)；由圖2可知，NTT33C6D2菌株在葡萄糖培養(yǎng)基中酶活力峰值(9180U)出現(xiàn)在22h，而在槐豆膠培養(yǎng)基中出現(xiàn)兩個峰值12h為6510U，24h為9010U，混合培養(yǎng)基中與NTT33C6D酶活力峰值無太大區(qū)別；NTT33C6D2與NTT33C6D相比，在葡萄糖培養(yǎng)基酶活力高了2.56倍，在槐豆膠培養(yǎng)基中酶活力提高了1.64倍。

分離篩選得到一種雙突變的嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2，于2016年6月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO.M2016317。

該嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2的菌體呈桿狀，外形大小為0.5～0.65×2.6～3.4μm，染色均勻，有運(yùn)動力，鞭毛側(cè)生，內(nèi)生孢子呈橢圓形，孢子囊稍大；好氧型，過氧化氫酶呈陽性；菌落呈圓形，表面光滑，有同心圓；生長于葡萄糖培養(yǎng)基上時，對葡萄糖的作用緩慢，并且在培養(yǎng)基中檢查不出酸的產(chǎn)生；該菌株分解淀粉，但不還原硝酸鹽；該菌株產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶，經(jīng)純化后分析，分子量為38900Da，等電點(diǎn)PI為3.0，酶反應(yīng)最適pH為9.0～10.0，最適反應(yīng)溫度為80℃，穩(wěn)定溫度為60℃左右，金屬離子中Cu²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺、Al²⁺、Co²⁺對該酶有一定的激活作用，而Ag⁺、Hg²⁺、Mn²⁺對該酶有明顯的抑制作用；該酶水解槐豆膠后產(chǎn)生葡萄糖、甘露糖以及低聚糖。

一株嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2在苧麻脫膠和苧麻生產(chǎn)中的應(yīng)用，其步驟是：

1、將突變株NTT33C6D2于槐豆膠液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20-24小時活化；然后轉(zhuǎn)入含有苧麻的培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6-8小時；

2、脫膠后分散如棉花狀的苧麻水洗后，在含0.3-0.6％質(zhì)量濃度的NaOH、0.1％質(zhì)量濃度的三聚磷酸鈉溶液中，0.2Mpa，煮煉1-2小時；

3、按化學(xué)脫膠的一般處理方法(歐陽曙，姚綱，苧麻化學(xué)脫膠新技術(shù)的評述與應(yīng)用[J].苧麻紡織科技,1993,16(1):30-32.)進(jìn)行水洗、打麻、漂白(有效氯0.5-0.8g/L)、水洗、酸洗(pH2.5)、水洗、甩干、給油后，甩干、干燥，得到精干麻。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

1、該菌株的優(yōu)良特性及產(chǎn)酶優(yōu)點(diǎn)：

該突變株將對降解膠質(zhì)成分中含量最高的甘露聚糖的β-甘露聚糖酶由誘導(dǎo)型和受葡萄糖代謝阻遏性質(zhì)，轉(zhuǎn)變成組成型和抗葡萄糖代謝阻遏的酶，并提高了酶活力，導(dǎo)致其菌種發(fā)酵生產(chǎn)周期由原來的36-48小時，縮短至20-24小時，縮短發(fā)酵周期50％以上；在苧麻生物脫膠應(yīng)用中，也顯著縮短了生物脫膠周期，由原來的脫膠周期16小時，縮短至6-8小時；同時提高了膠質(zhì)組分去除率；這些性質(zhì)都起到了提高設(shè)備的利用率巨大優(yōu)勢(曹軍衛(wèi)、陳漱涢，鄭連爽，專利CN97109044)。

2、與現(xiàn)有的生物脫膠技術(shù)相比，該菌株在生物脫膠中的優(yōu)點(diǎn)：

1)國內(nèi)外首創(chuàng)采用嗜堿芽孢桿菌組成型和抗葡萄糖代謝阻遏雙突變株進(jìn)行苧麻生物脫膠研究，生產(chǎn)穩(wěn)定性極高，采用嗜堿細(xì)菌進(jìn)行脫膠可以保護(hù)好麻纖維在整個脫膠過程中不受破壞，并且由于脫膠堿性環(huán)境的存在，降低了其它雜菌污染的可能，使菌種可以的長期穩(wěn)定地用于大規(guī)模生產(chǎn)。

2)其他生物脫膠技術(shù)對原麻刮質(zhì)有必須極優(yōu)的要求，麻皮、麻殼等雜質(zhì)對生物脫膠有極為不利的影響；而本發(fā)明得到的突變株用于生物脫膠，適用于市場上所有品種和品質(zhì)等級的原麻。

3)微生物生長所需碳源完全來自原麻膠質(zhì)，不需添加任何營養(yǎng)有機(jī)物，僅輔以少量無機(jī)鹽，克服了培養(yǎng)細(xì)菌還需使用的大量有機(jī)原料(如黃豆粉、玉米淀粉、白糖等)，同時也避免了這些有機(jī)物沒完全降解被排放所帶來的“二次污染”。

4)脫膠菌種可反復(fù)使用10次以上，大大減低了菌種生產(chǎn)成本。

3、與現(xiàn)有的化學(xué)脫膠技術(shù)相比，該菌株在脫膠中的優(yōu)點(diǎn)：

1)比化學(xué)脫膠降低60％以上的化工原料消耗；

2)比化學(xué)脫膠技術(shù)節(jié)水40％以上；

3)需處理的廢水量比化學(xué)脫膠減少90％，廢水處理后COD_Cr濃度可達(dá)到國家1級許可排放標(biāo)準(zhǔn)。

4、利用本發(fā)明提供的脫膠方法在大大縮短菌種發(fā)酵周期和生物脫膠周期的基礎(chǔ)上，制得的精干麻仍然可以達(dá)到以下國家一級指標(biāo)：殘膠率＜2.0％，硬條率＜1％，束纖維強(qiáng)度＞5.5cN/dtex，回潮率8.6％，伸長率6-9％；外觀質(zhì)量：脫膠均勻，纖維松散。柔軟，富有光澤，硬條、硬塊、夾生少。

附圖說明

圖1為一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2的顯微照片圖。

圖2為一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶進(jìn)程曲線圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2的分離篩選方法，其步驟是：

1)樣品采集

從中國內(nèi)蒙古自治區(qū)哲里木盟地區(qū)進(jìn)行土壤取樣，將土壤樣品1g懸于無菌水中，混合均勻，上清液接入葡萄糖培養(yǎng)基中，其成分為：葡萄糖10g；蛋白胨5g；酵母膏5g；K₂HPO₄1g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；瓊脂18g；水1000mL；用Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH10-11；28℃培養(yǎng)24-48小時。

2)分離及純化

挑選上述培養(yǎng)基中單菌落轉(zhuǎn)入槐豆膠固體培養(yǎng)基中，其成分為：槐豆膠10g，酵母膏5g，蛋白胨5g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，瓊脂18g，水1000mL，用Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH10-11；28℃培養(yǎng)24-36小時，選擇菌落周圍產(chǎn)生透明圈的菌株；將這些菌株在槐豆膠液體培養(yǎng)基(除不加瓊脂外，其余成分與槐豆膠固體培養(yǎng)基相同)中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)24-48小時后，測定甘露聚糖酶活性(Akino，Agr.Biol.Chem.,52:773-779,1988)。

3)菌株鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，該菌體呈桿狀，外形大小為0.5～0.65×2.6～3.4μm，美藍(lán)染色均勻，有運(yùn)動力，鞭毛側(cè)生，內(nèi)生孢子呈橢圓形，孢子囊稍大。

經(jīng)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該菌株好氧，過氧化氫酶為陽性；菌落呈圓形，表面光滑，有同心圓；生長于葡萄糖培養(yǎng)基中檢查不出酸的產(chǎn)生；該菌株分解淀粉，但不還原硝酸鹽；在pH10-11的培養(yǎng)基中生長良好。

該菌株產(chǎn)生的組成型和抗葡萄糖代謝阻遏的β-甘露聚糖酶，經(jīng)純化后分析，分子量為38900Da，等電點(diǎn)PI為3.0，酶反應(yīng)最適pH為10.0～11.0，最適反應(yīng)溫度為80℃，穩(wěn)定溫度為60℃左右，金屬離子中Cu²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺、Al²⁺、Co²⁺對該酶有一定的激活作用，而Ag⁺、Hg²⁺、Mn²⁺對該酶有明顯的抑制作用，該酶水解魔芋粉后產(chǎn)生葡萄糖、甘露糖以及低聚糖。

基于上述菌學(xué)特征和理化性質(zhì)，并參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,9th Edition,the Williams&Wilkins Company,Baltimore,1992)，本發(fā)明人將該菌株確定為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)NTT33。

4)誘變

葡萄糖液體培養(yǎng)基作為活化培養(yǎng)基，葡萄糖液體培養(yǎng)基的成分為每升含有葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，用Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH至10-11，滅菌；將嗜堿芽孢桿菌NTT33菌株接種至上述葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩，180rpm，培養(yǎng)24-48小時活化；將活化好的出發(fā)菌株NTT33涂布于平皿上，取約1mg的亞硝基胍(Nitrosoguanidine)點(diǎn)在平皿一側(cè)，于37℃培養(yǎng)24-48小時，待平皿上生長出菌苔。

5)突變株的初篩

利福平是一類作用于核酸轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的抗生素，用利福平做為突變株初篩的標(biāo)記，是由于抗利福平突變，往往會伴有其他基因突變產(chǎn)生，因此可以用此抗性突變做為基因突變的遺傳標(biāo)記，有利于提高突變株篩選的選擇性。

在亞硝基胍顆粒產(chǎn)生的抑菌圈周圍挑取菌苔，接種于上述葡萄糖液體培養(yǎng)基，37℃，180rpm震蕩培養(yǎng)24-48小時后，再于含有利福平的槐豆膠培養(yǎng)基平皿上涂布，37℃培養(yǎng)24小時后，獲得利福平抗性單菌落；含有利福平的槐豆膠平板培養(yǎng)基成分為每升含有槐豆膠5g，酵母膏1g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，瓊脂粉1.2～1.5g，并用Na₂CO₃調(diào)pH至10-11，滅菌后，加入利福平至終濃度30μg/mL，倒平皿。

6)突變株的復(fù)篩

對獲得的單菌落突變株進(jìn)行復(fù)篩的方法是挑取含有利福平的槐豆膠平皿上產(chǎn)生透明圈周圍的單菌落，分別接種在槐豆膠液體培養(yǎng)基、槐豆膠+葡萄糖液體培養(yǎng)基和葡萄糖液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)，不同時間(每隔4小時)取樣，離心(8000rpmX10分鐘)提取上清液為粗酶液，按Akino(Agr.Biol.Chem.,52:773-779，1988)的方法測定甘露聚糖酶活性；槐豆膠+葡萄糖液體培養(yǎng)基成分為每升含有槐豆膠5g，葡萄糖5g，酵母膏1g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，并用Na₂CO₃調(diào)pH至10-11；在3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲取的粗酶液均檢測到甘露聚糖酶活性者，為產(chǎn)生組成型和抗葡萄糖代謝阻遏甘露聚糖酶的突變株；本發(fā)明將該突變株記為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)NTT33C6D。

7)交替培養(yǎng)篩選雙突變高產(chǎn)菌株

將NTT33C6D進(jìn)行交替培養(yǎng)，其方法是首先接種在槐豆膠液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)20小時左右，再轉(zhuǎn)接至葡萄糖液體培養(yǎng)基中，180rpm振蕩培養(yǎng)20小時左右，如此在槐豆膠培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基中交替培養(yǎng)6-10次，以富集組成型突變菌株；然后涂布葡萄糖平皿，挑取單菌落，分別接種在槐豆膠培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基和槐豆膠+葡萄糖混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)；每隔4小時取樣，離心(8000rpm×10分鐘)提取粗酶液，按Akino(Agr.Biol.Chem.,52:773-779,1988)的方法測定甘露聚糖酶活性；一個酶活力單位定義為在本實(shí)驗條件下，每分鐘釋放1μg甘露糖的量，計算公式為：

U＝y(tǒng)×n×1/10

式中：U—酶活力單位；

y—還原糖的微克數(shù)；

n—酶液稀釋倍數(shù)；

10—反應(yīng)時間為10min。

根據(jù)上述方法測得的數(shù)據(jù)，以時間為橫坐標(biāo)，以酶活力為縱坐標(biāo)，繪制產(chǎn)酶進(jìn)程曲線；通過在3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲取的粗酶液測定甘露聚糖酶的產(chǎn)酶進(jìn)程曲線，在多個菌株中篩選出一株高產(chǎn)組成型和抗葡萄糖代謝阻遏甘露聚糖酶的雙突變株嗜堿芽孢桿NTT33C6D2(圖1)；由圖2可知，NTT33C6D2菌株在槐豆膠培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h時，最高酶活力為811.02U；在葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)22h時，最高酶活力可達(dá)到826.5U。混合培養(yǎng)基中與NTT33C6D酶活力峰值無太大區(qū)別；NTT33C6D2與NTT33C6D相比，在葡萄糖培養(yǎng)基酶活力高了2.56倍，在槐豆膠培養(yǎng)基中酶活力提高了1.64倍；與專利CN97109044比較，此菌株解除了對底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的依賴，并且不再受到葡萄糖或內(nèi)源產(chǎn)生的其他單糖(如甘露糖)的分解代謝阻遏，使產(chǎn)酶高峰明顯提前，而有助于縮短生物脫膠周期。

實(shí)施例2：

一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2在苧麻生產(chǎn)中的應(yīng)用，其步驟是：

1)將突變株NTT33C6D2于槐豆膠液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20-24小時活化；然后轉(zhuǎn)入含有苧麻的培養(yǎng)基中，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)，不同時間(每隔4小時)取樣觀察其纖維分散情況，并測定殘膠率(表1)，測定分析方法如中華人民共和國《苧麻化學(xué)成分定量分析方法》(GB5889-86)；含有苧麻的培養(yǎng)基成分為苧麻10g，(NH₄)₂SO₄ 1.5g，K₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，水150mL，用Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH至10-11，滅菌后接種。

表1苧麻生物脫膠殘膠率測定

2)該突變株用于去除麻皮苧麻的生物脫膠，6-8小時脫膠率達(dá)65％以上，用于未去除麻皮的苧麻生物脫膠6-8小時脫膠率達(dá)80％以上。生物脫膠殘膠率在11～14％之間，均對后續(xù)處理無太大影響，故生物脫膠周期定為6-8小時。

實(shí)施例3

一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6D2在苧麻生產(chǎn)中的應(yīng)用及效果評估，其步驟是：

1)按照實(shí)施例2中步驟1)所述方法對苧麻進(jìn)行生物脫膠6-8小時；

2)脫膠后分散如棉花狀的苧麻水洗1次后，在含0.3-0.5％質(zhì)量濃度的NaOH、0.1％質(zhì)量濃度的三聚磷酸鈉溶液中，0.2Mpa，煮煉1-2小時；

3)按化學(xué)脫膠的一般處理方法(歐陽曙，姚綱，苧麻化學(xué)脫膠新技術(shù)的評述與應(yīng)用[J].苧麻紡織科技,1993,16(1):30-32.)進(jìn)行水洗、打麻、漂白(有效氯0.5-0.8g/L)、水洗、酸洗(pH2.5)、水洗、甩干、給油后，甩干、干燥，得到精干麻，獲得的精干麻達(dá)到如表2所示的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，測定分析方法如中華人民共和國《苧麻化學(xué)成分定量分析方法》(GB5889-86)。

表2苧麻精干麻質(zhì)量分析

4)對步驟2)中的脫膠廢液進(jìn)行化學(xué)耗氧量(COD_Cr)測定(國家環(huán)保局，水和廢水監(jiān)測分析方法編委會水和廢水監(jiān)測分析方法[M].北京：中國環(huán)境出版社，1989.)，結(jié)果表明COD_Cr約為5000mg/mL；雖然廢液的COD_Cr值較高，但主要是含有高濃度菌體蛋白的污水，屬于極容易利用生物法處理的污水。

5)采用本發(fā)明生物脫膠工藝，經(jīng)濟(jì)效益明顯，比化學(xué)脫膠降低60％以上的化工原料消耗；比化學(xué)脫膠技術(shù)節(jié)水40％以上；需處理的廢水量比化學(xué)脫膠減少90％，廢水處理后COD_Cr濃度可達(dá)到國家1級許可排放標(biāo)準(zhǔn)。

本技術(shù)可在全國麻紡脫膠行業(yè)范圍內(nèi)推廣，除用于苧麻脫膠行業(yè)，還在黃麻、劍麻、羅布麻、竹原纖維等的生物脫膠實(shí)驗中取得了顯著效果。