本發(fā)明涉及動物分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體來說，涉及一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的大片段的獲得與缺失(PAV)分子標(biāo)記及其應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
：長期以來，豬是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的畜種，豬品種基因組遺傳水平的變異，導(dǎo)致豬種的生活習(xí)性、生長發(fā)育以及繁殖性能有著較大的差異。檢測不同個體豬基因組的遺傳變異是研究遺傳變異與表型關(guān)系的基礎(chǔ)?；蚪M的遺傳變異可以分為序列變異和結(jié)構(gòu)變異兩種類型。基因組中結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于核苷酸序列變異數(shù)量，結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量在十萬數(shù)量級，而SNP的數(shù)目一般在百萬數(shù)量級以上，但結(jié)構(gòu)變異影響到的基因組序列的總長度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于SNP。因此結(jié)構(gòu)變異對基因組和動物性狀影響的權(quán)重可能更大?；蚪M結(jié)構(gòu)變異指基因組中獲得與缺失變異和拷貝數(shù)變異，包括核苷酸序列的缺失、插入、復(fù)制、倒位和易位等。獲得與缺失變異(PAV，presence/absencevariants)是一種重要的遺傳變異形式，通過缺失或插入一個片段引起基因組結(jié)構(gòu)上的變化，直接影響到基因組的大小和基因的數(shù)目，其突變頻率與分布特征對于解釋物種表型差異具有重要的意義。在人類的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多與結(jié)構(gòu)變異有關(guān)的疾病和生理特性，如自閉癥、精神分裂癥、母親生殖能力等。發(fā)生結(jié)構(gòu)變異有助于提高生物個體的適應(yīng)性，促進物種的形成。我們前期運用二代測序技術(shù)，從香豬高產(chǎn)群和低產(chǎn)群中選取2頭作為代表，進行全基因組結(jié)構(gòu)變異檢測，發(fā)現(xiàn)了一個長98675bp的結(jié)構(gòu)變異PAV3在香豬群體中的分布頻率有明顯的不同，PAV3結(jié)構(gòu)變異區(qū)內(nèi)含有細(xì)胞周期末期促進復(fù)合物1(anaphasepromotingcomplexsubunit1,APC1)基因。APC1是細(xì)胞周期末期復(fù)合物(APC)最大的亞基，在整個細(xì)胞周期中持續(xù)表達，在細(xì)胞周期的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用。在擬南芥中APC1協(xié)同APC4在雌性配子的形成和胚胎發(fā)生中起重要的作用。因此建立本發(fā)明所描述的一種檢測香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的結(jié)構(gòu)變異PAV3的方法，以期為實施香豬分子輔助育種提供技術(shù)支持。大于30kb的基因組片段通過常規(guī)的PCR方法常不能擴增出目的條帶，因此，我們在缺失片段的外圍設(shè)計了一對引物RP，當(dāng)基因組中的這段區(qū)域缺失時，可以擴增出一個較小的目的條帶。利用Pairwise-PCR的原理，在lsPAVs的邊緣序列50～3000bp之間設(shè)計引物對RP，這對引物跨越整個lsPAVs區(qū)域，如果基因組中這段區(qū)域存在，將不能擴增出目的條帶，若這段區(qū)域缺失，可能擴增出6000bp以內(nèi)的片段。同時，在lsPAVs區(qū)域內(nèi)部設(shè)計另一對特異引物RD，如果大片段缺失用這對引物對RD將不能擴增出目的條帶，反之能擴增出目的條帶。通過兩對引物對RP和RD建立了本發(fā)明所描述的一種檢測與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的結(jié)構(gòu)變異PAV3的方法，以深入了解PAVs遺傳變異對豬基因組的影響，為PAVs與經(jīng)濟性狀和表型變化之間的關(guān)聯(lián)研究奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的PAV3標(biāo)記及其應(yīng)用。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的PAV3標(biāo)記，是指豬基因組中候選區(qū)域chr3：46248125-46346800的結(jié)構(gòu)變異，該區(qū)域結(jié)構(gòu)變異缺失98675bp，或不缺失。本發(fā)明提供用于檢測與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的PAV3標(biāo)記的引物對，所述RP引物對為正向引物RPF：CTGCACCTCACACAGCGACT，反向引物RPR：GCAGCACAGCCCTTGAACAG。RD引物對中的正向引物RDF：GTTCCCTGACCCCACTGACTG，反向引物RDR:CCTAGGCTGTCTGTGGTTGTTAG。本發(fā)明提供用于PCR檢測前述與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的PAV3標(biāo)記的試劑盒。所述試劑盒包含上述引物RPF、RPR和RDF、RDR。所述試劑盒還包括10×PCRMix、去離子水，陽性和陰性對照。本發(fā)明還提供所述PAV3標(biāo)記在鑒定豬品種產(chǎn)仔數(shù)中的應(yīng)用。所述檢測方法包括以下步驟：(1)提取香豬的基因組DNA；(2)以上述香豬基因組DNA為模板，利用所述引物RPF、RPR和RDF、RDR，進行PCR擴增，檢測豬基因組中PAV3的基因型；(3)根據(jù)上述檢測結(jié)果，如果目的片斷純合缺失，則待測豬有產(chǎn)仔數(shù)較高的可能性；如果此片斷不缺失，則待測個體有低產(chǎn)仔數(shù)傾向。步驟(2)中進行PCR所用的擴增體系以20μL為例：2×PCRMix10.00μLF-primer(0.10μg/μL)0.20μLR-primer(0.10μg/μL)0.20μLgDNA1.00μLddH2O8.60μLTotalVolume20.00μLPCR反應(yīng)條件為：本發(fā)明進一步提供所述PAV3標(biāo)記在香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的應(yīng)用。所述的應(yīng)用包括以下步驟：(1)個體PAV3基因型檢測以本發(fā)明所述的結(jié)構(gòu)變異PAV3(chr3：46248125-46346800)為候選位點，采用PCR技術(shù)檢測個體的PAV3基因型。(2)根據(jù)結(jié)構(gòu)變異PAV3進行有高產(chǎn)仔數(shù)優(yōu)勢種豬的選育依據(jù)本發(fā)明所述的判斷依據(jù)，當(dāng)待測個體基因組中結(jié)構(gòu)變異PAV3為缺失類型時，待測豬屬于產(chǎn)仔數(shù)較高的優(yōu)勢個體。結(jié)構(gòu)變異PAV3的檢測，可為香豬產(chǎn)仔數(shù)的分子調(diào)控機理研究和標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的實施提供技術(shù)基礎(chǔ)。本發(fā)明的有益效果：(一)本發(fā)明提供的分子遺傳標(biāo)記不受豬的年齡、性別、生活習(xí)性和環(huán)境等因素的限制，可用于個體的早期選擇，從而提高香豬養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益。(二)本發(fā)明所述的檢測大片段獲得與缺失變異的方法準(zhǔn)確可靠，操作簡便，檢測所需的條件普通實驗室可以滿足。(三)本發(fā)明可作為分子標(biāo)記用于香豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的輔助選擇。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1中瓊脂糖凝膠電泳檢測PAV3基因型的結(jié)果，M：DL2000DNAMarker；1-2：DD型；3-4：AA型；圖2為本發(fā)明實施例1中Sanger測序的比對分析結(jié)果，細(xì)線代表缺失片段98675bp。具體實施方式以下實例對本發(fā)明做進一步的解釋，但不限定本發(fā)明的范圍，若無特別指明，實施例中所用的技術(shù)方法和條件均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)方法和常規(guī)實驗條件，或按照相關(guān)試劑廠商說明書建議的方法和條件。實施例1為本發(fā)明的檢測方法，步驟如下：1.豬耳組織基因組DNA的提取本方法采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(Cat.#DP304)，從豬耳組織中提取基因組DNA，具體方法如下：1)取小于50mg的耳組織置于2μL的離心管中，用手術(shù)剪充分剪碎；2)加入200μL緩沖液GA及20μL蛋白酶K，漩渦混勻，56℃消化2-4小時(每隔0.5小時混勻一次)至組織塊消化完全；3)加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃消化10min；4)加入200μL無水乙醇，漩渦混勻；5)將消化液倒入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；6)向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；8)重復(fù)操作步驟7)；9)將吸附柱CB3放回收集管中12000rpm空離心2min，棄廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液；10)將吸附柱轉(zhuǎn)移到干凈的2mL離心管中，向吸附柱中間部懸空加入50-200μL洗脫液TE，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min；基因組DNA轉(zhuǎn)移到離心管中的TE溶液中，4℃保存?zhèn)溆没?20℃長期保存。11)為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液返回吸附柱CB3中，放置2min，12000rpm離心2min；2.目標(biāo)序列及參考序列的擴增根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫登錄的該區(qū)域的序列設(shè)計引物，所述引物對為：正向引物RPF：CTGCACCTCACACAGCGACT，反向引物RPR：GCAGCACAGCCCTTGAACAG。RD引物為：正向引物RDF：GTTCCCTGACCCCACTGACTG，反向引物RDR:CCTAGGCTGTCTGTGGTTGTTAG。以20μL計PCR反應(yīng)體系為：10×PCRMix10.00μLUp-primer(0.10μg/μL)0.20μLDown-primer(0.10μg/μL)0.20μLgDNA1.00μLddH2O8.60μLTotalVolume20.00μLPCR反應(yīng)條件為：本試劑盒所包含的引物符合PCR擴增要求，擴增效果穩(wěn)定、特異性強，PCR擴增結(jié)果可準(zhǔn)確反應(yīng)基因組中目標(biāo)序列的結(jié)構(gòu)變異類型。3.瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物檢測選用1％的瓊脂糖凝膠。點樣時，用微量加樣器將PCR產(chǎn)物5μL，加入點樣孔中，同時加入3μL的D2000DNAMarker(天根生化科技(北京)有限公司)對參照，設(shè)置電壓為120V，時間為30min。電泳完成后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，并做好圖像的保存。4.Sanger測序為了獲得精確的PAV3的斷點信息，我們通過Sanger測序技術(shù)對擴增片段進行了序列測定，將序列信息與豬參考基因組序列(ref.Sscrofa10.2)進行比對分析，確定基因組中PAV3區(qū)域的精確斷點位置實施例2香豬群體結(jié)構(gòu)變異PAV3的檢測及應(yīng)用按照實施例1所述的方法，以豬基因組區(qū)域結(jié)構(gòu)變異位點(chr3：46248125-46346800)為候選位點，通過PCR技術(shù)檢測PAV3在香豬群體(香豬470頭，其中產(chǎn)仔數(shù)高的個體230頭，產(chǎn)仔數(shù)低的個體240頭)中的結(jié)構(gòu)變異情況。480頭香豬的血樣采自從江縣。應(yīng)用本發(fā)明所述的檢測技術(shù)分析群體中的結(jié)構(gòu)變異PAV3的分布頻率，結(jié)果顯示香豬高低產(chǎn)群體中存在PAV3變異(表1)。香豬基因組結(jié)構(gòu)變異中，基因型DD型的香豬的產(chǎn)仔數(shù)高于基因型AA型的香豬的產(chǎn)仔數(shù)(P<0.05)(表2)。表1香豬群體中候選PAV3位點的基因型頻率和等位基因頻率檢測結(jié)果表2候選PAV3基因型對應(yīng)的產(chǎn)仔數(shù)比較應(yīng)用本發(fā)明建立的檢測技術(shù)可檢測待測個體基因組中結(jié)構(gòu)變異PAV3的基因型，不受香豬的年齡、性別、地理位置和環(huán)境等因素的限制，且操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之做部分修改或改進，這對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的修改或改進，均屬于本發(fā)明要求的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3