本發(fā)明涉及醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗腫瘤活性的不對稱雙取代靛紅席夫堿類化合物及其合成方法。
背景技術(shù)：
席夫堿化合物因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，即核心基團(tuán)含有帶孤對電子的N原子，從而具有很好的配對能力，而該基團(tuán)兩邊均可與各種類型的基團(tuán)反應(yīng)從而得到性質(zhì)不一的衍生物，這使得其在實(shí)際應(yīng)用上極具特色，尤其在化學(xué)、生物學(xué)方面應(yīng)用廣泛。不對稱雙席夫堿，由于其結(jié)構(gòu)的不對稱性，使得擁有很多特殊的用途，如可用作載氧載體、催化劑、殺蟲劑、抑菌劑、生物模擬過程的模擬分子等，近年來此類化合物的合成和性質(zhì)研究也成為化學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)十分活躍的課題。
靛紅及其衍生物具有獨(dú)特的電子特性和優(yōu)越的生物活性，在抗腫瘤、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)等方面的活性有重要意義。靛紅目前可以作為工業(yè)品大量合成，是相對較便宜的原料，其1、2、3位及苯環(huán)上可以發(fā)生多種類型的化學(xué)反應(yīng)，為其衍生物的合成提供了廣闊的空間，因此目前對靛紅及其衍生物的合成和活性的研究非?；钴S。
含O、S、N的席夫堿及其金屬配合物,以其良好的抑菌、抗癌和抗病毒的生物活性一直受到人們的重視。靛紅席夫堿類化合物具有較好的抑菌、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)活性。因此，筆者利用7-N雜靛紅及其衍生物、靛紅及其衍生物和水合肼為原料，設(shè)計(jì)合成了一類結(jié)構(gòu)新穎的不對稱雙取代靛紅席夫堿類化合物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤活性的不對稱雙取代靛紅席夫堿類化合物及其合成方法，由7-N雜靛紅及其衍生物、靛紅及其衍生物和水合肼為原料，在乙醇作為反應(yīng)溶劑的條件下進(jìn)行合成，原料環(huán)保，生產(chǎn)成本低，操作安全性高，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)原料利用充分，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，解決了現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)率低的問題。
一種具有抗腫瘤活性的不對稱雙取代靛紅席夫堿類化合物，其結(jié)構(gòu)式(I)如下所示：
R1、R2、R3、R4可以為氫、硝基、烷氧基、鹵素，取代或未取代的苯基，取代或未取代的低級烷基或環(huán)烷基、低級烷基-環(huán)烷基、環(huán)烷基-低級烷基；
優(yōu)選R1表示下列基團(tuán)：氫、硝基、鹵素，低級烷基或環(huán)烷基，取代或未取代的苯基。
優(yōu)選R2表示下列基團(tuán)：氫、硝基、鹵素，低級烷基或環(huán)烷基。
優(yōu)選R3表示下列基團(tuán)：氫、硝基、烷氧基、鹵素，低級烷基或環(huán)烷基，取代或未取代的苯基。
優(yōu)選R4表示下列基團(tuán)：氫、烷氧基、硝基、鹵素，低級烷基或環(huán)烷基，取代或未取代的苯基。
一種具有抗腫瘤活性的不對稱雙取代靛紅席夫堿類化合物的合成方法，由7-N雜靛紅及其衍生物、靛紅及其衍生物和水合肼為原料，在乙醇作為反應(yīng)溶劑的條件下進(jìn)行合成，合成路線如下所示：
具體的制備過程如下：
1)將適量7-N雜靛紅或其衍生物用有機(jī)溶劑溶解，置于錐形瓶中，磁力攪拌下緩慢滴加到水合肼的有機(jī)溶劑中，加熱到60℃～100℃，反應(yīng)4～8小時(shí)；
2)薄層層析方法跟蹤反應(yīng)至完全，將反應(yīng)體系的混合液趁熱抽濾，用乙醇洗滌，濾液靜置析晶得到中間體；
3)將上述得到的中間體與靛紅或其衍生物按摩爾比1:1～1:2置于反應(yīng)器中，繼續(xù)加熱、攪拌，60℃～100℃下回流反應(yīng)2～6小時(shí)；
4)TCL跟蹤至反應(yīng)完全，停止加熱，撤去冷凝裝置。將反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，然后冷卻至室溫過濾，濾餅用溫水洗滌，得到不對稱雙取代靛紅西佛堿粗品；
5)將不對稱雙取代靛紅西佛堿粗品加入到反應(yīng)器中，加入有機(jī)溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。
所述的步驟1)中的有機(jī)溶劑優(yōu)選甲醇或乙醇，進(jìn)一步優(yōu)選為乙醇。
所述的步驟1)中的7-N雜靛紅或其衍生物與水合肼的摩爾比為1:1～1:2.5，進(jìn)一步優(yōu)選為1:1.5～1:2。
所述的步驟1)中的反應(yīng)時(shí)間為5～6小時(shí)。
所述的步驟1)、步驟3)中的溫度為75℃～85℃。
所述的步驟3)中的中間體與靛紅或其衍生物按摩爾比為1:1～1:1.5。
所述的步驟3)中的反應(yīng)時(shí)間為3～4小時(shí)。
所述的步驟5)的有機(jī)溶劑為乙醇。
結(jié)構(gòu)式(I)部分優(yōu)選實(shí)施方案中的化合物結(jié)構(gòu)式如下所示：
本發(fā)明的有益效果是：
原料環(huán)保，生產(chǎn)成本低，操作安全性高，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)原料利用充分，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，解決了現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)率低的問題。
具體實(shí)施方式：
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，但本發(fā)明不局限于以下實(shí)施。
實(shí)施例1
化合物(1)
(Z)-3-((Z)-(5-chloro-1-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制備。
將適量1.48g(10mmol)7-N雜靛紅用50mL乙醇溶解，置于錐形瓶中，磁力攪拌下緩慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加熱到80℃，反應(yīng)6小時(shí)。薄層層析方法跟蹤反應(yīng)至完全，將反應(yīng)體系的混合液趁熱抽濾，用乙醇洗滌，濾液靜置析晶得到中間體。所得中間體與1.95g(10mmol)5-氯-1-甲基靛紅置于反應(yīng)器中，加入50mL乙醇，繼續(xù)加熱、攪拌，80℃下回流反應(yīng)4小時(shí)。TCL跟蹤至反應(yīng)完全，停止加熱，撤去冷凝裝置。將反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，冷卻至室溫后過濾，濾餅用溫水洗滌，得到不對稱雙取代靛紅西佛堿(1)粗品。將該粗品加入到反應(yīng)器中，加入25mL乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到淡黃色結(jié)晶性粉末(2.65克)，總收率78.3％。
淡黃色結(jié)晶粉末，M.P.182.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),8.0(1H,s),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.91(1H,s,J＝7.5Hz),7.82(1H,d,J＝7.5Hz),7.52(1H,d,J＝7.5Hz),6.88(1H,t,J＝7.5Hz),3.46(3H,s,J＝7.5Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSOd6)δ(ppm):167.2,163.7,161.8,158.8,139.5,138.6,138.2,131.5,130.2,129.5,124.4,119.2,113.6,111.8,30.3；HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:339.0524,found:339.0528.
實(shí)施例2
化合物(2)
(Z)-3-((Z)-(1-ethyl-5-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制備。
將適量1.48g(10mmol)7-N雜靛紅用50mL乙醇溶解，置于錐形瓶中，磁力攪拌下緩慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加熱到80℃，反應(yīng)6小時(shí)。薄層層析方法跟蹤反應(yīng)至完全，將反應(yīng)體系的混合液趁熱抽濾，用乙醇洗滌，濾液靜置析晶得到中間體。所得中間體與1.89g(10mmol)5-甲基-1-乙基靛紅置于反應(yīng)器中，加入50mL乙醇，繼續(xù)加熱、攪拌，80℃下回流反應(yīng)4小時(shí)。TCL跟蹤至反應(yīng)完全，停止加熱，撤去冷凝裝置。將反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，冷卻至室溫后過濾，濾餅用溫水洗滌，得到不對稱雙取代靛紅西佛堿(2)粗品。將該粗品加入到反應(yīng)器中，加入25mL乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到灰白色結(jié)晶性粉末(2.21克)，總收率66.4％。
灰白色結(jié)晶粉末，M.P.174.4℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),8.23(1H,s,J＝7.5Hz),8.02(1H,s),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.76(1H,d,J＝7.5Hz),7.18(1H,d,J＝7.5Hz),6.91(1H,t,J＝7.5Hz),4.30(2H,q,J＝8.0Hz),2.36(3H,s),1.33(3H,t,J＝8.0Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):167.2,163.4,161.8,158.7,144.6,138.7,138.2,134.7,129.8,120.8,117.7,116.3,113.6,111.8,42.4,21.5,13.9；HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:333.1227,found:333.1230.
實(shí)施例3
化合物(3)
(Z)-3-((Z)-(1-isopropyl-5-methoxy-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1-methyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制備。
將適量1.62(10mmol)1-甲基-7-N雜靛紅用50mL乙醇溶解，置于錐形瓶中，磁力攪拌下緩慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加熱到80℃，反應(yīng)6小時(shí)。薄層層析方法跟蹤反應(yīng)至完全，將反應(yīng)體系的混合液趁熱抽濾，用乙醇洗滌，濾液靜置析晶得到中間體。所得中間體與2.19g(10mmol)1-異丙基-5-甲氧基靛紅置于反應(yīng)器中，加入50mL乙醇，繼續(xù)加熱、攪拌，80℃下回流反應(yīng)4小時(shí)。TCL跟蹤至反應(yīng)完全，停止加熱，撤去冷凝裝置。將反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，冷卻至室溫后過濾，濾餅用溫水洗滌，得到不對稱雙取代靛紅西佛堿(3)粗品。將該粗品加入到反應(yīng)器中，加入25mL乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到白色結(jié)晶性粉末(2.37克)，總收率62.8％。
白色結(jié)晶粉末，M.P.176.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.76(1H,d,J＝7.5Hz),7.50(1H,s,J＝7.5Hz),7.04(1H,d,J＝7.5Hz),6.88(1H,s,J＝7.5Hz),3.95(1H,m,J＝6.8Hz),3.84(3H,s,J＝6.8Hz),3.42(3H,s,J＝6.8Hz),1.21(6H,s,J＝6.8Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.7,163.1,161.8,156.5,153.3,139.8,138.7,138.2,128.2,118.9,113.6,111.8,101.6,58.5,55.9,31.4,20.8；HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:377.1489,found:377.1493.
實(shí)施例4
化合物(4)(Z)-5-chloro-1-ethyl-3-((Z)-(1-isopropyl-5-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制備。
將適量2.10g(10mmol)1-乙基-5-氯-7-N雜靛紅用50mL乙醇溶解，置于錐形瓶中，磁力攪拌下緩慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加熱到80℃，反應(yīng)6小時(shí)。薄層層析方法跟蹤反應(yīng)至完全，將反應(yīng)體系的混合液趁熱抽濾，用乙醇洗滌，濾液靜置析晶得到中間體。所得中間體與2.03g(10mmol)5-甲基-1-異丙基靛紅置于反應(yīng)器中，加入50mL乙醇，繼續(xù)加熱、攪拌，80℃下回流反應(yīng)4小時(shí)。TCL跟蹤至反應(yīng)完全，停止加熱，撤去冷凝裝置。將反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，冷卻至室溫后過濾，濾餅用溫水洗滌，得到不對稱雙取代靛紅西佛堿(4)粗品。將該粗品加入到反應(yīng)器中，加入25mL乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到灰色結(jié)晶性粉末(2.40克)，總收率58.7％。
淺黃結(jié)晶粉末，M.P.196.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.34(1H,s,J＝1.5Hz),8.30(1H,d,J＝1.5Hz),8.23(1H,s,J＝7.5Hz),7.76(1H,d,J＝7.5Hz),7.18(1H,d,J＝7.5Hz),4.30(2H,q,J＝6.8Hz),3.96(1H,m,J＝6.8Hz),2.36(3H,s,J＝6.8Hz),1.39(3H,t,J＝6.8Hz),1.22(6H,d,J＝6.8Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.4,160.3,153.1,144.6,138.5,138.2,134.3,129.7,123.8,120.8,117.7,116.2,112.5,58.6,48.9,21.5,20.7,13.8；HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:409.1308,found:409.1312.
實(shí)施例5
化合物(5)
(Z)-3-((Z)-(5-chloro-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1-ethyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制備。
將適量1.76g(10mmol)1-乙基-7-N雜靛紅用50mL乙醇溶解，置于錐形瓶中，磁力攪拌下緩慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加熱到80℃，反應(yīng)6小時(shí)。薄層層析方法跟蹤反應(yīng)至完全，將反應(yīng)體系的混合液趁熱抽濾，用乙醇洗滌，濾液靜置析晶得到中間體。所得中間體與1.81g(10mmol)5-氯靛紅置于反應(yīng)器中，加入50mL乙醇，繼續(xù)加熱、攪拌，80℃下回流反應(yīng)4小時(shí)。TCL跟蹤至反應(yīng)完全，停止加熱，撤去冷凝裝置。將反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，冷卻至室溫后過濾，濾餅用溫水洗滌，得到不對稱雙取代靛紅西佛堿(5)粗品。將該粗品加入到反應(yīng)器中，加入25mL乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到黃棕色結(jié)晶性粉末(2.43克)，總收率68.9％。
黃棕色結(jié)晶粉末，M.P.203.9℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),8.1(1H,d),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.91(1H,s,J＝7.5Hz),7.82(1H,t,J＝7.5Hz),7.52(1H,d,J＝7.5Hz),6.87(1H,t,J＝7.5Hz),4.30(2H,q,J＝8.0Hz),1.39(3H,t,J＝8.0Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):169.2,163.4,161.7,153.3,139.5,138.6,138.1,131.4,130.2,129.6,125.4,119.3,113.5,111.8,48.9,13.8；HRMS(ESI)for(M+Na)+:calcd:377.1489,found:377.1493.
實(shí)施例6
化合物(6)
(Z)-3-((Z)-(1-benzyl-5-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-5-chloro-1-methyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制備。
將適量1.96g(10mmol)1-甲基-5-氯-7-N雜靛紅用50mL乙醇溶解，置于錐形瓶中，磁力攪拌下緩慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加熱到80℃，反應(yīng)6小時(shí)。薄層層析方法跟蹤反應(yīng)至完全，將反應(yīng)體系的混合液趁熱抽濾，用乙醇洗滌，濾液靜置析晶得到中間體。所得中間體與2.51g(10mmol)5-甲基-1-苯乙基靛紅置于反應(yīng)器中，加入50mL乙醇，繼續(xù)加熱、攪拌，80℃下回流反應(yīng)4小時(shí)。TCL跟蹤至反應(yīng)完全，停止加熱，撤去冷凝裝置。將反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，冷卻至室溫后過濾，濾餅用溫水洗滌，得到不對稱雙取代靛紅西佛堿(6)粗品。將該粗品加入到反應(yīng)器中，加入25mL乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到黃色結(jié)晶性粉末(2.63克)，總收率59.4％。
黃色結(jié)晶粉末，M.P.226.8℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.34(1H,s,J＝1.5Hz),8.30(1H,s,J＝1.5Hz),8.23(1H,s,J＝7.5Hz),7.42-7.12(6H,m,J＝7.5Hz),4.96(2H,s),3.42(3H,s),2.36(3H,s)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.7,160.4,153.0,144.6,138.5,138.2,136.3,134.2,129.8,128.7,127.1,126.8,123.7,120.8,117.7,116.3,112.5,47.4,31.4,21.5；HRMS(ESI)for(M+Na)+:calcd:443.1151,found:443.1155.
實(shí)施例7
化合物(7)(Z)-1-benzyl-5-bromo-3-((Z)-(5-chloro-1-cyclohexyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制備。
將適量3.16g(10mmol)5-溴-1-苯乙基-7-N雜靛紅用50mL乙醇溶解，置于錐形瓶中，磁力攪拌下緩慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加熱到80℃，反應(yīng)6小時(shí)。薄層層析方法跟蹤反應(yīng)至完全，將反應(yīng)體系的混合液趁熱抽濾，用乙醇洗滌，濾液靜置析晶得到中間體。所得中間體與2.63g(10mmol)1-環(huán)己基-5-氯靛紅置于反應(yīng)器中，加入50mL乙醇，繼續(xù)加熱、攪拌，80℃下回流反應(yīng)4小時(shí)。TCL跟蹤至反應(yīng)完全，停止加熱，撤去冷凝裝置。將反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，冷卻至室溫后過濾，濾餅用溫水洗滌，得到不對稱雙取代靛紅西佛堿(7)粗品。將該粗品加入到反應(yīng)器中，加入25mL乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到黃色結(jié)晶性粉末(4.31克)，總收率74.9％。
黃色粉末，M.P.206.1℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.53(1H,s,J＝1.5Hz),8.09(1H,s,J＝1.5Hz),7.91(1H,s,J＝1.5Hz),7.82(1H,d,J＝1.5Hz),7.51(1H,d,J＝1.5Hz),7.42-7.22(5H,m,J＝7.5Hz),4.79(2H,s),3.56(1H,q),1.82-1.12(10H,m,J＝7.1Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.6,163.1,160.8,155.4,145.6,141.5,138.2,136.3,131.5,130.2,129.6,128.7,127.0,126.8,124.5,119.3,112.9,104.7,64.5,49.6,31.4,25.8,25.3；HRMS(ESI)for(M+Na)+:calcd:575.0725,found:575.0729.
實(shí)施例8
化合物(8)
(Z)-3-((Z)-(5-fluoro-1-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1-methyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyr idin-2(3H)-one的制備。
將適量1.62g(10mmol)1-甲基-7-N雜靛紅用50mL乙醇溶解，置于錐形瓶中，磁力攪拌下緩慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加熱到80℃，反應(yīng)6小時(shí)。薄層層析方法跟蹤反應(yīng)至完全，將反應(yīng)體系的混合液趁熱抽濾，用乙醇洗滌，濾液靜置析晶得到中間體。所得中間體與1.79g(10mmol)1-甲基-5-氟靛紅置于反應(yīng)器中，加入50mL乙醇，繼續(xù)加熱、攪拌，80℃下回流反應(yīng)4小時(shí)。TCL跟蹤至反應(yīng)完全，停止加熱，撤去冷凝裝置。將反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，冷卻至室溫后過濾，濾餅用溫水洗滌，得到不對稱雙取代靛紅西佛堿(8)粗品。將該粗品加入到反應(yīng)器中，加入25mL乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到紅褐色結(jié)晶性粉末(2.42克)，總收率71.8％。
紅褐色結(jié)晶粉末，M.P.218.4℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.85,7.79(2H,m,J＝7.5Hz),7.36(1H,t,J＝7.5Hz),6.88(1H,t,J＝1.5Hz),3.46(3H,s),3.42(3H,s)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.6,161.8,158.7,153.3,138.6,138.2,136.9,125.2,119.5,118.2,113.5,111.7,111.0,31.3,31.2；HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:337.0974,found:337.0979.
實(shí)施例9
化合物(9)
(Z)-1-ethyl-3-((Z)-(5-methoxy-1-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1H-pyrrolo[2,3-b]py ridin-2(3H)-one的制備。
將適量1.76g(10mmol)1-乙基-7-N雜靛紅用50mL乙醇溶解，置于錐形瓶中，磁力攪拌下緩慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加熱到80℃，反應(yīng)6小時(shí)。薄層層析方法跟蹤反應(yīng)至完全，將反應(yīng)體系的混合液趁熱抽濾，用乙醇洗滌，濾液靜置析晶得到中間體。所得中間體與1.91g(10mmol)1-甲基-5-甲氧基靛紅置于反應(yīng)器中，加入50mL乙醇，繼續(xù)加熱、攪拌，80℃下回流反應(yīng)4小時(shí)。TCL跟蹤至反應(yīng)完全，停止加熱，撤去冷凝裝置。將反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，冷卻至室溫后過濾，濾餅用溫水洗滌，得到不對稱雙取代靛紅西佛堿(9)粗品。將該粗品加入到反應(yīng)器中，加入25mL乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到白色結(jié)晶性粉末(2.87克)，總收率79.2％。
白色結(jié)晶粉末，M.P.197.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.77(1H,d,J＝7.5Hz),7.50(1H,s,J＝7.5Hz),7.06(1H,d,J＝1.5Hz),6.88(1H,t),4.30(2H,q,J＝),3.85(3H,s,J＝1.5Hz),3.46(3H,s,J＝8.0Hz),1.39(3H,t,J＝8.0Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.7,163.4,161.7,156.5,153.3,138.7,138.2,133.6,128.2,118.8,113.7,111.8,101.6,55.9,48.9,30.3,13.9；HRMS(ESI)for(M+Na)+:calcd:363.1332,found:363.1336.
實(shí)施例10
本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性測試
對本發(fā)明的化合物進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)，試驗(yàn)方法采用常規(guī)的MTT法。
細(xì)胞株選用：人肝癌細(xì)胞(HepG2)，人肺癌細(xì)胞(A-549)，人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)。培養(yǎng)液為DMEM+15％NBS+雙抗。
樣品液的配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100μmol/L的溶液或者均勻的混懸液，然后用DMSO的PBS(-)稀釋，最終濃度分別為0.1，1，10，20，40，60，80，100μmol/L。
將上市的抗腫瘤藥物阿糖胞苷(Ara-C)以同樣的條件配成對照品溶液。
細(xì)胞培養(yǎng)：貼壁生長腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于含10％滅活新生牛血清和青霉素、鏈霉素(各100萬U/L)的1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5％CO2，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每2～3天傳代1次，傳代時(shí)首先倒出培養(yǎng)液，PBS洗2次，胰酶消化后，加入新鮮的培養(yǎng)液吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)濃度移入新的培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)液至適量。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
MTT法檢測細(xì)胞活性及IC50的測定：
實(shí)驗(yàn)原理：活細(xì)胞線粒體中脫氫酶能將黃色的MTT還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜(MTT formazan)，并沉積在細(xì)胞中，生成的量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，而死細(xì)胞沒有這種功能。DMSO能溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，顏色深淺與所含的量成正比，因此用酶標(biāo)儀測定的光吸收值可反映細(xì)胞存活率。
實(shí)驗(yàn)方法：取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，以2×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl。培養(yǎng)24小時(shí)后，將待測化合物以0.1，1，10，20，40，60，80，100μmol/L濃度處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，以含0.4％DMSO的培養(yǎng)液作對照。藥物作用48小時(shí)后，去上清，每孔加入100μl MTT(2-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-3，5-二苯基-2H-四唑氫溴酸鹽)(1mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄上清，每孔加入100μl DMSO，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在570nm處測定吸光度值，采用IC50計(jì)算軟件求出半數(shù)抑制濃度(IC50)。
試驗(yàn)結(jié)果詳見表1，其中，樣品是指相應(yīng)實(shí)施例中制備的不對稱雙取代靛紅席夫堿類化合物，樣品編號對應(yīng)制備實(shí)施例中所得到的化合物的具體編號。
表1化合物對不同腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50(單位：μmol/L)
化合物5在所測試的3種細(xì)胞株中均表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性，化合物1和8次之，在不同的細(xì)胞株中也表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物具有良好的抗腫瘤活性，特別是部分不對稱雙取代靛紅席夫堿類化合物的活性在特定細(xì)胞株中抗腫瘤活性優(yōu)于或等同于阿糖胞苷，可用于抗腫瘤藥物的研究。