本發(fā)明涉及一種提高肌酸酶熱穩(wěn)定性的方法,屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù):
肌酸酶(creatinase;E 3.5.3.3;CRE;分類名為肌酸瞇基水解酶,creatinase amidinohydrolase)屬于水解酶類,催化肌酸水解產(chǎn)生尿素和肌氨酸。肌酸水解酶是肌氨酸氧化酶法測(cè)定肌酸含量方法中的關(guān)鍵酶。
肌酐作為臨床腎功能監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一,一直以來(lái)備受關(guān)注。其測(cè)定方法隨著科學(xué)的發(fā)展由最初的堿性苦味酸法(Jeffe氏反應(yīng))演變至今的酶法,可以說(shuō)是一個(gè)巨大的進(jìn)步,因后者可以克服前者固有的一些缺點(diǎn)而得到廣泛地應(yīng)用。肌酸測(cè)定所涉及的三種工具酶,即肌肝酶(creatininase,EC 3.5.2.10;分類名為肌酐酰胺水解酶,creatinine amidohydrolase)、肌酸酶、肌氨酸氧化酶(sarcosine oxidase,EC 1.5.3.1)。
目前在多種細(xì)菌中均發(fā)現(xiàn)肌酸水解酶的存在。這些細(xì)菌有假單胞菌屬(Pseudomonas)、梭菌屬(Clostridium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、副球菌屬Paracoccus等。其中,對(duì)Pseudomonas putida的肌酸水解酶研究最多。Yoshimoto等人從惡臭假單胞菌中純化出肌酸水解酶,并首次獲得酶結(jié)晶。該酶的特性研究表明,酶的分子量為94KDa,由2個(gè)亞基組成,亞基分子量為47Kda。
各種來(lái)源肌酸酶的熱穩(wěn)定性都不太理想,目前臨床應(yīng)用的酶法測(cè)定試劑盒中肌酸酶用量都較大,其原因就在于該酶的穩(wěn)定性較差。Schumann等研究了惡臭假單胞菌肌酸酶的穩(wěn)定劑,發(fā)現(xiàn)在酶溶液中添加DTE、BSA或甘油能改善酶的穩(wěn)定性,而進(jìn)一步用隨機(jī)突變的方法對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,得到了A109V、V355M、V182I、A109V+V355M和A109V+V355M+V182I3等5種突變體,在穩(wěn)定性上有所改善,但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的可以確定的化學(xué)鍵的形成。Berberich等用聚氨酯固定化修飾放線桿菌來(lái)源的肌酸酶,提高了酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為了肌酸酶的熱穩(wěn)定性不理想的問(wèn)題,本發(fā)明提供了一種熱穩(wěn)定性提高的肌酸酶突變體。
所述突變體的氨基酸序列是在NCBI上GenBank:CAA00921.1的肌酸酶氨基酸序列的基礎(chǔ)上,將第125位的組氨酸和第130位的亮氨酸替換成為半胱氨酸。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述突變體,是在Pseudomonas putida源的肌酸酶基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸替換突變得到的。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述Pseudomonas putida源的肌酸酶(CRE)的氨基酸序列,是NCBI上GenBank:CAA00921.1所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述Pseudomonas putida源的肌酸酶(CRE)的核苷酸序列,如Genebank:A10619.1所示。
所述突變體與野生型肌酸酶相比Tm值增加了8.2℃。
本發(fā)明還要求保護(hù)編碼所述肌酸酶突變體的核苷酸序列、表達(dá)所述突變體的載體、基因工程菌。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述基因工程菌是以大腸桿菌為宿主構(gòu)建得到的。
本發(fā)明還要求保護(hù)所述突變體或者基因工程菌的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述應(yīng)用是用于制備測(cè)定肌酐含量的試劑。
本發(fā)明還提供一種提高Pseudomonas putida源的肌酸酶熱穩(wěn)定性的方法,所述方法是對(duì)Pseudomonas putida源的肌酸酶進(jìn)行氨基酸替換突變。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述方法是根據(jù)來(lái)源于Pseudomonas putida源的肌酸酶(CRE)的空間結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)突變H125C和L130C,H125C和L130C位于肌酸酶兩個(gè)亞基的界面處,得到突變H125C/L130C。
所述Pseudomonas putida源的肌酸酶(CRE)的氨基酸序列,是NCBI上GenBank:CAA00921.1所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述Pseudomonas putida源的肌酸酶是NCBI上GenBank:Genebank:A10619.1所示的肌酸酶。
本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明提供了一種新型簡(jiǎn)便的通過(guò)添加亞基間二硫鍵提高肌酸酶熱穩(wěn)定性的方法,改造后得到的突變體熱穩(wěn)定性有了明顯提高,為肌酸酶在醫(yī)療診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了方便。
附圖說(shuō)明
圖1:野生酶與肌酸酶突變體的最適溫度比較;其中突變125-130即為肌酸酶突變體H125C/L130C;
圖2:野生酶與肌酸酶突變體的溫度穩(wěn)定性比較;其中突變125-130即為肌酸酶突變體H125C/L130C;
圖3:野生酶與肌酸酶突變體的Tm值比較。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:突變株的構(gòu)建
(1)化學(xué)合成CRE基因片段,序列如GenBank登錄號(hào)為A10619.1(Pseudomonas putida來(lái)源的肌酸酶)所示,將該基因片段連接到pET28a(+),轉(zhuǎn)化E.coli,得到表達(dá)野生酶的重組E.coli。提取重組E.coli,質(zhì)粒,驗(yàn)證正確的質(zhì)粒,即為重組質(zhì)粒pET28a(+)-CRE。
(2)以pET28a(+)-CRE為模板,用重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變,然后酶切連接到pET28a(+)。得到相對(duì)于GenBank:CAA00921.1的膽固醇氧化酶的第125位及130位氨基酸發(fā)生替換的突變質(zhì)粒pET28a(+)-H125C/L130C。
(3)將pET28a(+)-H125C/L130C轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中,驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化子,驗(yàn)證正確的即為突變體菌株E.coli-H125C/L130C,突變體菌株所產(chǎn)肌酸酶即為H125C/L130C。
實(shí)施例2:突變株發(fā)酵產(chǎn)酶純化
(1)粗酶液的制備及純化
種子液的培養(yǎng)條件:采用250mL搖瓶培養(yǎng),裝液為20%的LB培養(yǎng)基,并在培養(yǎng)基中加入過(guò)濾除菌的100mg·mL-1硫酸卡那霉素50μL,取單菌落至培養(yǎng)基中,37℃,200rpm,過(guò)夜培養(yǎng)。
發(fā)酵液培養(yǎng)條件:采用500mL搖瓶培養(yǎng),裝液為20%的LB培養(yǎng)基,并加入過(guò)濾除菌100mg·mL-1的硫酸卡那霉素100μL,加入5%的種子液,37℃,200rpm,培養(yǎng)至OD達(dá)到0.6-0.8,加入終濃度為1mM的IPTG,16℃,200rpm,誘導(dǎo)培養(yǎng)16h。
菌體的收集及粗酶液的獲得:將發(fā)酵液8000rpm離心5min,稱得濕重,按1g濕菌體加入20mL pH7.5,50mmol·mL-1的磷酸緩沖液的比例重懸菌體,進(jìn)行超聲破碎,破壁后8000rpm離心10min,上清即為粗酶液。
采用載體上的組氨酸標(biāo)簽,將粗酶液用鎳柱進(jìn)行親和層析,獲得純酶液。
實(shí)施例3:CRE的活力測(cè)定及突變前后肌酸酶的熱穩(wěn)定性比較
CRE酶活的測(cè)定:
在試管中加入900μL肌酸溶液,在室溫中平衡5min后加入100μL待測(cè)酶液,在37℃反應(yīng)10min,然后向反應(yīng)體系中加入2mL對(duì)-二甲氨基苯甲醛溶液終止反應(yīng),并置于25℃溫育20min,在435nm處測(cè)定吸光度值??瞻坠苁窃诩∷崛芤褐邢燃尤雽?duì)-二甲氨基苯甲醛,后加入待測(cè)酶液,其它步驟與測(cè)定管一致。
單位酶活定義:1min內(nèi)將肌酸水解產(chǎn)生1μmol尿素所需要的酶量。
不同溫度25℃-50℃下,每隔5℃測(cè)酶活,最適溫度定義為最高酶活性(以相對(duì)活性100%計(jì))所對(duì)應(yīng)的溫度。將野生酶和突變體H125C/L130C分別在25、30、35、40、45、50℃下處理30min,然后在冰上冷卻測(cè)酶活來(lái)測(cè)定酶的穩(wěn)定性。
如圖1所示,突變前后酶的最適溫度沒(méi)有改變,都為40℃。如圖2所示,野生酶和H125C/L130C在30℃處理30min酶活基本沒(méi)有降低,表明在該溫度下肌酸酶的熱穩(wěn)定性較好。野生酶在35℃-50℃的環(huán)境下酶活隨著溫度的升高而迅速降低,在40℃時(shí)酶活已下降為25%以下,而突變酶H125C/L130C在40℃處理30min,保留酶活仍在50%以上。表明H125C/L130C的熱穩(wěn)定性有了較大的提高。
使用MOS-450圓二色光譜儀變溫實(shí)驗(yàn)確定蛋白的變性溫度,激發(fā)波長(zhǎng)為208nm,控制溫度變化為20℃-80℃,以1℃·min-1的梯度進(jìn)行掃描,以溫度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),作出曲線圖,擬合掃描光譜,將擬合曲線微分,其拐點(diǎn)即為變性溫度Tm。
如圖3所示,突變酶H125C/L130C與野生型肌酸酶有相似的解折疊曲線,但是H125C/L130C的Tm值為63℃,而野生型的Tm值為54.8℃,比野生型的提高了8.2℃,表明在肌酸酶二聚體的界面處引入二硫鍵,通過(guò)亞基間的二硫鍵增加了肌酸酶的熱穩(wěn)定性。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上,但其并非用以限定本發(fā)明,任何熟悉此技術(shù)的人,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi),都可做各種的改動(dòng)與修飾,因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。