一種應(yīng)用解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)生物表面活性素的方法與流程

本發(fā)明涉及一種應(yīng)用解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)生物表面活性素的方法，屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

生物表面活性素，即surfactin，是枯草芽孢桿菌經(jīng)非核糖體途徑(NRPS)合成的由長鏈脂肪酸(C₁₂-C₁₇)和含7個氨基酸的多肽經(jīng)內(nèi)酯鍵連接起來的一種環(huán)狀脂肽，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、溶血栓、降膽固醇的藥用功效以及優(yōu)越的表面活性功能。生物表面活性素的廣譜抗菌功效有望彌補現(xiàn)今普遍存在的抗生素耐藥性難題，生物表面活性素的抗病毒和抗腫瘤功能也為新型藥物設(shè)計提供了一些可選方案，而生物表面活性素優(yōu)越的表面活性功能(能夠?qū)⑺肿拥谋砻鎻埩?2mN/M降低至27mN/M)使其在化妝品，醫(yī)藥，乳化劑，保濕劑和精細(xì)化工中有著廣泛的應(yīng)用前景。據(jù)統(tǒng)計，2006年世界表面活性劑產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)值在200億美元以上，其中北美，西歐和中國占據(jù)了70％以上的市場份額。生物表面活性素作為一種優(yōu)越的生物表面活性劑，顯示出廣闊的應(yīng)用價值和市場前景。因此，開發(fā)能夠高效合成surfactin的微生物菌株及生產(chǎn)工藝對于surfactin的工業(yè)化生產(chǎn)和普及有重要意義。

目前，生物表面活性素產(chǎn)生菌的選育主要采用誘變育種和隨機篩選相結(jié)合的方法，雖然誘變菌株的生物表面活性素產(chǎn)量有所提高，但仍由于產(chǎn)率過低、菌株穩(wěn)定性差而無法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，篩選野生型高產(chǎn)菌株仍然是實現(xiàn)生物表面活性素工業(yè)化生產(chǎn)的首要任務(wù)。

據(jù)文獻報道，芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌)在菌體生長過程中僅有部分細(xì)胞能合成生物表面活性素，繼而誘發(fā)形成生物菌膜(biofilm)。芽孢桿菌菌膜形成途徑被激活后，生物表面活性素的合成受到反饋抑制，繼而表面活性素的代謝合成也隨之結(jié)束。自然界中的芽孢桿菌通過形成生物菌膜以達(dá)到應(yīng)對環(huán)境壓力，獲取競爭優(yōu)勢的目的，因而其生物表面活性素的合成能力都較弱，僅能合成誘導(dǎo)生物膜形成的劑量。此外，生物表面活性素surfactin具有抗生素活性，通過非特異性攻擊細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，形成胞漿滲漏，從而達(dá)到殺滅微生物的目的。這也是大多數(shù)芽孢桿菌不能過量合成surfactin的另一原因。野生型芽孢桿菌的原始產(chǎn)量一般為100-200mg/L，雖然經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件后，生物表面活性素的產(chǎn)量能達(dá)到一定程度的提高，要想繼續(xù)提高生物表面活性素的產(chǎn)率則需要昂貴的特殊發(fā)酵設(shè)備，如應(yīng)用發(fā)酵-膜提取偶聯(lián)反應(yīng)器，枯草芽孢桿菌的生物表面活性素最高產(chǎn)量約為6.5g/L。昂貴的生產(chǎn)成本是生物表面活性素仍不能商業(yè)化生產(chǎn)的主要因素。因此，獲得高產(chǎn)生物表面活性素的天然高產(chǎn)菌株，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，仍然是生物表面活性素商業(yè)化應(yīng)用的根本解決途徑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先提供一株超高效合成生物表面活性素surfactin的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)MT45，該菌株已于2016年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12593，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

所述的解淀粉芽孢桿菌MT45菌株的菌落形態(tài)表現(xiàn)為：菌落圓形、半透明，菌落表面光滑無褶皺、不形成生物菌膜，菌落中央微微凸起，顯微鏡下細(xì)胞呈桿狀、形成芽孢，革蘭氏染色陽性。

本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述解淀粉芽孢桿菌MT45生產(chǎn)生物表面活性素的方法，包括以下步驟：

(1)挑取解淀粉芽孢桿菌CGMCC NO.12593純種菌落，活化得到種子培養(yǎng)液；

(2)將步驟(1)得到的種子培養(yǎng)液按照1％-5％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在25-37℃條件下培養(yǎng)30-55h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖2％、酵母粉1％、氯化鈉0.5％，自然pH。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為碳源10-100g/L，氮源1-10g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0-0.2g/L；所述碳源包括蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、殼聚糖、甘油、可溶性淀粉、糊精中的一種或幾種；所述氮源包括硝酸銨，硫酸銨，氯化銨，碳酸銨，碳酸氫銨中的一種或幾種。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為蔗糖、葡萄糖、果糖、或甘油。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖或蔗糖。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為硝酸銨、碳酸銨或硫酸銨。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為碳源10-30g/L，氮源2-6g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0-0.2g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖或葡萄糖10-30g/L，硝酸銨或碳酸安或硫酸銨2-6g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0.01-0.2g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖30g/L，硝酸銨6g/L，蛋白胨0.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0.18g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖10g/L，硝酸銨6g/L，蛋白胨1.5g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉2g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖30g/L，硝酸銨6g/L，蛋白胨0.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0.18g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖10g/L，氮源6g/L，蛋白胨1.5g/L，硫酸鋅0.14g/L，磷酸二氫鉀4g/L，磷酸氫二鈉2g/L，硫酸鎂0.18g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟(1)挑取解淀粉芽孢桿菌CGMCC NO.12593純種菌落，種于種子培養(yǎng)基，在溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)24h得到種子培養(yǎng)液。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供一種新型解淀粉芽孢桿菌MT45菌株，該菌株能夠利用無機鹽培養(yǎng)基超強合成生物表面活性素。所述菌株生物表面活性素的合成與菌體生長同步，具有產(chǎn)物(surfactin)合成與菌株生長同步且無延滯期，菌株不形成生物菌膜、避免產(chǎn)物反饋抑制，菌株對產(chǎn)物耐受性強的特點。本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法采用優(yōu)選的碳源和氮源及碳氮源優(yōu)選的配比，發(fā)酵55h能最高合成生產(chǎn)9.43g/L的生物表面活性素、，能夠滿足工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)要求，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用前景。

生物材料保藏

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已于2016年6月6日保藏在中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No.12593，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。

附圖說明

圖1為解淀粉芽孢桿菌MT45在營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落形態(tài)(A)和顯微鏡圖片(B)。

圖2為基于16s rRNA序列比對的解淀粉芽孢桿菌MT45系統(tǒng)進化樹。

圖3為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)MT45(A)和模式微生物枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC6051(B)在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長曲線和生物表面活性素的合成曲線。

圖4解淀粉芽孢桿菌MT45產(chǎn)生物表面活性素的純化。

具體實施方式

活化培養(yǎng)液的組成為：以質(zhì)量百分配比計，葡萄糖1％-5％、酵母粉1％-5％、氯化鈉0.3％-1.0％，水余量；pH6.5-7.0。

固體培養(yǎng)基組成為：1-10mM磷酸鉀，50-100mM Mops，2-6mM氯化鎂，0.1-1mM氯化鈣，10-80μM氯化錳，10-80μM氯化鐵，2-6μM氯化鋅，2-6μM硫胺素，0.1-1％甘油，0.1-1％谷氨酸，1％-2％瓊脂。

營養(yǎng)培養(yǎng)基：蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖0.5％，pH 7.5。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2％、酵母粉1％、氯化鈉0.5％，自然pH。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源10-100g/L，氮源1-10g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0.01-0.1g/L。

實施例1菌株篩選

從中國白酒釀造高溫大曲中采集樣品，取5g樣品溶解于10ml的質(zhì)量百分比1％的氯化鈉溶液中，漩渦震蕩混勻后吸取1mL接種于活化培養(yǎng)液中，在溫度50-60℃，200rpm轉(zhuǎn)速條件下活化24-36h，制成成熟活化菌液。

取成熟活化菌液，加入質(zhì)量百分比為1％的氯化鈉溶液進行稀釋。選擇稀釋梯度為10^-2-10^-6的稀釋液，依次涂布于固體培養(yǎng)基平板上。在溫度為30℃，濕度為40％-60％條件下培養(yǎng)48-72h；獲得大量單菌落。將獲得的單菌落接種至營養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后，檢測發(fā)酵液中的生物表面活性素含量，最終得到一株高產(chǎn)生物表面活性素的純培養(yǎng)物，編號為MT45。

實施例2生物表面活性素的測定方法

生物表面活性素的提?。簩l(fā)酵液8000rpm，4℃，離心10min。發(fā)酵上清液用6mol/L的鹽酸調(diào)pH 2.0，放在4℃冰箱靜置2小時。然后，12000rpm，4℃，離心30min，獲得沉淀。將沉淀用甲醇萃取后獲得到生物表面活性素粗產(chǎn)品。

發(fā)酵液中生物表面活性素的測定方法：采用超高效液相色譜法對生物表面活性素進行準(zhǔn)確定量。采用waters BEH C18色譜柱，流動相分別為(A)0.1％甲酸水溶液和(B)HPLC級甲醇，洗脫條件為30％-70％甲醇5min，70％-100％甲醇1min。采用二極管陣列檢測器，在210nm檢測樣品。將得到的色譜峰積分后，采用插入法同標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，得到表面活性素的準(zhǔn)確含量。

實施例3將實施例1篩選得到的菌株進行菌種鑒定。

將實施例1獲得的編號為MT45的菌株進行菌種鑒定。

解淀粉芽孢桿菌MT45菌株在固體平板培養(yǎng)基上形成圓形、半透明菌落；菌落表面光滑無褶皺，不形成以褶皺菌落為代表的生物菌膜；菌落中央微微凸起。顯微鏡下細(xì)胞呈桿狀、形成芽孢，革蘭氏染色陽性(圖1)。

對菌株16r rRNA基因序列進行測序(SEQ ID NO.1)，并和數(shù)據(jù)庫比對，進化樹分析，確定MT45為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)(圖2)。

解淀粉芽孢桿菌MT45于2016年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12593。

實施例4解淀粉芽孢桿菌MT45的發(fā)酵過程

將實施例3鑒定得到的解淀粉芽孢桿菌MT45菌株在種子培養(yǎng)基中活化后，以5％的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖10g/L，蛋白胨1.5g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉2g/L，硫酸鎂0.18g/L。采用500ml三角瓶裝液量100mL，在37℃，200rpm條件下進行發(fā)酵。定時取樣測定細(xì)胞生長量和發(fā)酵過程中的生物表面活性素產(chǎn)量。結(jié)果如圖3，解淀粉芽孢桿菌MT45發(fā)酵至55h能最高合成3.0g/L的生物表面活性素。

解淀粉芽孢桿菌MT45能超高效合成生物表面活性素，最高產(chǎn)量可達(dá)生物量的50％；培養(yǎng)過程中合成的高濃度生物表面活性素也體現(xiàn)了菌株MT45對產(chǎn)物的高耐受性。且與模式菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC6051相比，生物表面活性素合成與菌體生長同步進行，產(chǎn)物合成無延滯期。這些特性有利于縮短解淀粉芽孢桿菌MT45發(fā)酵周期，產(chǎn)生更多的目標(biāo)產(chǎn)物，有利于MT45菌株的工業(yè)化應(yīng)用。

實施例5解淀粉芽孢桿菌MT45對碳源的利用。

解淀粉芽孢桿菌MT45可以利用各種糖作為碳源來生產(chǎn)生物表面活性劑，主要有蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、殼聚糖、甘油、可溶性淀粉、糊精。發(fā)酵培養(yǎng)基的其它組成為：蛋白胨0.5g/L，磷酸二氫鉀2.7g/L，磷酸氫二鈉5g/L，硫酸鎂0.5g/L。碳源的濃度為10g/L。250mL的錐形瓶的裝樣量為50mL，接種量為2％，培養(yǎng)條件為37℃，200rpm。結(jié)果見表1。

表1解淀粉芽孢桿菌MT45對碳源的利用

實施例6解淀粉芽孢桿菌MT45對銨鹽的利用。

解淀粉芽孢桿菌MT45可以利用各種無機銨鹽來生產(chǎn)生物表面活性劑，主要有硝酸銨，硫酸銨，氯化銨，碳酸銨，碳酸氫銨。發(fā)酵培養(yǎng)基的其它組成為：蔗糖20g/L，蛋白胨0.5g/L，磷酸二氫鉀2.7g/L，磷酸氫二鈉5g/L，硫酸鎂0.5g/L。氮源的濃度為8g/L。250mL的錐形瓶的裝樣量為50mL，接種量為2％，培養(yǎng)條件為37℃，200rpm。結(jié)果見表2。

表2解淀粉芽孢桿菌MT45對銨鹽的利用

實施例7解淀粉芽孢桿菌MT45利用不同發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)生物表面活性素

將解淀粉芽孢桿菌MT45接種于LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm下培養(yǎng)過夜。將種子液按照2％的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200rpm下培養(yǎng)48h。不同組分的發(fā)酵培養(yǎng)基的生物表面活性劑的產(chǎn)量如表3

表3解淀粉芽孢桿菌MT45利用不同培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性素

其中，LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L。

生物表面活性素的提?。簩l(fā)酵液8000rpm，4℃，離心10min。發(fā)酵上清液用6mol/L的鹽酸調(diào)pH 2.0，放在4℃冰箱靜置2小時。然后，12000rpm，4℃，離心30min，獲得沉淀。將沉淀用甲醇萃取后獲得到生物表面活性素粗產(chǎn)品。

實施例8解淀粉芽孢桿菌MT45產(chǎn)生物表面活性素的純品制備

將實施例7中得到的生物表面活性素粗產(chǎn)品采用制備液相的方法進行純化。采用C18色譜柱柱，流動相為0.1％甲酸水溶液和甲醇，洗脫條件為線性洗脫(30％-70％甲醇60min)。設(shè)置紫外檢測器檢測波長為210nm。收集40.5-53.5分鐘之間的洗脫組分，洗脫組分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸去除溶劑，得到生物表面活性素純品(附圖4)。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。