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一種酶法轉(zhuǎn)化L?丙氨酸制備丙酮酸的方法與流程

文檔序號:11145504閱讀:2859來源:國知局

本發(fā)明屬于丙酮酸的制備技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種酶法轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸的方法。



背景技術(shù):

丙酮酸(焦性葡萄酸)是參與整個生物體基本代謝的中間產(chǎn)物之一。丙酮酸參與生物體的糖代謝、膠質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)等的生化合成、代謝、醇的發(fā)酵等,可以通過乙酰COA和三羧酸循環(huán)實現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸之間的相互轉(zhuǎn)化,在三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用。

丙酮酸在生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要的作用,是生產(chǎn)色氨酸、苯丙氨酸和維生素B的主要原料,也是合成L-多巴的原料,在有機合成和生化研究領(lǐng)域具有重要作用。

目前中國主要依賴進口丙酮酸類產(chǎn)品,市場上主要采用的是發(fā)酵法、化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法。日本在生產(chǎn)左旋丙酮酸方面處于國際領(lǐng)先地位,主要采用的是生物發(fā)酵的方法,但發(fā)酵法制取丙酮酸轉(zhuǎn)化率往往較低,因為丙酮酸在糖代謝中處于最活躍的中心節(jié)點,在細胞中很容易轉(zhuǎn)化為其他化合物, 因此很難累積,而且,丙酮酸作為發(fā)酵產(chǎn)物混合物的一種成分,往往是相當?shù)蜐舛鹊?,從?fù)雜的發(fā)酵液中分離提取丙酮酸,一般是難以進行的,費用也較昂貴?;瘜W(xué)合成的方法主要采用乳酸氧化法,以乳酸為原料,氧化脫氫一步法生產(chǎn)丙酮酸。但乳酸直接制取丙酮酸非常困難,根據(jù)工藝不同必須選用合適的催化劑??梢赃x擇的催化劑有磷酸鐵、鉬酸碲鹽、銀、釩等。但缺點是成本較高,約6萬元每噸。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對上述存在的缺陷而提供一種酶法轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸的方法,具有成本低廉、純度高、無污染的優(yōu)點。

本發(fā)明采用酶法轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸的方法,利用固定化的L-氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸。

本發(fā)明的利用酶法轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸的方法,其詳細步驟為:

步驟1、向濕菌體溶液中加入丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺,在加速劑四甲基乙二胺和催化劑過硫酸銨的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的固定化酶凝膠,進而制取固定化的L-氨基酸氧化酶;

步驟2、以L-丙氨酸作為反應(yīng)底物,在上述固定化的L-氨基酸氧化酶的作用下氧化脫氨得到L-丙酮酸。

濕菌體為含有L-氨基酸氧化酶的大腸桿菌體。

濕菌體溶液為濕菌體硅油-水溶液

硅油-水溶液的濃度為80%。

步驟1中,制取濕菌體溶液的方法為:將濕菌體均勻的分散在硅油-水溶液中,在超聲波細胞破碎機進行低溫破碎,過濾去除菌體殘片,即得到濕菌體溶液。

步驟1中,所述丙烯酰胺單體加入量為所述濕菌體溶液重量的200%-600%,所述交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺加入量為濕菌體溶液重量的2.5%-5%,所述加速劑四甲基乙二胺加入量為濕菌體溶液重量的5%-8%,所述催化劑過硫酸銨的加入量為濕菌體溶液重量的2%-5%。

步驟1中,將三維網(wǎng)狀的固定化酶凝膠攪拌均勻,用水洗滌凝膠,過濾后得固體,即為固定化的L-氨基酸氧化酶。

步驟2中,氧化脫氨時,控制反應(yīng)溫度、溶氧量、調(diào)節(jié)pH,所述控制反應(yīng)溫度為25℃-35℃,所述pH為6.0-7.5,所述溶氧量為410-450mg/L。

本發(fā)明具有以下特點:

(1)固定化酶催化的最適反應(yīng)溫度為30℃-35℃;

(2)固定化酶催化的最適pH為6.5;

(3)極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開;

(4)固定酶的使用效率高,成本降低。

本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的酶法轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸的方法,以L-氨基酸為底物,利用制備的固定化酶,進行生物轉(zhuǎn)化,獲得產(chǎn)物丙酮酸。固定化酶極易于產(chǎn)物丙酮酸、底物L-氨基酸分開,底物轉(zhuǎn)化率高,雜質(zhì)少,成本低,生產(chǎn)每噸丙酮酸成本大約1.3萬元,反應(yīng)條件溫和,容易控制。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細的說明。

實施例1:將濕菌體80g均勻的分散在80%硅油-水溶液100ml中,在750W赫茲的超聲波中,低溫15℃進行破碎,采用3s-2s-3s的方式進行破碎15分鐘,向菌體溶液中加入2倍量的丙烯酰胺單體和2.5%的交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺,在加速劑四甲基乙二胺(加入量5%)和催化劑過硫酸銨(加入量2%)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的固定化酶凝膠,之后攪拌均勻,用水洗滌凝膠,過濾后得固體,即為固定化酶。

將L-丙氨酸89g溶解在純化水中,配置成8.9%溶液,升溫至30℃,向反應(yīng)液中加入固定化酶19g,酶活774U,控制溶氧410-450mg/L,反應(yīng)PH在6.0,反應(yīng)3h后取樣,經(jīng)高效液相檢測上清液丙酮酸濃度(80g/L)和L-丙氨酸(≤0.5g/L)剩余,當L-丙氨酸剩余小于等于0.5g/L時,認為反應(yīng)完全,所得料液降溫至室溫,過濾去除固定化酶,將料液濃縮至含丙酮酸30%,向料液中加入活性炭10g,攪拌脫色30分鐘,脫碳過膜后,繼續(xù)減壓濃縮得無色粘稠液體106g,即為丙酮酸粗品,轉(zhuǎn)化率≥99%,純度≥98%。

實施例2:將濕菌體90g均勻的分散在80%硅油-水溶液100ml中,在800W赫茲的超聲波中,低溫15℃進行破碎,采用3s-2s-3s的方式進行破碎15分鐘,向菌體溶液中加入5倍量的丙烯酰胺單體和4%交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺,在加速劑四甲基乙二胺(加入量6%)和催化劑過硫酸銨(加入量4%)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的固定化酶凝膠,之后攪拌均勻,用水洗滌凝膠,過濾后得固體,即為固定化酶。

將L-丙氨酸95g溶解在純化水中,配置成9.5%溶液,升溫至32℃,向反應(yīng)液中加入固定化酶22g,酶活879U,控制反應(yīng)PH在6.5,溶氧410-450mg/L,反應(yīng)5h取樣,經(jīng)高效液相檢測上清液丙酮酸濃度(86g/L)和L-丙氨酸(≤0.5g/L)剩余,當L-丙氨酸剩余小于等于0.5g/L時,認為反應(yīng)完全,所得料液降溫至室溫,過濾去除固定化酶,將料液濃縮至含丙酮酸30%,向料液中加入活性炭10g,攪拌脫色30分鐘,脫碳過膜后,繼續(xù)減壓濃縮得無色粘稠液體115g,即為丙酮酸粗品,轉(zhuǎn)化率≥99%,純度≥98%。

實施例3:將濕菌體100g均勻的分散在80%硅油-水溶液100ml中,在850W赫茲的超聲波中,低溫15℃進行破碎,采用3s-2s-3s的方式進行破碎15分鐘,向菌體溶液中加入6倍量的丙烯酰胺單體和5%的交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺,在加速劑四甲基乙二胺(加入量8%)和催化劑過硫酸銨(加入量5%)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的固定化酶凝膠,之后攪拌均勻,用水洗滌凝膠,過濾后得固體,即為固定化酶。

將L-丙氨酸100g溶解在純化水中,配置成10%溶液,升溫至35℃,向反應(yīng)液中加入固定化酶25g,酶活987U,控制反應(yīng)PH在7.5,溶氧410-450mg/L,反應(yīng)5h取樣,經(jīng)高效液相檢測上清液丙酮酸濃度(92g/L)和L-丙氨酸剩余(≤0.5g/L),當L-丙氨酸剩余小于等于0.5g/L時,認為反應(yīng)完全,所得料液降溫至室溫,過濾去除固定化酶,將料液濃縮至含丙酮酸30%,向料液中加入活性炭10g,攪拌脫色30分鐘,脫碳過膜后,繼續(xù)減壓濃縮得無色粘稠液體120g,即為丙酮酸粗品,轉(zhuǎn)化率≥99%,純度≥98%。

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