一種混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的氮缺陷調(diào)控方法與流程

本發(fā)明屬于生物能源領(lǐng)域，尤其涉及一種混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的氮缺陷調(diào)控方法。

背景技術(shù)：

合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇是以生物質(zhì)為原料生產(chǎn)乙醇的一種新技術(shù)，即生物質(zhì)完全氣化得到CO、H₂、CO₂為主要成分的合成氣，再利用微生物將合成氣轉(zhuǎn)化成乙醇。該技術(shù)不需要昂貴的酶和酸、堿等試劑，降低了生產(chǎn)成本，且理論上微生物可以完全利用氣體，是一種環(huán)境友好型技術(shù)。

混合培養(yǎng)生物技術(shù)是近年來一個(gè)非常有前景的技術(shù)，其理念是從生物工程學(xué)的角度出發(fā)，結(jié)合環(huán)境生物技術(shù)的傳統(tǒng)元素，在處理廢棄物的同時(shí)又像工業(yè)生物技術(shù)那樣使產(chǎn)品最大化?；旌吓囵B(yǎng)生物技術(shù)運(yùn)用生態(tài)學(xué)的觀點(diǎn)，通過選擇或者調(diào)控壓力對(duì)微生物進(jìn)行生態(tài)調(diào)控。與基于純培養(yǎng)的工業(yè)生物技術(shù)相比較，混合培養(yǎng)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)不需要滅菌；(2)微生物多樣性帶來的適應(yīng)能力；(3)微生物利用混合基質(zhì)的能力；(4)可持續(xù)過程的可能性。

合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇技術(shù)的研究在國(guó)內(nèi)剛剛起步，由于CO、CO₂和H₂在液體中的溶解度很低，導(dǎo)致微生物對(duì)氣體的吸收量少，存在乙醇產(chǎn)率較低等問題。目前國(guó)內(nèi)外研究者采用了不同的調(diào)控手段來提高乙醇的產(chǎn)量，主要集中在對(duì)于發(fā)酵條件的調(diào)控，包括培養(yǎng)基的優(yōu)化、pH的控制、氣體傳質(zhì)效率的調(diào)控和氣體組分及各組分氣體分壓的控制等。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)酵母膏濃度對(duì)提高Clostridium autoethanogenum乙醇產(chǎn)率具有重要作用；有報(bào)道稱低酵母提取物濃度有利于Clostridium ljungdahlii序批發(fā)酵提高乙醇與乙酸的摩爾比，研究表明不同的氮營(yíng)養(yǎng)來源和氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度都會(huì)在一定程度上影響產(chǎn)乙酸菌代謝產(chǎn)物乙酸和乙醇的濃度和比例。但這些報(bào)道都是基于酵母提取物對(duì)純菌轉(zhuǎn)化合成氣產(chǎn)乙醇的影響研究，沒有涉及混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的氮缺陷調(diào)控方法。

伊內(nèi)奧斯生物股份有限公司發(fā)明的合成氣發(fā)酵方法的操作方法(專利號(hào)CN104822836A)和合成氣發(fā)酵中減少CO₂排放和提高醇生產(chǎn)率的方法(專利號(hào)CN104812904A)沒有涉及基于氮缺陷調(diào)控方法的提高混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的方法。中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)提出的一種復(fù)合菌群及其在合成氣發(fā)酵產(chǎn)醇中的應(yīng)用(CN105087441A)也沒有涉及氮缺陷調(diào)控方法。

有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計(jì)人，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)一種混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的氮缺陷調(diào)控方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的氮缺陷調(diào)控方法，乙醇為產(chǎn)乙酸菌非生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物，氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足很可能導(dǎo)致細(xì)胞新陳代謝異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入非生長(zhǎng)狀態(tài)或者休眠狀態(tài)，通過氮營(yíng)養(yǎng)缺陷來營(yíng)造不利于產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)的條件，從而改變代謝途徑從產(chǎn)酸相變化到產(chǎn)溶劑相，達(dá)到調(diào)控產(chǎn)乙醇的目的。

本發(fā)明提出一種混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的氮缺陷調(diào)控方法，包括以下步驟：

第一階段：培養(yǎng)混合菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)，即發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定不變；

第二階段：將所述第一階段中生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)的混合菌進(jìn)行第二階段的培養(yǎng)，控制該階段的發(fā)酵培養(yǎng)基的氮濃度低于所述第一階段；

所述混合菌為同型產(chǎn)乙酸菌，其來源包括牛糞、城市剩余污泥及其富集物。

進(jìn)一步的，所述第一階段和第二階段中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括氮源和基本成分，所述氮源包括酵母提取物或NH₄Cl，所述酵母提取物于第一階段中的濃度為1.0～10.0g/L、第一階段中的濃度>第二階段中的濃度≥0.05g/L；所述NH₄Cl于第一階段中的濃度為0.5～1.0g/L、第一階段中的濃度>第二階段中的濃度≥0g/L。

進(jìn)一步的，所述基本成分包括K₂HPO₄ 0.25g/L、KH₂PO₄ 0.25g/L、MgCl₂·6H₂O 0.3g/L、BES 10.5g/L。

進(jìn)一步的，所述第一階段和第二階段的培養(yǎng)過程中，充入合成氣至標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，所述合成氣包括體積比為4:3:3的CO、CO₂、H₂。

進(jìn)一步的，所述第一階段和第二階段的培養(yǎng)溫度為30-55℃，pH為7.0-8.0。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明通過氮營(yíng)養(yǎng)缺陷調(diào)控可達(dá)到提高混合菌合成氣發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量的目的，因?yàn)橐掖紴楫a(chǎn)乙酸菌非生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物，而氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足很可能導(dǎo)致細(xì)胞新陳代謝異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入非生長(zhǎng)狀態(tài)或者休眠狀態(tài)，通過氮營(yíng)養(yǎng)缺陷來營(yíng)造不利于產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)的條件，從而改變代謝途徑從產(chǎn)酸相變化到產(chǎn)溶劑相，達(dá)到調(diào)控產(chǎn)乙醇的目的；此方法可適用于木質(zhì)素和纖維素等來源的合成氣發(fā)酵，生產(chǎn)新能源乙醇使得廢物資源化，并降低CO₂等溫室氣體的排放，符合可持續(xù)發(fā)展原則；這對(duì)合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用提供了重要的理論價(jià)值和實(shí)際指導(dǎo)意義。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中酵母提取物缺陷調(diào)控混合菌合成氣發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量；

圖2是實(shí)施例2中NH₄Cl缺陷調(diào)控混合菌合成氣發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量；

圖3是實(shí)施例3中酵母提取物缺陷調(diào)控混合菌合成氣發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量；

圖4是實(shí)施例4中NH₄Cl缺陷調(diào)控混合菌合成氣發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

將50g同型產(chǎn)乙酸菌富集物加入到500mL含有1.0g/L酵母提取物的液體培養(yǎng)基中，充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，調(diào)節(jié)pH＝7.0，37℃下進(jìn)行第一階段培養(yǎng)，待培養(yǎng)6天后同型產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)入第二階段。取10g第一階段培養(yǎng)后的富集物接種至100mL含有0.05g/L酵母提取物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于37℃、100rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，培養(yǎng)基中基本元素的組分和濃度與第一階段相同：K₂HPO₄ 0.25g/L、KH₂PO₄ 0.25g/L、MgCl₂·6H₂O 0.3g/L、BES(溴乙烷磺酸鹽)10.5g/L。充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，維持pH 7.0。利用氣相色譜測(cè)量氣體消耗情況和有機(jī)產(chǎn)物生成情況。結(jié)果表明，第二階段乙醇積累量為12.6mmol/L，比第一階段乙醇濃度高出58.3％(圖1)。以上表明，控制第二階段酵母提取物濃度低于第一階段的兩階段培養(yǎng)法能夠極大地提高乙醇產(chǎn)量。

同型乙酸菌的篩選方法如下：

接種200g牛糞于1000mL厭氧瓶，向其中加500mL成分為(L，pH 7)：CH₃COONa(3.5g)，NH₄Cl(0.5g)，KH₂PO₄(0.25g)，K₂HPO₄·3H₂O(0.25g)，MgCl₂·6H₂O(0.3g)，F(xiàn)eCl₃·6H₂O(25mg)，NiSO₄·6H₂O(16mg)，CaCl₂(25mg)，ZnCl₂(11.5mg)，CoCl·6H₂O(10.5mg)，CuCl₂·2H₂O(5mg)，MnCl₂·4H₂O(15mg)和BES(10.5g)的經(jīng)厭氧處理的富集培養(yǎng)基。頂空充20min N₂(99％)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，置于37℃、100rpm搖床上培養(yǎng)，每24h置換頂空氣體。當(dāng)fhs基因拷貝數(shù)上升并穩(wěn)定時(shí)，富集結(jié)束，以此富集物為接種物，進(jìn)行后續(xù)合成氣生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2

將50g同型產(chǎn)乙酸菌富集物加入到500mL含有0.5g/L NH₄Cl的液體培養(yǎng)基中，充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，調(diào)節(jié)pH＝7.0，37℃下進(jìn)行第一階段培養(yǎng)，待培養(yǎng)6天后同型產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)入第二階段。取10g第一階段培養(yǎng)后的富集物接種至100mL不含NH₄Cl的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(除氮源外其他基本組分及濃度同實(shí)施例1)中，置于37℃、100rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，維持pH 7.0。利用氣相色譜測(cè)量氣體消耗情況和有機(jī)產(chǎn)物生成情況。結(jié)果表明，第二階段得到乙醇最大積累量為7.8mmol/L，比第一階段最大乙醇積累量高出40.2％(圖2)。以上表明，調(diào)控?zé)o機(jī)氮營(yíng)養(yǎng)缺陷的兩階段培養(yǎng)法有利于乙醇的積累。

同型乙酸菌的篩選方法與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例3

將50g同型產(chǎn)乙酸菌富集物加入到500mL含有10g/L酵母提取物的液體培養(yǎng)基中，充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，調(diào)節(jié)pH＝7.0，37℃下進(jìn)行第一階段培養(yǎng)，待培養(yǎng)6天后同型產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)入第二階段。取10g第一階段培養(yǎng)后的富集物接種至100mL含有0.1g/L酵母提取物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(基本元素組分和濃度同實(shí)施例1)，置于37℃、100rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，維持pH 7.0。利用氣相色譜測(cè)量氣體消耗情況和有機(jī)產(chǎn)物生成情況。結(jié)果表明，第二階段乙醇積累量為10.9mmol/L，比第一階段乙醇濃度高出45.9％(圖3)。以上表明，控制第二階段酵母提取物濃度低于第一階段的兩階段培養(yǎng)法能夠極大地提高乙醇產(chǎn)量。

同型乙酸菌的篩選方法與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例4

將50g同型產(chǎn)乙酸菌富集物加入到500mL含有1.0g/L NH₄Cl的液體培養(yǎng)基中，充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，調(diào)節(jié)pH＝7.0，37℃下進(jìn)行第一階段培養(yǎng)，待培養(yǎng)6天后同型產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)入第二階段。取10g第一階段培養(yǎng)后的富集物接種至100mL NH₄Cl濃度為0.25g/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(除氮源外其他組分及濃度同實(shí)施例1)中，置于37℃、100rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，維持pH 7.0。利用氣相色譜測(cè)量氣體消耗情況和有機(jī)產(chǎn)物生成情況。結(jié)果表明，第二階段得到乙醇最大積累量為6.2mmol/L，比第一階段最大乙醇積累量高出25.8％(圖4)。以上表明，調(diào)控?zé)o機(jī)氮營(yíng)養(yǎng)缺陷的兩階段培養(yǎng)法有利于乙醇的積累。

同型乙酸菌的篩選方法與實(shí)施例1相同。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。