本申請為2012年8月22日遞交的申請?zhí)枮?01280076586.9并且發(fā)明名稱為“超穩(wěn)定免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的篩選和改造方法及其應(yīng)用”的發(fā)明專利申請的分案申請。以下公開涉及被稱作tat相關(guān)蛋白質(zhì)改造工程(tape)的方法，通過將靶蛋白和抗生素抗性蛋白融合到tat信號序列并在大腸桿菌內(nèi)表達它，篩選具有更高的溶解性和優(yōu)異的熱穩(wěn)定性的靶蛋白，特別是源自人種系的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(vh或vl)。本發(fā)明還涉及由tape法篩選的、具有優(yōu)異的溶解性和熱穩(wěn)定性的、人重鏈可變結(jié)構(gòu)域抗體(下文稱為“vh結(jié)構(gòu)域抗體”)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域抗體(下文稱為“vl結(jié)構(gòu)域抗體”)和人或改造的vh和vl結(jié)構(gòu)域抗體支架。此外，以下公開內(nèi)容涉及vh和vl結(jié)構(gòu)域抗體和抗體支架的氨基酸序列，以及編碼所述氨基酸序列的多核苷酸。在含有根據(jù)本發(fā)明篩選的人或改造的vh或vl支架的vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體具有相應(yīng)的人或改造的vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體支架(不管cdr序列)的情況下，它仍保留溶解性和熱穩(wěn)定性。此外，以下公開內(nèi)容涉及在由tape法篩選的人或改造的vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體支架中包括隨機cdr序列的文庫，以及其制備方法。此外，以下公開內(nèi)容涉及使用所述文庫篩選的、對靶蛋白質(zhì)具有結(jié)合能力的vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體，所述結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列，編碼所述氨基酸序列的多核苷酸。發(fā)明背景片段化的小尺寸抗體因為它與全長單克隆抗體(mab)的不同理化性質(zhì)而是一種能夠克服現(xiàn)有抗體療法的局限性的有前途的抗體。存在單鏈抗體(scfv)、fab(片段抗體結(jié)合)抗體、免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域抗體，例如vh或vl等作為一般抗體片段，以及串聯(lián)scfv、雙抗體、微型抗體等作為其修飾形式(betteretal.,science1988240(4855):1041-3；hustonetal.,proc.natl.acad.sci.usa.198885(16):5879-83；birdetal.,science1988242(4877):423-6；peietal.,proc.natl.acad.sci.usa.199794(18):9637-42；iliadesetal.,febslett.1997409(3):437-41；wardetal.,nature1989341(6242):544-6)?？贵w片段或小尺寸的抗體與全長單克隆抗體相比主要是喪失了fc(可結(jié)晶片段)的功能，因此，沒有由于fc的存在而產(chǎn)生的預(yù)期效果，如，增加的循環(huán)半衰期、效應(yīng)子功能等。然而，小尺寸的片段化抗體被放大作為能夠克服由于現(xiàn)有完整抗體的大尺寸造成的局限下一代抗體，所述局限例如對結(jié)構(gòu)上隱藏的表位的可及性、藥物滲透和生物分布、形式靈活性、高生產(chǎn)成本等(zhaoetal.,blood2007110(7):2569-77；holligeretal.,nat.biotechnol.200523(9):1126-36；hudsonetal.,med.microbiol.immunol.2009198(3):157-74；eneveretal.,curr.opin.biotechnol.200920(4):405-11)。此外，各種抗體片段和小尺寸抗體的優(yōu)點在于可以通過化學(xué)方法或重組蛋白融合的方法進行連接來實現(xiàn)雙重或多重特異性。近來，這種優(yōu)點已被用來引入多特異性，使得fc功能被模塊化，從而補充了已被指出作為缺點的效應(yīng)子功能和短的循環(huán)半衰期。例如，將對人血清白蛋白具有結(jié)合特異性的片段或小尺寸抗體引入模塊中以實現(xiàn)雙特異性抗體，從而提高了循環(huán)半衰期，或?qū)γ庖呒毎?，如自然殺傷或t細胞具有特異親合力的小尺寸抗體引入模塊中，從而賦予它細胞殺傷功能(elsetal.,jbiolchem.20019；276(10):7346-50；bargouetal.,science2008321(5891):974-7；etal.,mol.cancerther.20087(8):2288-97)。另外，由于單個抗體可以被設(shè)計成向預(yù)期具有不同作用模式的兩個或更多個分子靶標(biāo)賦予特異性，開啟了顯著改善抗體的效力和經(jīng)濟可行性的可能性。人抗體結(jié)構(gòu)中具有抗原特異性結(jié)合功能的最小單元是重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)，這是定位在輕鏈或重鏈n-末端的可變結(jié)構(gòu)域。由于各自兩個n-末端已進化成具有互補結(jié)構(gòu)，在從血漿b細胞生產(chǎn)單克隆抗體時組裝重鏈和輕鏈過程中，vh和vl構(gòu)成非共價結(jié)合型復(fù)合體，從而保持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。人抗體可變結(jié)構(gòu)域vh節(jié)段根據(jù)在框架部分的氨基酸序列的同源性被分為7個家族(vh1、vh2、vh3、vh4、vh5、vh6、vh7)，但不包括cdr(互補決定區(qū))結(jié)合表位，每個家族中含有3至22種不同的氨基酸序列。輕鏈的vl分為vκ和vλ，vκ分為六個家族而vλ分為10個家族(chothiaetal.,1992j.mol.biol.227,799-917；tomlinsonetal.,1995emboj.14,4628-4638；williamsetal.,j.mol.biol.264,220-232)。人們已經(jīng)知道，一些vh和vl根據(jù)相互親和力的程度而具有優(yōu)選的vh/vl配對組合，并且因此，已經(jīng)知曉基因的這種組合重排在擴大抗體庫的多樣性中起重要作用(ruudetal.,j.mol.biol.1999,285,895-901)。根據(jù)6個cdr的組合，結(jié)合型的vh/vl向特定抗原賦予互補結(jié)合特異性。輕鏈的cdr1、cdr2和cdr3和重鏈的cdr1、cdr2和cdr3，共有6個cdr，參與抗原的結(jié)合。根據(jù)人類種系序列的分析，發(fā)現(xiàn)各種各自的cdr大多依賴于重鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr3。因此，這一分析表明抗體的結(jié)合特異性主要取決于重鏈的cdr3的可變性(j.mol.recogni.2000,13,167-187)。與此不同，動物如駱駝和美洲駝以及具有軟骨骨架的魚如鯊魚具有單重鏈結(jié)構(gòu)而沒有輕鏈結(jié)構(gòu)的抗體。因此，這些抗體的可變結(jié)構(gòu)域僅包括單個重鏈可變結(jié)構(gòu)域(對于駱駝和鯊魚分別是vhh和vnar)，并且公知的是這種抗體在抗原結(jié)合和中和功能方面不比vh和vl同時參與抗原結(jié)合的人抗體差。除了在具有重鏈疾病的人類患者中，vh或vl單獨很少存在(hendershotetal.,j.cell.biol.1987104(3):761-7；prellietal.,j.immunol.1992148(3):949-52)。其原因是vh或vl在vh或vl單獨分離時由于其結(jié)構(gòu)互補體而在結(jié)構(gòu)上是不穩(wěn)定的，并且因此，可能容易發(fā)生蛋白質(zhì)聚集。已知的是這種蛋白質(zhì)聚集部分地是由主要在vh和vl界面處分布的疏水性氨基酸殘基所造成的疏水性相互作用而引起。不同于人抗體，在駱駝抗體的情況下，具有親水性的氨基酸殘基可以特別地定位在vh/vl邊界區(qū)域的表面上。具體地，在駱駝抗體的四個位點處的氨基酸(它們是特異地與人vh3家族的那些不同的)被稱為四分體。這些氨基酸位于kabat編號系統(tǒng)的位置37、44、45和47處(kabatetal.,1991j.immunol.147(5),1709-1719)。在氨基酸序列中這種差異可以解釋單可變結(jié)構(gòu)域抗體(vhh)的穩(wěn)定性。有人試圖通過將人可變結(jié)構(gòu)域抗體中在四分體位置的氨基酸替換為駱駝抗體(g44e/l45r/w47g)的親水性氨基酸，產(chǎn)生改善的駱駝科抗體。結(jié)果是，從理化性質(zhì)的角度講它們的溶解性會有所改善(coppietersetal.,arthritisrheum.200654(6):1856-66；dolketal.,proteins.200559(3):555-64；ewertetal.,biochem.200241(11):3628-36；korttetal.,j.proteinchem.199514(3):167-78；martinetal.,proteineng.199710(5):607-14)。然而，與駱駝抗體相比難以得到它們的穩(wěn)定性，例如，降低的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)率和熱穩(wěn)定性(daviesetal.,febslett.1994feb21；339(3):285-90；airesetal.,j.mol.biol.2004340(3):525-42)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，其理由是，在vh/vl邊界區(qū)域的氨基酸修飾會導(dǎo)致相應(yīng)區(qū)域的β-折疊結(jié)構(gòu)的修飾(riechmannetal.,j.mol.biol.1996259(5):957-69)。與人抗體相比較，駱駝單結(jié)構(gòu)域抗體的cdr3具有異常長的環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這種環(huán)結(jié)構(gòu)折疊成人抗體的vh/vl邊界區(qū)域，并且已經(jīng)提出，這種獨特的結(jié)構(gòu)部分地遮蔽了位于邊界區(qū)域中的疏水補丁，從而幫助穩(wěn)定駱駝單結(jié)構(gòu)域抗體(joostetal.,2010drugdiscoverytoday:technologies7(2),139-14)。在人類抗體中由于cdr3的相對較短的環(huán)結(jié)構(gòu)而難以預(yù)期該屏蔽作用?？傊c駱駝單結(jié)構(gòu)域抗體相比，人單可變結(jié)構(gòu)域本身有缺陷的理化性質(zhì)，由此不足以被用作特定抗原的結(jié)合配體的支架。作為克服這一點的方法，僅僅替換作為駱駝抗體的結(jié)構(gòu)特征的四分體氨基酸是不夠的，進一步需要蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計和vh或vl的定向進化。存在于自然界的人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(vh或vl)是能夠維持抗原結(jié)合特性的最小尺寸的抗體(單克隆抗體大小的1/12)，因此，預(yù)計與常規(guī)的單克隆抗體在物理性質(zhì)和作為治療性蛋白質(zhì)的治療效果方面不同。因此，開發(fā)僅具有一個可變結(jié)構(gòu)域的人抗體的需求也增加了。然而，當(dāng)vh或vl單獨存在時，蛋白質(zhì)的聚集和不穩(wěn)定傾向仍然是主要障礙，應(yīng)該在開發(fā)特定抗原的結(jié)合支架時被克服。因此，為了使抗體片段和小尺寸抗體提供一般的單克隆抗體不能實現(xiàn)的優(yōu)點并保持本身的競爭力，確保物質(zhì)本身的穩(wěn)健的藥物和理化性質(zhì)是很重要的。在已有技術(shù)中也已嘗試了一些分子定向進化的方法，以便穩(wěn)定人重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(barthelemyetal.,j.biol.chem.2008283(6):3639-54)。他們用vh的cdr-改造文庫構(gòu)建了噬菌體展示系統(tǒng)，然后篩選在施加熱脅迫之后對蛋白a具有結(jié)合活性的vh。有報告稱通過該方法篩選到了具有增加的溶解性、并在蛋白質(zhì)的熱變性后允許可逆折疊的cdr改造的人vh(jespersetal.,nat.biotechnol.200422(9):1161-5)。此外，有報告稱，制備了無熱變性處理下在cdr3部分和框架部分誘導(dǎo)突變的各種文庫并用相同的方法篩選到在噬菌體展示后對蛋白a展現(xiàn)高結(jié)合活性的vh，因此，可以得到相比野生型的vh為熱力學(xué)穩(wěn)定且具有增加的可溶性表達的改造的vh(barthelemyetal.,jbiolchem.2008283(6):3639-54)。在噬菌體展示系統(tǒng)中，靶蛋白是由融合到靶蛋白的n-末端的pelb蛋白的sec信號序列誘導(dǎo)至sec途徑。然而，在這種情況下，該蛋白(其之前在大腸桿菌的細胞質(zhì)內(nèi)折疊)由于蛋白質(zhì)的固有轉(zhuǎn)位途徑的限制而不能通過該途徑。原因是，一般的噬菌體展示采用sec途徑，這是大腸桿菌的代表性的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位途徑，并且，由于這條途徑的性質(zhì)，靶蛋白質(zhì)在穿過細胞膜時在分子伴侶幫助下在細胞質(zhì)內(nèi)具有線性結(jié)構(gòu)而不是三維結(jié)構(gòu)。在胞質(zhì)內(nèi)，sec途徑特異的蛋白質(zhì)(不同的線性形式)在被稱作secb的分子伴侶的幫助下，蛋白轉(zhuǎn)錄后直接天然存在而不折疊。sec途徑靶蛋白通過secb被移動到由存在于細胞內(nèi)的seca、secyeg和secdfyajc組成的轉(zhuǎn)位復(fù)合體，以線性形式而不是三維結(jié)構(gòu)穿過膜，并且已穿過的氨基酸鏈在到達周質(zhì)前通過dsba和dsbb的氧化和還原形成包括二硫鍵的完整的三維結(jié)構(gòu)(baneyxandmujacicnaturebiotech.2004,22,1399～1408)。因此，如果由于蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)而在細胞質(zhì)中迅速發(fā)生一定的蛋白質(zhì)折疊和三維結(jié)構(gòu)形成，這種蛋白與設(shè)計用于sec途徑的噬菌體展示篩選系統(tǒng)不具有兼容性。此外，據(jù)報道，當(dāng)基于斑塊尺寸的大小直接從遍布菌苔的平板上篩選克隆時，可選擇具有改進的理化性質(zhì)的野生型vh(toetal.,j.biol.chem.2005280(50):41395-403)。但是，通過基于平板的篩選來進行大規(guī)模處理是不可能，因此，為了減小文庫的大小，制造僅用于進行蛋白質(zhì)體外篩選步驟的vh3家族的初始文庫。同時，為了提高重組蛋白的折疊特性，嘗試了遺傳選擇方法(maxwelletal.,proteinsci.19998(9):1908-11；wigleyetal.,nat.biotechnol.200119(2):131-6；cabantousetal.,natbiotechnol.200523(1):102-7；waldogs.curr.opin.chem.biol.20037(1):33-8)。一個代表性用于改善重組蛋白的折疊特性的方法是通過測量以重組dna技術(shù)融合到目的蛋白質(zhì)的報告蛋白的活性來間接測定目的蛋白質(zhì)的折疊程度。然而，當(dāng)目的蛋白單獨存在時，不能準(zhǔn)確地反映折疊。另外，為了提高蛋白質(zhì)的溶解性，已經(jīng)開發(fā)出了分子定向進化方法，其中利用tat(雙精氨酸轉(zhuǎn)位)途徑作為生物過濾器來確定蛋白質(zhì)是否被折疊，該途徑是具有校對蛋白質(zhì)折疊品質(zhì)的功能的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位途徑。具體地，目的蛋白融合到報告基因和tat信號序列并通過大腸桿菌內(nèi)的tat途徑表達，然后根據(jù)蛋白質(zhì)的折疊程度和溶解性通過tatabc轉(zhuǎn)位酶復(fù)合體進行蛋白折疊校對。如果靶蛋白質(zhì)具有足夠的溶解性，由靶蛋白和報告蛋白組成的融合蛋白穿過大腸桿菌的內(nèi)膜并到達周質(zhì)。通過諸如抗生素抗性測量等方法檢測到達周質(zhì)的融合蛋白，從而篩選具有所需溶解性程度的蛋白質(zhì)(fisheretal.,proteinsci.200615(3):449-58)。由此可以看出，當(dāng)重組蛋白時，不僅是在天然系統(tǒng)中的tat途徑底物蛋白質(zhì)被應(yīng)用于tat途徑時，它也顯著通過tat途徑，與重組蛋白的溶解性和穩(wěn)定性成正比(limetal.,proteinsci.200918(12):2537-49)。另外，已經(jīng)報道，利用tat途徑，有效篩選出允許在大腸桿菌的細胞質(zhì)內(nèi)進行蛋白質(zhì)折疊的單鏈抗體(scfv)(fisheracanddelisamp.jmolbiol.2009385(1):299-311)。根據(jù)上述文獻，分子定向進化是通過使用在大腸桿菌中不溶的并表達為模板堿基序列的scfv13完全在體外實現(xiàn)的。scfv內(nèi)的二硫鍵具有約4至6kcal/mol的水平，并有助于蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定化。這一鍵是形成在氧化環(huán)境中，如細菌的周質(zhì)或真核生物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)。細菌的周質(zhì)通常通過電子在內(nèi)膜上存在的dsba和dsbb之間的流動保持氧化條件。因此，在通過人工穿過tat途徑而從scfv改造文庫中選擇的scfv13蛋白的情況下，自主自我折疊、在還原條件細胞質(zhì)而不是氧化條件細胞質(zhì)中沒有形成二硫鍵的胞內(nèi)抗體被優(yōu)先選擇。具體而言，當(dāng)引導(dǎo)蛋白進入tat途徑的信號序列融合到靶蛋白的n-末端并且tem-1β-內(nèi)酰胺酶融合到靶蛋白的c-末端(用作報告基因)的基因在大腸桿菌內(nèi)表達時，表達了三功能融合蛋白(tripartide)。表達的融合蛋白進入tat途徑，并且通過存在于內(nèi)層細胞膜的tatabc轉(zhuǎn)位酶復(fù)合體的機制進行蛋白質(zhì)折疊檢查。一些研究發(fā)現(xiàn)，在許多重組蛋白中，只有那些具有溶解性的蛋白保持了與tat途徑的特定機制的兼容性(sandersetal.,mol.microbiol.200141(1):241-6；delisaetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2003100(10):6115-20；matosetal.,emboj.200827(15):2055-63；fisheracanddelisamp.j.mol.biol.2009385(1):299-311；limetal.,proteinsci.200918(12):2537-49)。但是，上述用于提高蛋白質(zhì)的折疊特性的方法從未被應(yīng)用于選擇結(jié)構(gòu)域抗體，特別是，vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體等?？傊?，目前，人vh結(jié)構(gòu)域抗體的改造修飾和篩選無一例外地是基于噬菌體展示和與蛋白a的結(jié)合活性來進行(kristensenpandwinterg.fold.des.19983(5):321-8；sieberetal.,nat.biotechnol.199816(10):955-60；jungetal.,j.mol.biol.1999294(1):163-80；aandplückthuna.j.mol.biol.2001305(5):989-1010)。因此，迫切需要發(fā)展用于選擇具有更有效的溶解性和高的熱穩(wěn)定性的vh結(jié)構(gòu)域抗體的方法，并且進一步地，迫切需要發(fā)展通過利用所選擇的結(jié)構(gòu)域抗體而具有改善功效的最小單位的下一代抗體。技術(shù)實現(xiàn)要素：技術(shù)問題本發(fā)明的一個實施方案涉及提供一種命名為tat相關(guān)蛋白質(zhì)改造工程(tape)的方法，能夠有效地篩選具有溶解性和高的熱穩(wěn)定性的vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體。進一步地，本發(fā)明的一個實施方案涉及提供由tape法篩選的、具有溶解性和優(yōu)異的熱穩(wěn)定性的、人vh和vl結(jié)構(gòu)域抗體和人或改造的vh和vl結(jié)構(gòu)域抗體支架，以及提供所述vh和vl結(jié)構(gòu)域抗體和抗體支架的氨基酸序列，和編碼它的多核苷酸。在含有根據(jù)本發(fā)明篩選的人或改造的vh或vl支架的vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體具有相應(yīng)的人或改造的vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體支架(不管cdr序列)的情況下，仍保留著溶解性和熱穩(wěn)定性。進一步地，本發(fā)明的一個實施方案涉及提供一種在由tape法篩選的人vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體支架中包括隨機cdr序列的文庫，及其制備方法。進一步地，本發(fā)明的一個實施方案涉及提供對使用所述庫篩選的靶蛋白具有結(jié)合能力的vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體，所述結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列，及編碼它的多核苷酸。解決技術(shù)問題的技術(shù)方案在一個總的方面，本發(fā)明提供了一種命名為tat相關(guān)蛋白質(zhì)改造工程(tape)的方法，能夠有效地從人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域文庫或組合文庫中篩選配體，尤其是，具有高溶解性和高的熱穩(wěn)定性的vh和vl結(jié)構(gòu)域抗體。另外，本發(fā)明提供了用于篩選所述配體的系統(tǒng)、載體和宿主細胞，并提供了由tape法篩選的配體，特別是vh和vl結(jié)構(gòu)域抗體。令人驚訝地，我們發(fā)現(xiàn)，由根據(jù)本發(fā)明的tape法篩選的vh結(jié)構(gòu)域抗體，只要保留了vh結(jié)構(gòu)域抗體支架，即，fr1至fr4框架，而不管被插入的cdr序列，即，序列cdr1至cdr3，就具有高溶解性和熱穩(wěn)定性，以及保持高溶解性和熱穩(wěn)定性。從這個觀點來看，本發(fā)明提供了由本發(fā)明的tape法篩選的vh結(jié)構(gòu)域抗體支架，其中隨機的人源性或組合的cdr序列，也就是，cdr1至cdr3序列，被插入到vh結(jié)構(gòu)域抗體支架，即，fr1至fr4框架中，以及構(gòu)造它的方法。另外，本發(fā)明提供了從所構(gòu)建的文庫中篩選具有靶向與靶蛋白結(jié)合能力的vh結(jié)構(gòu)域抗體的方法。在本發(fā)明提供的具有高的溶解性和熱穩(wěn)定性的vh結(jié)構(gòu)域抗體支架，即，fr1至fr4框架，具有下面的氨基酸序列：fr1的氨基酸序列：x0vqlx1x2x3gx4x5x6x7x8pgx9sx10x11x12x13cx14x15x16gx17x18x19-式1)在式1)中，x0是e或q，x1是v或l，x2是e或q，x3是s或a，x4是g或a，x5是g，m，n，v，或e，x6是l，v，或w，x7是v，k，a，或i，x8是q，k，或h，x9是g，t，a，r，e，s，或t，x10是l，v，r，或m，x11是r或k，x12是l，i，或v，x13是s，a，或t，x14是a，e，v，r，i，k，t，或s，x15是a，g，p，v，或t，x16是s，f，或y，x17是f，y，r，g，或l，x18是t，a，s，n，t，p，i，n，h，或a，和x19是f，l，v，或c；fr2的氨基酸序列：wx20rx21x22pgx23gx24x25x26x27x28-式2)在式2)中，x20是v，a，或l，x21是q，n，r，i，k，y，v，m，s，q，w，f，l，v，或c，x22是a，g，k，s，v，m，或t，x23是k，q，e，r，或t，x24是l，n，i，p，y，t，v，w，a，r，m，或s，x25是v或e，x26是w，i，v，p，f，h，m，y，l，c，或r，x27是v，m，i，或l，和x28是s，a，或g；fr3的氨基酸序列：x29x30x31x32x33x34x35x36x37x38x39x40x41x42x43x44x45x46x47x48x49x50x51dx52x53x54yx55cx56x57-式3)在式3)中，x29是r，h，q，或t，x30是f，v，l，或i，x31是t，s，或i，x32是i，l，v，m，或r，x33是s，t，或d，x34是r，a，v，n，或i，x35是d，n，或a，x36是n，t，d，i，r，k，y，或e，x37是a，s，v，或t，x38是k，r，t，q，v，e，m，n，或i，x39是n，r，t，k，s，d，或v，x40是t，m，s，v，i，y，或a，x41是l，v，a，或m，x42是f，y，n，d，h，或s，x43是l或m，x44是q，e，h，或n，x45是m，l，v，i，或w，x46是n，t，k，d，y，i，或s，x47是s或n，x48是l或v，x49是r，k，或t，x50是d，a，s，p，t，v，i，或s，x51是e，a，d，或s，x52是t，n，或s，x53是s，a，或g，x54是v，i，l，或m，x55是y或f，x56是a，g，v，或s，和x57是r，s，k，t，l，n，或f；和fr4的氨基酸序列：x58gx59gx60x61vtvss-式4)在式4)中，x58是w，c，y，g，s，或a，x59是q，r，或l，x60是a，t，i，或v，和x61是l，m，p，v，或t。另外，本發(fā)明提供了編碼vh結(jié)構(gòu)域抗體支架的氨基酸序列(即，fr1至fr4框架的氨基酸序列)的多核苷酸。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的具有高的溶解性和熱穩(wěn)定性的vh結(jié)構(gòu)域抗體支架，即，fr1至fr4框架，具有下面的氨基酸序列：fr1的氨基酸序列：x0vqlx1x2sggx5x6x7x8pgx9sx10rx12scx14x15sgx17x18x19-式5)在式5)中，x0是e或q，x1是v或l，x2是e或q，x5是g，n，v，或e，x6是l或v，x7是v或k，x8是q，k，或h，x9是g，t，a，r，e，或t，x10是l或v，x12是l或v，x14是a，e，v，i，k，或s，x15是a，g，或v，x17是f，y，r，g，或l，x18是t，a，s，n，t，p，i，n，h，或a，和x19是f，l，v，或c；fr2的氨基酸序列：wvrx21x22pgx23gx24x25x26x27x28-式6)在式6)中，x21是q，n，r，i，k，y，v，m，s，q，w，f，l，v，或c，x22是a，g，k，s，或m，x23是k，q，e，r，或t，x24是l，n，i，p，y，t，v，w，a，r，m，或s，x25是v或e，x26是w，i，v，p，f，h，m，y，l，c，或r，x27是v，m，i，或l，和x28是s，a，或g；fr3的氨基酸序列：rx30tx32sx34dx36x37x38x39x40x41x42x43x44x45x46x47x48x49x50x51dtax54yx55cx56x57-式7)在式7)中，x30是f，v，l，或i，x32是i，l，v，或m，x34是r，a，v，或i，x36是n，t，d，i，r，k，y，或e，x37是a，s，v，或t，x38是k，r，t，q，v，e，m，n，或i，x39是n，r，t，k，s，d，或v，x40是t，m，s，v，i，y，或a，x41是l，v，a，或m，x42是f，y，n，d，h，或sx43是l或m，x44是q，e，h，或n，x45是m，l，v，i，或w，x46是n，t，k，d，y，i，或s，x47是s或n，x48是l或v，x49是r，k，或t，x50是d，a，s，p，t，v，i，或s，x51是e，a，d，或s，x54是v，i，l，或m，x55是y或f，x56是a，g，v，或s，和x57是r，s，k，t，l，n，或f；和fr4的氨基酸序列：x58gqgx60x61vtvss-式8)在式8)中，x58是w，c，y，g，s，或a，x60是a，t，i，或v，和x61是l，m，v，或t。另外，本發(fā)明提供了編碼重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)抗體支架的氨基酸序列(即，fr1至fr4框架的氨基酸序列)的多聚核苷酸。更優(yōu)選地，本發(fā)明中提供的具有高溶解性和熱穩(wěn)定性的vh結(jié)構(gòu)域抗體的支架，即，fr1至fr4框架，具有在表1中記載的氨基酸序列。[表1]通過tape篩選的vh抗體支架的fr1至fr4框架的氨基酸序列(來自于人種系)另外，本發(fā)明提供了編碼vh結(jié)構(gòu)域抗體支架的氨基酸序列(即，fr1至fr4框架的氨基酸序列)的多聚核苷酸。特別地，通過對框架的一部分氨基酸序列進行修飾而改進的vh結(jié)構(gòu)域抗體支架，即，fr1至fr4框架，具有表2中記載的氨基酸序列。[表2]氨基酸修飾的vh結(jié)構(gòu)域抗體支架的fr1至fr4框架的氨基酸序列根據(jù)本發(fā)明包括vh抗體支架的氨基酸序列(即，fr1至fr4框架的氨基酸序列)的vh結(jié)構(gòu)域，具有由下式表示的氨基酸序列fr1-x-fr2-x-fr3-x-fr4-式9)，在式9)中，x從左到右的順序是指cdr1、cdr2和cdr3。具體地，根據(jù)本發(fā)明包括fr1至fr4框架的氨基酸序列的vh結(jié)構(gòu)域具有選自表3和4所示的seqidno：37至89，和seqidno：90至131的氨基酸序列之一。[表3]包括由tape篩選的vh結(jié)構(gòu)域抗體支架的fr1至fr4框架的vh結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(來自于人種系)[表4]包括氨基酸修飾的vh結(jié)構(gòu)域抗體支架的fr1至fr4框架的vh結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列另外，本發(fā)明提供了編碼vh結(jié)構(gòu)域抗體支架的氨基酸序列(即，fr1至fr4框架的氨基酸序列)的多聚核苷酸。為了可以更容易地理解本發(fā)明，在詳細描述本發(fā)明之前首先定義本文所使用的某些術(shù)語和縮寫。人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域：這是指在構(gòu)成人免疫球蛋白g的12個結(jié)構(gòu)域(vh、ch1、ch2、ch3、vl和cl各一對)中直接參與結(jié)合抗原的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)。vh或vl結(jié)構(gòu)具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中9個β-折疊鏈相互交叉。在vh的情況下，可變區(qū)是存在于第二和第三β-折疊之間，在第四和第五β-折疊之間，以及在第八和第九β-折疊之間，從其n-末端開始，在此，這些可變區(qū)分別被稱為cdr(互補決定區(qū))1、cdr2和cdr3。當(dāng)從vh的n-末端開始時，在第一和第二β-折疊不含cdr1的整個部分被稱為框架1(fr1)，cdr1和cdr2之間包括第三和第四的β-折疊的部分被稱為框架2(fr2)，cdr2和cdr3之間的部分被稱為框架3(fr3)和cdr3后的部分被稱為框架4。各框架不直接參與結(jié)合抗原，即使它們是抗原可變結(jié)構(gòu)域，并且在這些區(qū)域中的大部分氨基酸序列在人免疫球蛋白上是一致的保守的。vh節(jié)段根據(jù)框架區(qū)的氨基酸序列同源性被分成7個家族(vh1、vh2、vh3、vh4、vh5、vh6和vh7)。vl節(jié)段被分成vκ和vλ，vκ節(jié)段被分為六個家族而vλ節(jié)段被分成10個家族(chothiaetal.,1992jmolbiol227,799-917；tomlinsonetal,1995emboj14,4628-4638；williamsetal.,jmolbiol264,220-232)。cdr(互補決定區(qū))：這可以被稱為超變區(qū)，并且是指定位在抗體結(jié)構(gòu)的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之內(nèi)并參與直接結(jié)合抗原表位的區(qū)域。每個可變結(jié)構(gòu)域具有三個cdr區(qū)，它們由具有不同長度的氨基酸序列組成?？贵w支架：這是指抗體結(jié)構(gòu)除了高變區(qū)(即，cdr區(qū))以外的其余部分，其直接結(jié)合抗原，并且其氨基酸序列在制備cdr改造文庫時是保守的。換句話說，這是指所述抗體除了cdr1、cdr2和cdr3(高變區(qū))的氨基酸序列以外的其余部分。在本發(fā)明中，這是指整個fr1至fr4框架的區(qū)域，它對應(yīng)于各人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域中除了cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域以外的其余部分。即，本發(fā)明中的vh結(jié)構(gòu)域的抗體支架是指fr1至fr4框架的整個區(qū)域，但不包括vh結(jié)構(gòu)域抗體中的cdr1至cdr3區(qū)。該抗體支架可被用作制備用于篩選結(jié)合至靶標(biāo)的蛋白質(zhì)(特別是vh結(jié)構(gòu)域抗體)的cdr改造文庫的支架。結(jié)構(gòu)域抗體：在廣義上，是指能夠結(jié)合特定抗原，包括構(gòu)成人免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的一些結(jié)構(gòu)域的修飾蛋白。在狹義上，是指人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(vh或vl)的修飾形式，其可以合適地用作治療性抗體。特別地，單個結(jié)構(gòu)域抗體通常是指從僅由重鏈組成的單重鏈抗體衍生的可變結(jié)構(gòu)域。源自單峰駝的單結(jié)構(gòu)域抗體被稱為vhh(來自單重鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域)，以及vnar(來自于軟骨魚綱如鯊魚的單結(jié)構(gòu)域抗體被稱為可變的新抗原受體)。本發(fā)明中的單結(jié)構(gòu)域抗體，例如，vh結(jié)構(gòu)域抗體或vl結(jié)構(gòu)域抗體，是指僅由源自人的可變結(jié)構(gòu)域的一個重鏈或輕鏈組成的抗體，沒有特別限制。靶標(biāo)蛋白：這是指在tape法中，為了改善來自文庫的蛋白質(zhì)特性而要選擇的目的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，這是指由在tat信號序列和pet-tape表達載體的tem-1β內(nèi)酰胺酶基因之間功能性地連接的基因所編碼的蛋白質(zhì)。也可以使用要求溶解性的任何蛋白質(zhì)而沒有限制，并且其實例包括源自于人的抗體及其片段、受體、受體配體等，并且特別包括天然型的來自人種系細胞的人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域及其人工突變的蛋白。配體：這是指具有在從文庫中篩選的靶蛋白之中與特異性受體或靶向蛋白的結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。多特異性：這是指能夠特異性結(jié)合到一個或多個表位的抗體的性質(zhì)。這也指識別一個目標(biāo)對象中的兩個或更多個表位的抗體的性質(zhì)，或結(jié)合于兩個或更多個目標(biāo)對象的抗體的性質(zhì)。融合蛋白：這是指其中由核酸編碼的、具有不同功能的至少兩個蛋白質(zhì)或者肽功能性地彼此連接的蛋白質(zhì)，例如，tat信號序列和靶蛋白功能性地彼此連接。這里，可加入報告基因如tem-1β內(nèi)酰胺酶，或諸如6xhis或flag的標(biāo)簽。功能性地彼此連接的蛋白質(zhì)的基因的表達是由一個啟動子(誘導(dǎo)型、維持型等)在表達載體上調(diào)控的。天然型或野生型：這是指可以在自然系統(tǒng)中獲得的基因或其產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))。這是一個與突變體、基因多態(tài)性和變體相反的概念，其產(chǎn)物由于基因序列的人工或自然改變而使特性改變。將根據(jù)上述術(shù)語定義和縮寫來描述本發(fā)明。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的tape法和用于它的tape系統(tǒng)是一種用于篩選具有溶解性和優(yōu)異的熱穩(wěn)定性的靶蛋白如源自人種系細胞(vh或vl)、配體等的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的方法和用于執(zhí)行該方法的系統(tǒng)，其制備其中靶蛋白和抗生素抗性蛋白被結(jié)合到tat信號序列的基因構(gòu)建體，然后用包括該基因構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，特別是大腸桿菌，在大腸桿菌中表達融合蛋白。“tat信號序列”是由tat(雙精氨酸轉(zhuǎn)位)途徑識別的序列。它將蛋白質(zhì)引導(dǎo)到從細菌細胞質(zhì)傳遞到細胞內(nèi)的膜中的途徑，以及引導(dǎo)到從基質(zhì)轉(zhuǎn)移到葉綠體的類囊體的途徑。一般地，tat信號序列被分為以下三個基序。它是由n-區(qū)(其為具有正電荷的n-端基序)，在中間由疏水性氨基酸組成的h-區(qū)，和在c-區(qū)(其是c-末端基序)組成。作為分析若干tat信號序列的結(jié)果，人們發(fā)現(xiàn)，s/t-r-r-x-f-l-k這個tat信號序列的顯著的保守序列是遍布n-區(qū)和h-區(qū)存在的。其中，兩個精氨酸(r)被命名為雙精氨酸，因為它們在所有tat信號序列中是保守的。該tat信號序列可以選自tora、cuoo、dmsa、fdng、fdog、hyaa、napa、suf1、wcam、tagt、ycbk、ycdb、ydhx和ynfe，但不限于此。通過在細胞質(zhì)中與分子伴侶或各種輔因子結(jié)合而具有完整三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)通過tat信號途徑移動到細胞膜，但不與sec信號(它是細菌的一般細胞膜運動途徑)兼容。換句話說，由于只有在細胞質(zhì)中被折疊成具有完整三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)可被tatabc轉(zhuǎn)位酶復(fù)合體識別，它們參與與sec途徑具有不同特性的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位途徑(baneyxandmujacic,nat.biotech.2004,22,1399～1408)。根據(jù)本發(fā)明的tape法使用tat-信號途徑的上述特性。為了使源自文庫(例如，人vh結(jié)構(gòu)域文庫)的靶蛋白經(jīng)過tape篩選系統(tǒng)途徑，它需要在細胞質(zhì)內(nèi)被完全折疊，從而被tatabc轉(zhuǎn)位酶復(fù)合體識別。因此，這種存在于細胞內(nèi)的膜中的復(fù)合體可以用作適合性過濾器(fitnessfilter)來僅僅過濾適合tat途徑的底物。因此，本發(fā)明使用這樣的事實，即該蛋白質(zhì)通常只有當(dāng)它在細胞質(zhì)中完全折疊時，才通過tat途徑，這是依賴于蛋白質(zhì)的可溶性和快速折疊(delisaetal.,2003pnas100(10):6115-6120；snadersetal.,2001molmicrobiol41(1):241-246；matosetal.,2008emboj27(15):2055-2063；fisheretal.,2006proteinsci15(3):449-458；limetal.,2009proteinsci18(12):2537-2549)，如由其他研究所發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明中使用的tat途徑的信號序列優(yōu)選地tora、cueo、dmsa、fdng、fdog、hyaa、napa、suf1、wcam、yagt、tcbk、ycdb、ydhx、andynfe蛋白的信號序列，但并不限于此。換句話說，由于tat途徑的性質(zhì)而發(fā)生蛋白質(zhì)折疊的大腸桿菌的細胞質(zhì)具有不允許二硫鍵的還原條件，并且因此，可以從vh結(jié)構(gòu)域抗體文庫中過濾出在未經(jīng)二硫鍵的幫助下快速且準(zhǔn)確地自發(fā)發(fā)生折疊的vh結(jié)構(gòu)域。找出在還原性的環(huán)境下具有功能且自主折疊的抗體是開發(fā)用于存在于還原環(huán)境的細胞質(zhì)中的靶抗原(即，胞內(nèi)抗體)的特異性抗體的關(guān)鍵點。人vh結(jié)構(gòu)域或由本發(fā)明的tape系統(tǒng)篩選的生殖細胞的改造的vh結(jié)構(gòu)域的物理化學(xué)性質(zhì)可以通過分析所篩選的vh結(jié)構(gòu)域的特征來確定。很難簡單地預(yù)測細胞質(zhì)內(nèi)自主折疊的靶蛋白如何有助于某些物理化學(xué)性質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)的溶解性、蛋白的熱穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)的長期貯存穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等)并進一步作為抗體治療劑。本發(fā)明的目的是引入及開發(fā)上述tape法并將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)的技術(shù)，并且更具體地，應(yīng)用這一tape法來篩選改善的人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域抗體(vh或vl)，并應(yīng)用具有由此獲得的改善性能的可變結(jié)構(gòu)域抗體作為開發(fā)新的治療性抗體的支架。與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比較，根據(jù)本發(fā)明的tape法具有以下優(yōu)點。使用現(xiàn)有技術(shù)的噬菌體展示技術(shù)，通過向結(jié)構(gòu)域抗體文庫施加預(yù)定的壓力(如溫度)來執(zhí)行淘選，然后測量蛋白a的結(jié)合活性(jepsersl.etal.,nat.biotechnol.200422(9):1161-5；barthelemyp.a.etal.,j.biol.chem.2008283(6):3639-54)，通過未經(jīng)特殊篩選步驟的實驗，意外地發(fā)現(xiàn)了被命名為m0的結(jié)構(gòu)域(作為結(jié)構(gòu)域的形式是穩(wěn)定的)(j.biol.chem.2009may22；284(21):14203–14210)。然而，采用tape法，通過使用大腸桿菌的tat途徑可以很容易地篩選根據(jù)本發(fā)明的具有高溶解性和熱穩(wěn)定性的人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域。此外，已經(jīng)知道通過基于板的篩選從包括tat信號序列的文庫中發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白的方法。但是，這種方法必須按照下面的步驟，即當(dāng)將用預(yù)定比例稀釋的表達菌株涂布在含有抗生素的固體培養(yǎng)基(板)上時，獲得由于其抗生素抗性而存活的各個克隆。(fishera.c.etal.,proteinsci.2006mar.15(3):449-58,fishera.c.etal.,j.mol.biol.2009385(1):299-311)。因此，由于該基于板的篩選方法的限制，難以從一個板中分離105或更多的單個克隆。鑒于用于選擇一般的結(jié)合活性的抗體文庫為109至1010，使用上述方法來覆蓋整個的正常大小的文庫在物理上是非常困難的。結(jié)果，實質(zhì)上難以在篩選中實現(xiàn)高通量形式。此外，當(dāng)使用現(xiàn)有技術(shù)的方法(例如，iselate)確認了通過抗生素抗性從板中選擇的個體菌株的質(zhì)粒的基因序列時，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)靶基因被克隆成片段化形式而表達短蛋白形式的情況或者只有報告基因存在而沒有靶蛋白(例如，僅tem1-1β-內(nèi)酰胺酶)的情況(fishera.c.etal.,j.mol.biol.2009385(1):299-311)。這些肽的水平(由10至20個氨基酸組成)的短蛋白不受其二維或三維結(jié)構(gòu)的影響，并且因此，它們本身在大多數(shù)情況下具有非常高的溶解性，從而導(dǎo)致假陽性。在現(xiàn)有技術(shù)的基于tat的蛋白質(zhì)折疊篩選方法(例如，iselate，fisherjmb2009)中，這個假陽性比率趨向于隨著使用抗生素抗性的篩選數(shù)量的增加而增加，并且這成為實質(zhì)性的阻礙，使得不能篩選可溶性蛋白質(zhì)。因此，這些方法中大多數(shù)都是用于研究晶體結(jié)構(gòu)而不是檢查大型文庫，所述研究通過從難以確?？扇苄缘陌械鞍椎男〕叽缤蛔凅w文庫(105至106大小)的蛋白修飾來確?？扇苄员磉_(pédelacqetal.,natbiotechnol.200220(9):927-32；yangetal.,proc.natl.acad.sci.2003100(2):455-60)。然而，根據(jù)本發(fā)明的tape法，整個文庫被接種于含有選擇性抗生素(例如，氨芐青霉素)的液體培養(yǎng)基中，而不使用基于現(xiàn)有的固體培養(yǎng)基(板)的蛋白質(zhì)溶解性篩選方法。因此，對于在培養(yǎng)基體積增大的情況下，可適用于同時篩選的文庫(大腸桿菌)的大小沒有限制，由此實現(xiàn)了高通量篩選。另外，如上所述，在現(xiàn)有技術(shù)的方法中，非常有可能的是在從包含抗生素的液體培養(yǎng)基中篩選文庫后，文庫向表達載體(例如，pet-tape)的克隆步驟過程中，其中引入了自體連接的空載體(mockvector)和上述肽水平的基因片段的克隆是作為假陽性存在。為了解決由于肽水平的基因片段造成的假陽性問題(這是這一使用連接酶的克隆方法的固有問題)，從收集到的大腸桿菌中收集總的質(zhì)粒，并且將先前改造的表達靶蛋白和tem-1β-內(nèi)酰胺酶的融合蛋白的基因的兩個末端用限制性內(nèi)切酶處理。然后，通過凝膠電泳和凝膠洗脫方法分離完整大小的選擇基因。結(jié)果，只有首先被tape法篩選到的所有真正的陽性vh結(jié)構(gòu)域可以被完全收集。因此，根據(jù)本發(fā)明的tape法具有的優(yōu)點在于，盡管使用抗生素抗性的重復(fù)篩選數(shù)量增加，但只有僅含有完整靶蛋白的基因構(gòu)建體的真正陽性克隆可以被篩選到，而不會增加假陽性。具體地，根據(jù)本發(fā)明的tape系統(tǒng)使用編碼融合蛋白的基因構(gòu)建體，其中tat-信號序列功能性地連接到靶蛋白的n-末端，特別是重鏈結(jié)構(gòu)域，以及抗生素抗性蛋白質(zhì)，特別是賦予抗生素抗性的蛋白質(zhì)，如成熟的(自身排除sec途徑信號序列)tem-1β-內(nèi)酰胺酶或類似物功能性地連接其c-末端。tape系統(tǒng)或使用它的tape法使用這樣的原則，即在基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細胞，特別是大腸桿菌后，只有通過tat信號序列表達了可溶型的正確折疊的抗生素抗性蛋白質(zhì)的大腸桿菌可以在含有抗生素的培養(yǎng)條件下生存。當(dāng)一個宿主細胞僅由一個基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化時，包括在存活宿主細胞中的靶蛋白被假定為正確折疊的可溶形式。另外，可以通過根據(jù)本發(fā)明的tape法，通過使用轉(zhuǎn)化有編碼不同靶蛋白的基因構(gòu)建體的多個宿主細胞群，特別是大腸桿菌群，以大規(guī)模高通量方式分離可溶性靶蛋白。tape法包括：(1)在含有抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞群，該宿主細胞群被轉(zhuǎn)化有編碼融合蛋白的基因構(gòu)建體，其中tat-信號序列功能性地連接到靶蛋白的n-末端，特別是重鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且抗生素抗性蛋白功能性地連接于其c-末端；(2)從抗生素抗性的大腸桿菌中收集質(zhì)粒dna；(3)從收集的質(zhì)粒dna中收集編碼靶蛋白的核酸序列；和(4)從收集的核酸序列中確認并篩選靶蛋白的序列。特別地，該方法可以進一步包括，在步驟(3)之后，選自下面的一個階段：(3')制備基因構(gòu)建體，其中所收集的核酸序列被再次功能性地連接到編碼tat-信號序列的基因和抗生素抗性基因，然后再用所產(chǎn)生的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化該宿主細胞群，或，(3”)直接用含有所收集的核酸序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞群，而不制備單獨的基因構(gòu)建體。階段(3”)相比于階段(3')具有的優(yōu)點在于更迅速地進行下一個階段。階段(1)至(3')或階段(1)至(3”)可以重復(fù)兩輪或更多輪，并且這種重復(fù)過程會導(dǎo)致篩選具有溶解性和高水平穩(wěn)定性的靶蛋白。當(dāng)階段(1)至(3')或階段(1)至(3”)可以重復(fù)兩輪或更多輪時，最后靶蛋白質(zhì)可通過在步驟(3')或(3”)之后執(zhí)行確認和篩選靶蛋白的序列的階段(4)而被識別。將對tape法進行具體說明。(1)在每個宿主細胞(尤其是大腸桿菌)的細胞質(zhì)中以融合蛋白的形式表達靶蛋白(特別是人可變結(jié)構(gòu)域文庫)。這里，在每個宿主細胞，特別是大腸桿菌中，只有一個特定的融合蛋白被表達。在此，在該融合蛋白中，tat-信號序列功能性地連接到靶蛋白(例如，人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，特別是vh)的n-末端，并且賦予抗生素抗性的蛋白質(zhì)，如成熟的(自身排除了sec途徑信號序列)tem-1β-內(nèi)酰胺酶或類似物功能性地連接到其c-末端。(2)將融合蛋白表達文庫接種到含有抗生素的液體篩選培養(yǎng)基中并向其施加選擇壓力。這里，在第一輪，包含在液體篩選培養(yǎng)基中的抗生素的濃度可以基于0.1mg/ml(1×)是1×、2×、3×、4×、或5×、8×或10×。這里所用的抗生素可以是氨芐青霉素、羧芐青霉素等，但并不限于此。也可以使用根據(jù)在階段(1)中所用的抗生素抗性蛋白來適當(dāng)使用的任何抗生素而沒有限制。被表達的融合蛋白根據(jù)靶蛋白的特性通過tat途徑并移動到細胞內(nèi)的膜。由于靶蛋白的特性(即不具有溶解性)而沒有轉(zhuǎn)位的融合蛋白可以形成包涵體或可以由于tat校對機制而在細胞質(zhì)中降解。只有融合蛋白移動到周質(zhì)中的大腸桿菌才可以通過功能性地連接到靶蛋白的c-末端的賦予抗生素抗性的蛋白(例如tem-1β-內(nèi)酰胺酶或類似物)的作用，在含抗生素的液體篩選培養(yǎng)基中獲得抗性。(3)從在液體篩選培養(yǎng)基中存活的大腸桿菌中收集質(zhì)粒dna，然后用先前設(shè)計的限制性內(nèi)切酶處理，以通過電泳和凝膠洗脫的方法從整個融合蛋白收集僅編碼所述靶蛋白和賦予抗生素抗性的蛋白質(zhì)如β-內(nèi)酰胺酶的融合部分的核酸。或者，(3')從在液體篩選培養(yǎng)基中存活的大腸桿菌中收集質(zhì)粒dna，然后用所收集的質(zhì)粒dna直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，如實施例5所述，隨后進行下一階段。(4)將收集的核酸克隆到空載體中，以便它再次功能性地連接tat信號序列。此后，可以再次重復(fù)階段1)至3)，以從文庫中富集表達具有所需性質(zhì)的蛋白質(zhì)的基因的比例。這里，用于下一輪的液體培養(yǎng)基可以被選擇為具有比前一輪更高濃度的抗生素。作為本發(fā)明中的靶蛋白，特別是可以通過tape法篩選的靶蛋白，可以使用具有所期望功能的任何類型的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，可以使用與特定靶標(biāo)(scfv、胞內(nèi)抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、fab)，受體蛋白質(zhì)，特別是t細胞受體(tcr)，受體配體等，具有結(jié)合能力的蛋白質(zhì)，但是本發(fā)明中的靶蛋白不限于此。更優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)域抗體，例如，vh結(jié)構(gòu)域抗體或vl結(jié)構(gòu)域抗體是適宜的。本發(fā)明中的靶蛋白可以具有突變。對于靶蛋白的突變，基于擴增的突變方法，如合成被設(shè)計為可使在特定位點的氨基酸進行隨機修飾的寡聚物，然后采用使用該寡聚物的重疊聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)的方法，或在pcr條件下誘導(dǎo)在隨機位點的隨機變異(易錯pcr)的方法，其中dna聚合酶的錯誤率是人為增加的，但是突變方法不限于此。包括本發(fā)明的靶蛋白的融合蛋白可以包括由在其c-末端的特定氨基酸序列組成的標(biāo)簽，以便于其分離、純化或檢測?？梢允褂迷诒景l(fā)明所屬領(lǐng)域中通常使用的任何標(biāo)簽而不限制為這一標(biāo)簽。例如，該標(biāo)簽可選自6xhis標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽等，但不限于此。任何本發(fā)明所屬的領(lǐng)域中已知的能夠在大腸桿菌中表達的載體都可以用作表達所述融合蛋白的載體而沒有限制，并且這一載體的非限制性實例可包括pet22b(novagen)、pae34(athenaes)、pet9a(novagen)、δpmk等(limhketal.,productioncharacteristicsofinterferon-ausinganl-arabinosepromotersysteminahigh-cell-densityculture.appl.microbiol.biotechnol.53(2):201-208.)。作為誘導(dǎo)融合蛋白表達的啟動子，可以使用lac啟動子、t7啟動子、阿拉伯糖啟動子等。僅從由使用tape法篩選的文庫中收集靶基因，并將其克隆到新的表達載體，使得僅靶蛋白質(zhì)單獨表達而沒有已分別定位在n-末端和c-末端的tat信號和tem-1β-內(nèi)酰胺酶，然后，對各命中物執(zhí)行純化步驟。這里，純化步驟可以通過為了便于純化和分析而在靶蛋白的c-末端包括標(biāo)簽來容易地進行。如上所述，可以使用在本發(fā)明所屬領(lǐng)域中通常使用的任何標(biāo)簽而沒有限制。例如，標(biāo)簽可選自6xhis標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽等，但不限于此。此外，可以根據(jù)可變結(jié)構(gòu)域的類型(例如vh3)通過使用蛋白a親和柱來執(zhí)行純化步驟。可以根據(jù)本發(fā)明的tape法所使用的文庫的種類，篩選具有所需性質(zhì)的配體。這種配體的實例可包括免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，特別是結(jié)構(gòu)域抗體，受體，受體配體等，但不限于此。特別地，配體可以是野生型，以及可以是由在文庫中誘導(dǎo)突變而具有突變的配體等，如上所述。此外，可以相同方式獲得基因序列，即用于編碼該配體的堿基序列?？梢源_認，通過本發(fā)明的tape法獲得的配體，例如野生型配體，包括受體，受體配體，來自種系堿基序列的vh和vl或者從其組合文庫中篩選的其突變配體展現(xiàn)出優(yōu)選的理化性質(zhì)。特別是，可以確認，該配體的溶解性、長期儲存穩(wěn)定性、在還原環(huán)境的細胞質(zhì)中的自我折疊能力和熱穩(wěn)定性改善。更優(yōu)選的配體可以是，例如，從人免疫細胞cdna文庫獲得的人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域及其突變體。突變體可以通過使用文庫來篩選并獲得，在該文庫中氨基酸使用nnk引物等在特定的野生型人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的框架部分的特定位置上被修飾。當(dāng)通過根據(jù)本發(fā)明的tape法篩選的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，即，vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體，具有人vh或vl結(jié)構(gòu)域的對應(yīng)框架序列，仍舊保持其溶解性和熱穩(wěn)定性，而不管cdr序列如何。因此，通過本發(fā)明篩選的具有優(yōu)異的物理性質(zhì)如高溶解性、熱穩(wěn)定性等的vh支架可以用作所述文庫中的支架用于獲得特定配體，即，靶向所需靶標(biāo)(即，抗原)的結(jié)構(gòu)域抗體。具體地講，在維持篩選到的突變體vh結(jié)構(gòu)域抗體的支架的同時，向其中插入隨機cdr序列來構(gòu)建文庫，然后可使用普通的方法如淘選等從文庫中篩選對所需靶標(biāo)(即，抗原)具有結(jié)合能力的抗體。具體地講，與普通的噬菌體展示方法等相似，上述抗體可通過洗脫除了結(jié)合到被固定的所需抗原的vh結(jié)構(gòu)域抗體以外，所有未結(jié)合到被固定的所需抗原的vh結(jié)構(gòu)域抗體來進行篩選。重復(fù)上述洗脫未結(jié)合到被固定的所需抗原的vh結(jié)構(gòu)域抗體的步驟兩次或更多次，從而篩選與靶向抗原具有更高的結(jié)合能力的vh結(jié)構(gòu)域抗體。為了使用如上所述在本發(fā)明中得到的vh結(jié)構(gòu)域抗體的支架來構(gòu)建cdr突變體文庫，相應(yīng)的可變區(qū)(例如，在人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的情況下的cdr)可以具有各種長度，即，氨基酸殘基的數(shù)目可以改變，或特定氨基酸殘基可以被其他隨機的氨基酸替換?；蛘撸挥性赾dr內(nèi)的超可變區(qū)的某些特定位點可以隨機地被修飾。因此，本發(fā)明提供了一種在由本發(fā)明的tape法篩選的vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體的支架中包括隨機cdr序列的文庫及其制造方法，并且提供了一種使用所述文庫篩選對所需靶蛋白具有結(jié)合能力的vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體，和由所述方法篩選到的vh或vl結(jié)構(gòu)域抗體，并且還提供了所篩選到的結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列和編碼它的多核苷酸。這些方法可以改善人單可變結(jié)構(gòu)域抗體，特別是vh結(jié)構(gòu)域抗體的物理性質(zhì)，從而得到單可變結(jié)構(gòu)域，特別是具有這種不能在天然的vh和vl中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)異的溶解性和耐熱性的vh結(jié)構(gòu)域抗體。附圖簡要說明圖1是示出由tape法篩選的蛋白質(zhì)的溶解性圖。圖2是示出通過tape法篩選可溶性蛋白的方法的示意圖，包括：(a)在含有抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞群；(b)根據(jù)抗生素濃度確認宿主細胞群的生長曲線；(c)收集質(zhì)粒來檢查編碼靶蛋白的核酸存在與否；和(d)制備基因構(gòu)建體，其中所收集的核酸序列被再次功能性地連接到編碼tat-信號序列的基因和賦予抗生素抗性的基因，然后再用所制備的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化該宿主細胞群。圖3是示出通過使用tape法從人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域基因文庫中篩選的人vh結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的視圖：(a)所篩選的人vh結(jié)構(gòu)域的fr1、cdrh1、fr2和cdrh2的序列，和(b)所篩選的人vh結(jié)構(gòu)域的fr3、cdrh3和fr4的序列。圖4示出使用sds-page關(guān)于使用tape法從人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域基因文庫中篩選的人vh結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的表達方面的分析結(jié)果，其中，sol表示細胞裂解后的可溶性級分和incl表示細胞裂解后的不溶性級分，箭頭表示在相應(yīng)vh分子量的位置處的條帶：(a)現(xiàn)有技術(shù)中已知具有良好的溶解性的vh結(jié)構(gòu)域的的表達方面，以及(b)左框示出從源自人生殖系細胞的人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域隨機選擇的vh結(jié)構(gòu)域的表達方面和右框示出由tape法篩選的vh結(jié)構(gòu)域的表達方面。圖5是示出制備首先由tape法篩選的vh結(jié)構(gòu)域抗體支架的改造文庫的方法視圖。圖6是示出使用vh結(jié)構(gòu)域抗體支架的改造文庫通過tape法篩選的人vh結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的視圖：(a)篩選的人vh結(jié)構(gòu)域的fr1、cdrh1、fr2和cdrh2的序列，和(b)篩選的人vh結(jié)構(gòu)域的fr3、cdrh3和fr4的序列。圖7示出使用sds-page關(guān)于使用vh結(jié)構(gòu)域抗體支架的改造文庫用tape法篩選的人vh結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的表達方面的分析結(jié)果，其中，m表示分子量標(biāo)記，泳道1代表駱駝結(jié)構(gòu)域抗體vhh的表達方面，泳道2是cdr合成的人結(jié)構(gòu)域抗體hel4，泳道3是mg2x1，泳道4到32代表從框架改造文庫中篩選的vh支架的表達方面，各泳道的框架如下：泳道5：mg2-47，泳道6：mg2-55，泳道7：mg2-57，泳道8：mg2-59，泳道9：mg4-2，泳道10：mg4-5，泳道11：mg4-6，泳道12：mg4-7，泳道13：mg4-12，泳道14：mg4-13，泳道15：mg4-17，泳道16：mg4-20，泳道17：mg4-28，泳道18：mg4-32，泳道19：mg4-33，泳道20：mg8-4，泳道21：mg8-5，泳道22：mg8-6，泳道23：mg8-8，泳道24：mg8-11，泳道25：mg8-12，泳道26：mg8-13，泳道27：mg2-7i，泳道28：mg2-9i，泳道29：mg2-10i，泳道30：mg2-11i，泳道31：mg2-12i，泳道32：mg2-12l圖8是示出由tape法篩選的vh結(jié)構(gòu)域的圓二色性(cd)比較結(jié)果圖。圖9是示出使用vh結(jié)構(gòu)域抗體支架的改造文庫由tape法篩選的人vh結(jié)構(gòu)域的圓二色性(cd)比較結(jié)果圖。圖10是示出由tape法篩選vh結(jié)構(gòu)域的長期儲存穩(wěn)定性的曲線圖。圖11是示出制備具有改變的cdr長度的改造文庫的方法的視圖。圖12是示出為提高結(jié)合抗原的能力，理性的文庫中突變位置的視圖：(a)fr1、cdrh1和fr2的序列，(b)cdrh2和fr3和序列(c)cdrh3和fr4的序列。圖13是示出制備選擇性的cdr改造文庫的方法的視圖。圖14示出使用sds-page在cdrh3修飾時，關(guān)于根據(jù)cdrh3的氨基酸殘基數(shù)目的vh支架在大腸桿菌中表達方面的分析結(jié)果：(a)cdrh3氨基酸殘基的數(shù)目是7的情況，(b)cdrh3氨基酸殘基的數(shù)目是8的情況，(c)cdrh3氨基酸殘基的數(shù)目是9的情況，(d)cdrh3氨基酸殘基的數(shù)目是10的情況，(e)cdrh3的氨基酸殘基的數(shù)目是11的情況，(f)cdrh3的氨基酸殘基的數(shù)目是12的情況，(g)cdrh3的氨基酸殘基的數(shù)目是13的情況，和(h)cdrh3氨基酸殘基的數(shù)量不改變的情況。具體實施方式以下，參照實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細說明。然而，這些是為了更詳細地解釋本發(fā)明，并且本發(fā)明的范圍不受下述實施例的限制。實施例1：用于構(gòu)建tape系統(tǒng)的pet-tape的制備為了構(gòu)建雙精氨酸轉(zhuǎn)運體(tat)相關(guān)蛋白質(zhì)改造工程(tape)系統(tǒng)，使用pet9a載體，通過將一種tat底物蛋白tora(大腸桿菌三甲胺-n-氧化物還原酶)的途徑信號序列，即sstora，連接到靶蛋白的n末端并且將tem-1β-內(nèi)酰胺酶連接到其c-末端來制備pet-tape。然而，引導(dǎo)蛋白質(zhì)到tat途徑的信號序列并不限于sstora，如上所述，對普通技術(shù)人員顯而易見的是可以使用所有tat途徑蛋白的信號序列。此外，對普通技術(shù)人員顯而易見的是，作為使用的載體，可以使用任何滿足本發(fā)明目的的載體，例如pet9a(newenglandbiolab)、使用阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動子的δpma(韓國專利申請公開no.1996-007784)、使用lac啟動子的pae34等等。在使用pet9a作為載體的情況下，當(dāng)在優(yōu)化培養(yǎng)條件下通過iptg誘導(dǎo)由sstora、靶蛋白和tem-1β-內(nèi)酰胺酶組成的融合蛋白表達時，該融合蛋白通過信號序列的指導(dǎo)穿過tat移動通路。這里，僅可溶性的和完全折疊的融合蛋白通過tat機制(tata、b、c)穿過細胞內(nèi)的膜，結(jié)果是，連接到靶蛋白的tem-1β-內(nèi)酰胺酶由于靶蛋白的折疊特性而移動到大腸桿菌的周質(zhì)中。大腸桿菌的抗生素抗性是根據(jù)tem-1β-內(nèi)酰胺酶的在周質(zhì)中存在與否來確定的。在本發(fā)明中，對于用于篩選人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)，人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域文庫(其為靶基因)插入到pet-tape載體的sstora和tem-1β內(nèi)酰胺酶之間。實驗步驟將詳細描述如下。通過dna寡聚物合成和重疊聚合酶鏈反應(yīng)(genscriptusainc.,us)合成sstora基因和人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域的vh家族2型的代表基因的融合基因(stefanewertetal.,stabilityimprovementofantibodiesforextracellularandintracellularapplications:cdrgraftingtostableframeworksandstructure-basedframeworkengineering.methods34(2004)184-199)。使用合成的sstat-vh2基因作為模板同時使用包括ndei序列的5'方向引物(seqidno：1)和包括noti、6xhis和bamhi序列的3'方向引物(seqidno：2)誘導(dǎo)聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)。使用兩種引物，1mm的0.5u的i-pfudna聚合酶(intron)，各2.5mm的四種dntp，以及5μl的10x反應(yīng)緩沖液，并補充蒸餾水至50μl最終體積進行pcr反應(yīng)。pcr反應(yīng)在95℃運行2分鐘，隨后為94℃15秒，56℃15秒，72℃30秒，30個循環(huán)，最后為72℃5分鐘。將擴增的dna加載到1％瓊脂糖凝膠上來執(zhí)行電泳，然后，使用qiaquick凝膠提取試劑盒(qiagen，valencia,ca,usa)分離。將經(jīng)pcr擴增的ndei-sstora-vh2-noti-6xhis-bamhi基因插入pet9a載體的多克隆位點(mcs)中存在的ndei和bamhi切割位點，以制備pet9a-sstora-vh2質(zhì)粒。將noti-tem-1β-內(nèi)酰胺酶-bamhi節(jié)段插入pet9a-sstora-vh2質(zhì)粒的noti和bamhi切割位點之間，并且將其命名為pet-tape，所述noti-tem-1β-內(nèi)酰胺酶-bamhi節(jié)段是使用5'引物(seqidno：3)和3'引物(seqidno：4)，同時使用tem-1β-內(nèi)酰胺酶(bla)基因作為模板運行pcr而分離的。此后，從pet-tape除去vh2區(qū)并將文庫基因插入其內(nèi)來構(gòu)建文庫。為了檢查所構(gòu)建的tape系統(tǒng)是否依賴于相應(yīng)的蛋白質(zhì)的溶解性，將有代表性的天然型的人免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域抗體(dp47d、vh2、vh3)(其在大腸桿菌中的可溶性表達程度是以前已知的)、陰性對照基因(vh3-bla，無信號序列)和陽性對照基因(sstora-bla，無靶蛋白)引入pet-tape中，然后測量tem-1β-內(nèi)酰胺酶的抗生素抗性的程度。已知vh家族2型在大腸桿菌中的可溶性表達是非常不利的，然后vh3和dp47d在大腸桿菌中的可溶性表達相對有利(ewertetal.,stabilityimprovementofantibodiesforextracellularandintracellularapplications:cdrgraftingtostableframeworksandstructure-basedframeworkengineering.methods34(2004)184-199)。具體地，將先前已知其蛋白質(zhì)溶解性的對照人類免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域、陰性對照(其中vh家族3型代表基因被插入pet-tape中并除去sstora，以防止tem-1β-內(nèi)酰胺酶到達周質(zhì)的構(gòu)建體)和陽性對照(pet-tape本身，其中vh基因未插入而是連接到sstora以便只表達tem-1β-內(nèi)酰胺酶的構(gòu)建體)被安裝在tape系統(tǒng)上，而將這些接種于含有抗生素劑的培養(yǎng)液中。然后，通過計數(shù)總存活細胞測量根據(jù)溶解性的抗生素抗性的程度。使用含有50μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基，并用iptg誘導(dǎo)表達3小時，然后計數(shù)總存活細胞。結(jié)果表明，相應(yīng)的基因的已知溶解性與pet-tape系統(tǒng)下抗生素抗性程度成正比(參見，圖1)。在圖1中，每單位細胞濃度的增加計數(shù)意味著更強的抗生素抗性。實施例2：源自人種系的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)文庫的制備將從人的肝、外周血單核細胞(pbmc)、脾和甲狀腺獲得的mrna逆轉(zhuǎn)錄來確保cdna文庫。為了由此確保人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的dna序列，設(shè)計seqidno：5至13所示的混合引物，以確保所有的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域基因可用于人生殖細胞系。將各確保的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域基因文庫插入pet-tape的ndei和bamhi位點之間，以完成具有約108大小的文庫。具體地，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由從人的脾臟、外周血單核細胞、肝臟和胸腺提取的rna(clontech,madison,wi,us)制備cdna。amv逆轉(zhuǎn)錄酶和rnase抑制劑購自promega(madison，wi，usa)。各自的rna與1μl的dntp混合液(0.2mm)和1μl的oligodt引物混合，并向其中加入無核酸酶水以達到12μl總體積。對于rna變性，將混合物在65℃培養(yǎng)，然后向其中加入4μl的5x鏈緩沖液，1μl的rna酶抑制劑和2μl的0.1mdtt。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42℃運行15分鐘，然后在70℃滯留15分鐘。對于在pcr中使用的引物，同時使用幾個簡并引物，以獲得用于各自家族類型的vh結(jié)構(gòu)域。使用seqidno：5至13(見表5)示出的并且各包括正向ncoi序列的引物和seqidno：14和15(見表5)示出的并且各包括反向noti序列的引物(integrateddnatechnologies,inc.,coralville,iowa,us)。使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的cdna作為模板擴增dna，對于每種情況引物10pmolar，0.5u1-pfudna聚合酶(interon，韓國)，四種dntp，每種2.5mm，以及5μl的10x緩沖液。pcr在95℃運行2分鐘，隨后為94℃20秒，56℃20秒，72℃2分鐘，30個循環(huán)，最后是72℃7分鐘。pcr后的反應(yīng)混合物通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后用凝膠提取試劑盒(qiagen，valencia，ca，usa)純化。用ncoi和noti限制性酶切割擴增的pcr產(chǎn)物和pet9a-tape質(zhì)粒，并分別通過pcr純化試劑盒(qiagen)和凝膠提取試劑盒純化。將擴增的vh基因插入pet9a-tape的ncoi和noti切割位點之間，以制備源自人類生殖細胞的vh文庫質(zhì)粒。將制備的文庫使用乙醇沉淀法濃縮。通過電穿孔(btxecm630型號，holliston，ma，usa)用1μl的dna轉(zhuǎn)化electromaxtmdh5a-etm(invitrogen，carlsbad,ca,us)(其是大腸桿菌)。為了驗證該文庫的大小，將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌依次稀釋到10-4至10-8，并且在含有卡那霉素的lb瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在此之后，對菌落進行計數(shù)。結(jié)果是，確認了vh1家族的文庫大小為9.1x106，vh3是1.56x109和vh5是6.05x108。通過從其中隨機地選擇50單菌落得到vh基因，然后在含有卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后使用dna純化試劑盒(qiagen，valencia，ca，usa)分離各質(zhì)粒。作為分析該vh基因的堿基序列的結(jié)果，確認了90％以上的基因被保持為能轉(zhuǎn)錄的形式。[表5]本發(fā)明中使用的引物序列其中，k表示g或t，s表示c或g，r表示a或g，m表示a或c，以及n表示a或t或g或c在本發(fā)明中的“抗體序列編號系統(tǒng)”是指免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域vh或vl的氨基酸被編號的系統(tǒng)。在抗體的cdr中，在cdr中的氨基酸數(shù)目因抗體不同而不同。因此，需要以固定地確定的規(guī)則，從n-末端開始，對許多種類的個體的vh或vl的保守氨基酸序列(例如，框架部分)以及可變部分進行編號。kabat、chothia和imgt編號系統(tǒng)具有代表性，它們根據(jù)以何種順序來編號cdr部分的氨基酸而彼此不同。在本發(fā)明中，使用kabat編號系統(tǒng)。例如，kabat編號系統(tǒng)在編號cdr1的氨基酸時遵循以下原則。基本前提是，抗體的cdr可以根據(jù)氨基酸修飾程度被分成高變區(qū)和結(jié)構(gòu)上支撐所述高變區(qū)的典型結(jié)構(gòu)(canonicalstructure)。例如，框架1，這是第一保守框架，在第30個氨基酸結(jié)束。首先，第31個氨基酸到第35個氨基酸，其對應(yīng)于所述第一可變區(qū)(cdr1)的典型結(jié)構(gòu)，分別被編號為31至35。如果在第35個氨基酸之后的氨基酸被確定為與框架2不相同的可變氨基酸，它們按順序被編號為35a，35b，35c......，直到高變區(qū)結(jié)束。因此，根據(jù)kabat編號系統(tǒng)，確保了框架2是從氨基酸36起始。另外，使用kabat編號系統(tǒng)編號cdr2的氨基酸是相同的。首先，將對應(yīng)于必然存在于cdr2中的典型結(jié)構(gòu)的第50個氨基酸到第52個氨基酸編號，然后將接下來的氨基酸按順序編號為52a，52b，52c......。然后，在cdr2的后部的典型結(jié)構(gòu)中的氨基酸按順序編號為53至65。因此，確保了框架3是從氨基酸66起始。另外，編號cdr3的氨基酸是相同的。首先，將cdr3起始的典型結(jié)構(gòu)的氨基酸分別編號為95至100，并將接下來的高變區(qū)的氨基酸按順序編號為100a，100b，100c......。然后，在cdr3的后部的典型結(jié)構(gòu)中的氨基酸按順序編號為101至102。因此，與其連接的最后的框架，框架4，肯定起始于氨基酸103。實施例3：通過tape(tat相關(guān)蛋白質(zhì)改造工程)對源自人種系的vh文庫的篩選(1)源自人種系的vh文庫的構(gòu)建通過電穿孔方法用pet-tape文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌t7expresslysy/iq。然后，將其在37℃在soc培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時，然后在含有50μg/ml的羧芐青霉素(1x)的lb培養(yǎng)液中接種并培養(yǎng)。當(dāng)大腸桿菌的od值為0.6時，使用離心分離收集大腸桿菌，然后使用質(zhì)粒dna純化試劑盒(qiagen，valencia，ca，usa)分離質(zhì)粒，并隨后用限制性內(nèi)切酶ncoi和bamhi切割。切割基因包括vh文庫和β-內(nèi)酰胺酶基因，這是用于排除可能出現(xiàn)在隨后的液體淘選過程中的假陽性。pet-tape質(zhì)粒也用限制酶ncoi和bamhi切割。切割后，各dna用凝膠提取試劑盒(qiagen)純化。將從在羧芐青霉素的lb培養(yǎng)液中篩選的pet9a-tape文庫中獲得的vh基因插入pet-tape的ncoi和bamhi切割位點之間，并用它再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌t7expresslysy/iq。此后，重復(fù)執(zhí)行上述過程，同時在培養(yǎng)液中的羧芐青霉素濃度增加至250μg/ml(5x)和500μg/ml(10x)，用于液體淘選。用于相應(yīng)過程的示意圖示于圖2。最后，對各濃度的羧芐青霉素進行液體淘選后，從含有氨芐青霉素的lb瓊脂平板中選擇50個單菌落，然后在含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后，從中收集質(zhì)粒，隨后分析堿基序列。用于分析所篩選克隆的vh結(jié)構(gòu)域的特性的培養(yǎng)方法如下。大腸桿菌dh5a和t7expresslysy/iq購自neb(newenglandbiolabs,inc.,beverly,ma,us)。在大腸桿菌包括pet-tape質(zhì)?；那闆r下，在含50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)液中培養(yǎng)大腸桿菌。在大腸桿菌包括pet22b載體的情況下，將50μg/ml氨芐青霉素或羧芐青霉素加入培養(yǎng)液中。對于種子培養(yǎng)，將從lb固體培養(yǎng)基中作為單一菌落形式分離的克隆接種在含有上述抗生素劑的lb液體培養(yǎng)基中，然后，在37℃以200rpm培養(yǎng)12小時或更長的時間。將菌落接種在培養(yǎng)基中，以便在種子培養(yǎng)液中的細胞濃度稀釋至1：100。(2)源自人種系的vh文庫的篩選結(jié)果使用tape系統(tǒng)從按上面所述制備的人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域基因文庫中篩選的天然型的人vh結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列如圖3所示。對于每一種情況，所篩選的天然型的人vh結(jié)構(gòu)域抗體的支架，即，fr1至fr4框架的序列，示于表1。當(dāng)在從最后三次液體淘選分離總共154個vh序列中的重復(fù)的相同的序列被標(biāo)記一次時，可以得到總共54個獨特序列。在總共154個序列中，對應(yīng)于其96％的148個序列被確定為vh3家族類型。已知該vh3家族是在人免疫球蛋白重鏈結(jié)構(gòu)域的七個家族中相對高度可溶的，因此，這證明了使用本發(fā)明的tape系統(tǒng)進行篩選顯著表明了基于溶解性的統(tǒng)計學(xué)上顯著的篩選能力。另外，我們發(fā)現(xiàn)了個體的54個序列中19個序列的框架序列是唯一的，并且其中，13個框架序列被歸類為vh3家族類型。為了檢查所篩選的個體的vh基因沒有tem-1β-內(nèi)酰胺酶(這是報告基因)而單獨在大腸桿菌中表達時，可溶性表達的程度，在誘導(dǎo)vh表達后分離可溶性級分和不溶性級分，然后通過sds-page與各種對照vh結(jié)構(gòu)域相比較(參見，圖4)。將相應(yīng)的基因克隆到pet-22b(+)表達載體中，轉(zhuǎn)化作為宿主細胞的大腸桿菌nebt7。對于支架的表達，在37℃，200rpm的條件下進行培養(yǎng)，然后當(dāng)od值為0.6至0.8時用1mm的iptg誘導(dǎo)表達。在25℃，180rpm持續(xù)3.5小時的條件后，收集細胞。使用b-per試劑(thermoscientific)分離蛋白質(zhì)的可溶性級分和不溶性級分。細胞裂解后，可溶性級分(上清部分)可以通過細胞沉降而得到。將沉淀物(團粒)用pbs洗滌，然后重新懸浮于溶解緩沖液(ph7.4，50mmnah2po4，6murea，0.5mnacl，4mmdtt)，得到不溶性級分。其表達使用sds-page分析。結(jié)果是，可以看出，在從文庫中隨機選擇而未經(jīng)篩選過程的vh結(jié)構(gòu)域(1、2、3)的情況下，在可溶性部分中很少vh結(jié)構(gòu)域具有相應(yīng)尺寸，在誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達后，可以看出，在由tape過程篩選的vh結(jié)構(gòu)域mg4x4-44、mg4x4-25、mg10-10、mg2x1)的情況下，可溶性表達顯著增加(參見圖4(b))。也可以看出，由tape系統(tǒng)篩選的vh結(jié)構(gòu)域比通常已知具有優(yōu)異的可溶性表達程度的vh結(jié)構(gòu)域(vh2、vh3、vh6、dp47d和hel4)有相對較高的可溶性表達比率。實施例4：基于mg2x1vh支架的框架改造的合成文庫的制備為了向基于通過tape法篩選的最佳天然型的人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)候選組中的mg2x1vh支架賦予額外的溶解性和穩(wěn)定性，構(gòu)建“框架改造的合成文庫”，其中在基于vh結(jié)構(gòu)分析而合理選擇的特定的7個氨基酸位點引入突變。根據(jù)kabat編號系統(tǒng)，在mg2x1vh支架中的氨基酸突變位點在圖6中由方框(■)表示。具體地講，基于通過tape法首先篩選的mg2x1支架，在mg2x1vh支架的序列處引入突變。如下詳細描述用于引入突變的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)。將整個基因序列分為兩個片段以制備用于聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)的引物。制備在第一片段的3'引物和在第二個片段的5'引物處引入突變的引物并且通過pcr產(chǎn)生各基因片段(參見，表5的序列17和18)。然后，通過兩個基因片段的重疊pcr構(gòu)建最終的基于mg2x1的框架改造的合成文庫(見，表5中序列18和19和圖5)。從瓊脂糖凝膠分離擴增的dna，用限制酶ncoi和noti處理，然后插入pet-tape載體中，由此制備pet-tape框架改造的重鏈可變結(jié)構(gòu)域合成文庫。實施例5：通過tape(tat相關(guān)蛋白質(zhì)改造工程)系統(tǒng)對基于mg2x1vh支架的改造的vh結(jié)構(gòu)域的篩選使用本發(fā)明的tape系統(tǒng)按照上述來篩選新合成的具有改善的溶解性和穩(wěn)定性的vh支架。對于tape的各個階段，通過增加羧芐青霉素的濃度到50μg/ml(以下稱為“1xtape”)、100μg/ml(以下稱為“2xtape”)、200μg/ml(以下稱為“4xtape”)和400μg/ml(以下稱為”8xtape”)的量級來執(zhí)行。作為分析1xtape后的20個單菌落的堿基序列的結(jié)果，確認了沒有發(fā)現(xiàn)僅包括tem-1β-內(nèi)酰胺酶基因的pet-tape文庫。因此，最終確認可以在由本發(fā)明的tape系統(tǒng)篩選的初始階段排除假陽性。然后，當(dāng)進行2xtape，4xtape和8xtape時，在ncoi和bamhi限制性酶反應(yīng)后僅收集vh基因，然后將它們再引入到tape系統(tǒng)的方法，以及不進行克隆工作而用從細胞培養(yǎng)液分離的pet-tapevh質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法同時進行。在這兩種方法中都未發(fā)現(xiàn)假陽性菌落。在最終進行了8x液體淘選后，從lb固體培養(yǎng)基上選擇50個單菌落，然后液體培養(yǎng)。然后，從中收集質(zhì)粒，并進行氨基酸序列分析。結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)，根據(jù)kabat編號系統(tǒng)，在7個修飾位置中，在位置50和58處偏向地選擇了特別的氨基酸。具體地說，發(fā)現(xiàn)，在41個克隆中，16個克隆在位置50的丙氨酸被修飾為色氨酸，并且在41個克隆中，24個克隆在位置58的酪氨酸被修飾為色氨酸。在其余位置沒有觀察到氨基酸是特別有偏向的。[表2]氨基酸修飾的vh結(jié)構(gòu)域抗體支架的fr1至fr4框架的氨基酸序列實施例6：篩選的vh支架候選物的分離和純化及其物理化學(xué)性質(zhì)分析為了確定篩選的源自人的vh支架候選物(參照圖3)和通過合成突變的vh結(jié)構(gòu)支架候選物組(參見圖6)的物理-化學(xué)性質(zhì)，進行三種分析程序。首先，檢查篩選的vh支架的可溶性表達水平的比例，以確定vh支架候選物的溶解性程度。其次，進行圓二色性(cd)法以確定各自的支架候選物組的熱穩(wěn)定性。第三，通過凝膠過濾色譜法的單體比例和長期儲存穩(wěn)定性，確認純化的支架候選物的蛋白質(zhì)的無聚集特性。(1)篩選的vh支架候選物的分離和純化將篩選的基因運送到大腸桿菌表達載體中，沒有報告蛋白下只表達。使用pet-tape-vh候選物質(zhì)粒作為模板并使用包括ncoⅰ限制酶堿基序列的5'引物(表6的seqidno：21)，和包括xhoⅰ限制性酶堿基序列的3'引物(表6的seqidno：22)運行pcr。通過pcr擴增對應(yīng)于vh候選物的dna片段，用ncoi和xhoi限制酶處理，然后插入到pet22b(+)質(zhì)粒載體的ncoi和xhoi切割位點之間，從而制備pet22b-vh質(zhì)粒。用制備的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌t7expresslysy/iq。然后，選擇單菌落，然后接種于含有100μg/ml氨芐青霉素，20mmmgcl2和2％(w/v)葡萄糖的sb培養(yǎng)液中。當(dāng)培養(yǎng)液的光密度是0.6時，向其中加入1mm的iptg，然后在25℃進行培養(yǎng)4小時用于蛋白質(zhì)表達。通過培養(yǎng)液的離心分離收集大腸桿菌，然后重新懸浮在磷酸鹽緩沖的鹽水(pbs)中。漂浮大腸桿菌冷凍和融化4次，以裂解其細胞壁，并通過離心分離收集上清液。向收集的上清液中加入nacl以具有0.5m的濃度，并且用5nnaoh將ph值設(shè)定為7.4，隨后用0.22μm過濾器過濾。使用ni-nta親和層析純化該蛋白質(zhì)，這是用100mm咪唑洗滌并用300mm咪唑洗脫來洗滌的。使用購自invitrogen的nupage4-12％的bis-tris凝膠電泳證實純化的蛋白質(zhì)，隨后用考馬斯藍染料染色。相對于洗脫的蛋白，通過pd-10脫鹽柱(ge醫(yī)療集團生命科學(xué)，piscataway,nj,usa)進行緩沖液交換到磷酸鹽緩沖的鹽水(pbs)。[表6]本發(fā)明中使用的引物序列其中k表示g或t，s表示c或g，r表示a或g，m表示a或c，和n表示a或t或g或c(2)篩選的vh候選物在大腸桿菌中的可溶性表達程度的分析為了證實通過tape從基于mg2x1vh支架的框架改造文庫首先篩選的vh在大腸桿菌中的可溶性表達方面，只將相應(yīng)的vh以與實施例3(2)相同的方式表達，然后分離可溶性級分和不溶性級分，然后通過sds-page分析。結(jié)果是，能夠得到可溶性表達比從人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域文庫分離的天然型mg2x1提高的vh支架候選物。如圖7所示，大多數(shù)在大腸桿菌中表達的所選擇的vh結(jié)構(gòu)域是可溶的。其中，mg8-14、mg2-55、mg4-5、mg4-13和mg8-4支架候選物(圖7的箭頭所示)顯示出優(yōu)異的水溶性vh表達，并作為vh結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果，確認了，表現(xiàn)出優(yōu)異的可溶性表達的vh結(jié)構(gòu)域的不溶性表達比率降低。(3)熱穩(wěn)定性分析為了通過vh支架候選物組的二維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析來測定熱穩(wěn)定性，通過圓二色性(cd)法計算由tape過程篩選并純化的vh支架候選物的tm(解鏈溫度；全部水性蛋白質(zhì)的50％熱變性的溫度)。折疊分數(shù)由在一定的溫度下的吸光度與加熱前的吸光度之比來表示。吸光度是根據(jù)溫度變化在235nm的波長測量的。在由此獲得的s形曲線中，tm是指折疊分數(shù)為50％的溫度。純化從天然型的人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域文庫和基于mg2x1vh支架的框架改造的合成文庫中篩選的支架候選物，然后稀釋至0.2至0.3mg/ml的濃度。然后，通過使用分光光度計(jascoj-715型號，jascoinc，easton，md，usa)測量其cd。當(dāng)溫度在25至85℃的范圍內(nèi)時，同時每1分鐘增加1℃，記錄并測量在235nm的波長時的cd信號。一般而言，蛋白聚集發(fā)生在大多數(shù)存在于水溶液中的天然型的人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)中，并且因此，cd測量是不可能的。然而，由tape系統(tǒng)篩選的大多數(shù)的vh在單獨存在時都沒有聚集。從由tape系統(tǒng)篩選的vh的熱穩(wěn)定性的cd分析結(jié)果看，mg3-10具有約45℃的tm值(參照表7)，而mg4x4-44、mg4x4-25、mg10-10和mg2x1具有約55至65℃的tm值。這意味著它們的熱穩(wěn)定性與天然vh的平均tm相比提高了約10至20℃(參見圖8和表7)。測量由tape系統(tǒng)從基于mg2x1vh支架的框架改造的合成文庫中篩選的vh結(jié)構(gòu)域(例如，mg2-12i、mg2-12l、mg4-13、mg8-4，mg8-14等)的tm值，以具有65至75℃的平均tm，并且因此，確認了其熱穩(wěn)定性提高了平均20至30℃(參見圖9和表7)。[表7]通過tape從人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域文庫篩選的結(jié)構(gòu)域抗體的數(shù)值4)篩選的vh的聚集度的分析通過測量候選物vh框架根據(jù)長期儲存而造成的聚集來調(diào)查蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。將純化為具有0.2至0.8mg/ml的濃度的vh支架候選物儲存在37℃，60％濕度下。在約20天儲存過程中以預(yù)定的間隔取樣，然后通過離心分離從中除去聚集的蛋白。然后，測量保持水性的蛋白質(zhì)的濃度，并計算其比率。使用nupage4-12％的bis-tris凝膠經(jīng)電泳分離剩余的蛋白，然后通過用考馬斯藍染料染色證實它們的質(zhì)量。作為結(jié)果，可以看出，在加速條件(37℃)持續(xù)60天或更長時間時，大部分溶解在磷酸鹽緩沖的鹽水(pbs)中的蛋白質(zhì)被穩(wěn)定保持而沒有蛋白質(zhì)聚集。每個數(shù)據(jù)點表示當(dāng)初始蛋白質(zhì)含量設(shè)定為1時，保留在水性溶液中的蛋白質(zhì)含量的比例(參照圖10)。實施例7：用于賦予候選物vh支架以抗原結(jié)合能力的根據(jù)cdrh3長度的改造文庫的構(gòu)建為了向由tape法從源自人種系的vh文庫篩選的mg2x1支架，以及由tape法從框架改造文庫篩選的mg8-4和mg8-14支架賦予抗原結(jié)合能力的多樣性，在相應(yīng)支架的cdrh3部分處，構(gòu)建根據(jù)氨基酸(7至13個氨基酸)的長度的cdr3合成文庫。這是從現(xiàn)有的研究結(jié)果中推導(dǎo)的，具有最合適的穩(wěn)定性和與靶蛋白結(jié)合能力的vh結(jié)構(gòu)域的cdr3長度對應(yīng)于7至13個氨基酸長度(christoperjbond.etal.,j.mol.biol.2005348:699–709)。另外，氨基酸由nnk核苷酸三聯(lián)體編碼，所以，即使在將終止密碼子的比率相比nnn和nns核苷酸三聯(lián)體降低時，也可以編碼所有20個氨基酸。此外，通過上述的方法構(gòu)建了r94snnk文庫，其將精氨酸(前述cdr3氨基酸殘基)替換為絲氨酸而增強了cdr3的靈活性。為了從pcr減少誤差，通過pcr構(gòu)建包含框架1到框架3的模板dna片段。分別以mg2x1、mg8-4和mg8-14的cdna作為模板，使用10pmolar的5'引物(表6的seqidno：23)和3'引物(表6的seqidno：24)，0.5u的i-pfudna聚合酶，四種dntp每種2.5mm，5μl的10x緩沖液執(zhí)行dna擴增。pcr重復(fù)25個循環(huán)，條件為；暴露于94℃2分鐘，然后94℃20秒，56℃20秒，72℃25秒，循環(huán)25次，最后72℃5分鐘。為了賦予模板dna以抗原結(jié)合能力的多樣性，制備其中引入了具有7至13個氨基酸長度的組合cdrh3文庫的引物(seqidno：25至31)。通過pcr，使用所構(gòu)建的dna片段為模板，根據(jù)長度而引入了氨基酸多樣性的5'引物和3'引物(seqidno：25至31)，構(gòu)建“根據(jù)長度的cdr3改造文庫”。在以下條件，pcr反復(fù)進行25個循環(huán)；暴露于94℃2分鐘，接著25個循環(huán)的94℃持續(xù)20秒，56℃持續(xù)20秒，72℃40秒，25次，最后72℃5分鐘。圖11示出了關(guān)于構(gòu)建根據(jù)賦予抗原結(jié)合能力多樣性的長度的cdrh3改造文庫的示意圖。實施例8：用于賦予候選物vh支架以抗原結(jié)合能力的多樣性的合理的cdr改造文庫的構(gòu)建出于與實施例7同樣的目的，構(gòu)建為了向基于mg2x1或mg8-4或mg8-14支架賦予抗原結(jié)合能力的vh多樣性的cdr改造文庫。不同于實施例7中的按照cdrh3的長度賦予多樣性，只合理選擇了在引入突變時預(yù)計具有抗原結(jié)合能力同時保持cdr長度的序列，將隨機突變引入到相應(yīng)的基因中。同時保持三個cdr的長度，通過結(jié)構(gòu)分析，只將突變選擇性地引入到抗原有可能結(jié)合(sdr：特定確定殘基)的位置。這樣的優(yōu)點在于由于cdr突變造成的穩(wěn)定性改變和免疫原性問題可通過將突變僅僅引入到cdr的最小位置而被最小化。對于sdr，首先，參照swiss-model系統(tǒng)的建模數(shù)據(jù)及其典型結(jié)構(gòu)，或根據(jù)核苷酸特性的建模數(shù)據(jù)和預(yù)期的結(jié)合能力來選擇sds。另外，通過引入具有相對增加的酪氨酸和絲氨酸比率的偏向核苷酸來設(shè)計氨基酸，這是眾所周知的比其他氨基酸具有更高的抗原結(jié)合能力，使得即使是相同的文庫大小，cdr結(jié)合的概率也是高的(akikokoideetal.,pnas2007104(16):6632-6637)。為了在各cdr1、cdr2和cdr3中引入突變，將基因分成3部分并在該處引入突變(參照圖12)。各個片段通過pcr法進行確認，而框架mg2x1或框架mg8-4、mg8-14的cdna用作模板，如下所示。通過pcr，分別使用5'引物(seqidno：23)和3'引物(seqidno：39)，5'引物(seqidno：40)和3'引物(seqidno：41)，以及5'引物(seqidno：42)和3'引物(seqidno：43)，合成基于mg8-4、mg8-14文庫的第一、第二和第三dna片段。而且，通過pcr，分別使用5'引物(seqidno：23)和3'引物(seqidno：45)，5'引物(seqidno：46)和3'引物(seqidno：47)，以及5'引物(seqidno：48)和3'引物(seqidno：43)合成基于mg2x1文庫的第一、第二和第三dna片段。通過pcr，用10pmolar每種引物，0.5u的ventdna聚合酶，各10mm的四種dntp和5μl的10x緩沖液，進行如上所述的dna片段的合成。pcr在94℃運行2分鐘，隨后為94℃15秒，56℃20秒，72℃25秒，25個循環(huán)，最后72℃5分鐘。通過重疊pcr，使用因此合成的3個模板片段，5'引物(seqidno：23)和3'引物(seqidno：44)完成整個尺寸的合理的cdr改造文庫。pcr在94℃運行2分鐘，隨后是94℃20秒，56℃20秒，72℃40秒，25個循環(huán)，最后72℃5分鐘。圖13示出關(guān)于構(gòu)建用于賦予抗原能力多樣性的合理的cdr改造文庫的示意圖。實施例9：研究在基于vh支架的文庫(根據(jù)cdr長度的改造文庫和合理的cdr改造文庫)中的cdr修飾對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響為了證實cdr修飾對vh支架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的影響，從具有7至13個氨基酸的cdrh3的合成文庫和在cdrh1、cdrh2和cdrh3的特定位置合理地引入突變的文庫中隨機選擇基因(每個cdr改造文庫篩選約8個基因)，并且將它們克隆到專屬的表達載體中。作為表達載體，使用pet-22b(+)表達載體，并轉(zhuǎn)化作為宿主細胞的大腸桿菌dh5α。隨機選擇轉(zhuǎn)化的菌落，并且分析其序列。將所有基因都保持良好的質(zhì)粒進行分離不帶終止密碼子，并再次轉(zhuǎn)化作為宿主細胞的大腸桿菌nebt7，從而誘導(dǎo)相應(yīng)基因的表達。在37℃和200rpm的表達條件下進行培養(yǎng)，然后當(dāng)od值為0.6至0.8時用1mm的iptg誘導(dǎo)表達。在25℃180rpm，3.5小時的條件后，收獲細胞。以與實施例3相同的方式分離可溶性蛋白級分和不溶性蛋白級分。將從各cdr改造文庫中隨機選擇的vh結(jié)構(gòu)單獨表達，然后分離可溶性級分和不溶性級分并通過sds-page進行分析。結(jié)果是，確認了在cdrh3具有七個氨基酸的情況下，所有樣品除了一個以外都表達為可溶形式(參見，圖14(a))。確認了，在cdrh3具有八個氨基酸的情況下，8個樣品中有7個表達為可溶形式(參見，圖14(b))?？梢源_認的是，在cdrh3具有九個氨基酸的情況下，所有樣品都表達為可溶形式(參見，圖14(c))?？梢源_認的是，在cdrh3具有十個氨基酸的情況下，9個樣品中有8個表達為可溶形式(參見，圖14(d))?？梢源_認的是，在cdrh3具有十一個氨基酸的情況下，所有9個樣品都表達為可溶形式(參見，圖14(e))?？梢源_認的是，在cdrh3具有十二個氨基酸的情況下，8個樣品中有6個表達為可溶形式(參見，圖14(f))?？梢源_認的是，在cdrh3具有十三個氨基酸的情況下，7個樣品中有6個表達為可溶形式(見，圖14(g))?？梢源_認的是，在合理的改造的cdr文庫的情況下，所有樣品都表達為可溶形式。確認了，在基于由tape法篩選的vh結(jié)構(gòu)域的框架的基礎(chǔ)上制備的cdr改造文庫中，可溶性表達是整體穩(wěn)定地誘導(dǎo)的而不管cdr修飾(參見，圖14和表8)。[表8]引入cdr修飾后的vh可溶性表達的頻率實施例10：使用具有由tape法篩選的vh結(jié)構(gòu)支架的vh結(jié)構(gòu)域抗體文庫，基于展示技術(shù)的vh結(jié)構(gòu)域抗體候選物的篩選在本發(fā)明中，噬菌體展示、酵母展示、核糖體展示等，優(yōu)選作為可用的展示技術(shù)，以便使用具有由tape法篩選的vh支架的vh結(jié)構(gòu)域抗體文庫來篩選vh結(jié)構(gòu)域抗體候選物，但并不局限于此。根據(jù)噬菌體展示技術(shù)，外源肽和蛋白質(zhì)插入并融合至噬菌體衣殼蛋白，以使外源蛋白質(zhì)在噬菌體表面上表達(smithetal.,science1985228(4705):1315–1317)。在本發(fā)明中，通過將靶抗原結(jié)合至在固定噬菌體的表面上的表達的融合蛋白，篩選具有強結(jié)合能力的結(jié)構(gòu)域抗體。為了篩選與特定抗原具有結(jié)合能力的vh，使用下面提出的淘選方案(carlosf.barbasiiietal.phagedisplay-alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress)；克隆被克隆到噬菌體載體(pcomb3x)的vh文庫(實施例7和8)；在噬菌體的一端表達vh結(jié)構(gòu)域；將表達的vh結(jié)構(gòu)域與靶蛋白接觸；選擇與靶蛋白具有良好的結(jié)合能力的vh結(jié)構(gòu)域。將靶蛋白與在噬菌體的端部表達的vh結(jié)構(gòu)域接觸后，洗出未結(jié)合的噬菌體，并僅洗脫vh結(jié)構(gòu)域-靶蛋白質(zhì)復(fù)合體。因此，只有表達了vh結(jié)構(gòu)域的噬菌體被濃縮。通過重復(fù)5-6輪如上所述的淘選過程，可篩選強烈地結(jié)合于靶抗原的vh結(jié)構(gòu)域抗體。另外，在本發(fā)明中，還使用了酵母展示方法。根據(jù)酵母展示方法，在將vh文庫克隆到酵母表面表達載體中(實施例7和8)后，vh結(jié)構(gòu)域在酵母的表面表達，并結(jié)合到靶蛋白，從而篩選和僅洗脫具有良好的結(jié)合能力的結(jié)構(gòu)域(gingerchao.etal.,natureprotocol20061(2):755-768)。將標(biāo)簽附著于靶蛋白或?qū)⑸锼貥?biāo)記在靶蛋白上，其與所展示的vh結(jié)構(gòu)域反應(yīng)。然后，分別標(biāo)記靶向所結(jié)合的蛋白質(zhì)的熒光蛋白和靶向所展示的vh結(jié)構(gòu)域的熒光蛋白。只有被標(biāo)記的酵母-靶蛋白復(fù)合體(其示于期望的區(qū)域)使用熒光激活細胞分選(facs)被洗脫，從而只收集展示特異于靶蛋白的vh結(jié)構(gòu)域的酵母細胞。在本發(fā)明中，使用核糖體展示方法來篩選對特定抗原具有結(jié)合能力的vh結(jié)構(gòu)域。根據(jù)核糖體展示方法，從編碼篩選的vh支架的mrna中除去終止密碼子，然后進行體外蛋白合成。然后，形成所述蛋白和其對應(yīng)的mrna相連的核糖體復(fù)合體(mingyueh.etal.,natureprotocol20074(3):281-288)。在靶抗原上進行淘選以篩選具有所需抗體的復(fù)合體，結(jié)果是，可以富集期望的復(fù)合體。將所篩選的mrna反轉(zhuǎn)錄為dna，而這個過程重復(fù)三次或四次，直到獲得期望的結(jié)果。當(dāng)通過上述方法在由實施例7和8制備的抗原結(jié)合文庫中進行篩選時，可以篩選出強烈結(jié)合于靶抗原并具有穩(wěn)定的性能，例如高溶解性、熱穩(wěn)定性和長的儲存穩(wěn)定性的vh結(jié)構(gòu)域。根據(jù)上面提出的3種篩選技術(shù)，使用has或her3作為靶抗原，篩選出對人血清白蛋白(has)和人表皮生長因子受體3(her3)具有高親和力的vh結(jié)構(gòu)域。所篩選的vh結(jié)構(gòu)域保持vh支架的性能，并且作為在大腸桿菌中可溶性形式表現(xiàn)出較高的生產(chǎn)力。在所篩選的vh結(jié)構(gòu)域中，對has或her3具有高親和力的vh的氨基酸序列和親和力在表9中示出。[表9]使用has和her3作為靶抗原，根據(jù)cdrh3的長度從文庫篩選的氨基酸序列與親和力序列表文本seqidno:1至48引物序列seqidno:49mg1x8氨基酸序列seqidno:50mg2x1氨基酸序列seqidno:51mg2x1-34氨基酸序列seqidno:52mg2x2-12氨基酸序列seqidno:53mg2x2-13氨基酸序列seqidno:54mg3x1氨基酸序列seqidno:55mg3x10氨基酸序列seqidno:56mg4x1-8氨基酸序列seqidno:57mg4x1-33氨基酸序列seqidno:58mg4x1-35氨基酸序列seqidno:59mg4x3-27氨基酸序列seqidno:60mg4x4-2氨基酸序列seqidno:61mg4x4-4氨基酸序列seqidno:62mg4x4-25氨基酸序列seqidno:63mg4x4-44氨基酸序列seqidno:64mg4x5-30氨基酸序列seqidno:65mg4x6-27氨基酸序列seqidno:66mg4x6-48氨基酸序列seqidno:67mg4x7-15氨基酸序列seqidno:68mg4x8-24氨基酸序列seqidno:69mg.05x-1氨基酸序列seqidno:70mg.05x-3氨基酸序列seqidno:71mg.05x-4氨基酸序列seqidno:72mg.05x-14氨基酸序列seqidno:73mg.075x-4氨基酸序列seqidno:74mg2x-5氨基酸序列seqidno:75mg2x-15氨基酸序列seqidno:76mg4x-5氨基酸序列seqidno:77mg1-4氨基酸序列seqidno:78mg1-6氨基酸序列seqidno:79mg1-7氨基酸序列seqidno:80mg1-8氨基酸序列seqidno:81mg1-9氨基酸序列seqidno:82mg1-10氨基酸序列seqidno:83mg5-1氨基酸序列seqidno:84mg5-2氨基酸序列seqidno:85mg5-4氨基酸序列seqidno:86mg5-5氨基酸序列seqidno:87mg5-6氨基酸序列seqidno:88mg5-7氨基酸序列seqidno:89mg5-9氨基酸序列seqidno:90mg10-1氨基酸序列seqidno:91mg10-2氨基酸序列seqidno:92mg10-4氨基酸序列seqidno:93mg10-5氨基酸序列seqidno:94mg10-6氨基酸序列seqidno:95mg10-8氨基酸序列seqidno:96mg10-10氨基酸序列seqidno:97mg2氨基酸序列seqidno:98mg5氨基酸序列seqidno:99mg6氨基酸序列seqidno:100mg7氨基酸序列seqidno:101mg10氨基酸序列seqidno:102mg8-21氨基酸序列seqidno:103mg2-12l氨基酸序列seqidno:104mg2-7i氨基酸序列seqidno:105mg2-9i氨基酸序列seqidno:106mg2-10i氨基酸序列seqidno:107mg2-11i氨基酸序列seqidno:108mg12i氨基酸序列seqidno:109mg2-32氨基酸序列seqidno:110mg2-34氨基酸序列seqidno:111mg2-40氨基酸序列seqidno:112mg2-46氨基酸序列seqidno:113mg2-47氨基酸序列seqidno:114mg2-48氨基酸序列seqidno:115mg2-51氨基酸序列seqidno:116mg2-53氨基酸序列seqidno:117mg2-55氨基酸序列seqidno:118mg2-57氨基酸序列seqidno:119mg2-58氨基酸序列seqidno:120mg2-59氨基酸序列seqidno:121mg2-60氨基酸序列seqidno:122mg2-64氨基酸序列seqidno:123mg4-12氨基酸序列seqidno:124mg4-13氨基酸序列seqidno:125mg4-17氨基酸序列seqidno:126mg4-18氨基酸序列seqidno:127mg4-20氨基酸序列seqidno:128mg4-28氨基酸序列seqidno:129mg4-2氨基酸序列seqidno:130mg4-32氨基酸序列seqidno:131mg4-33氨基酸序列seqidno:132mg3-34氨基酸序列seqidno:133mg4-5氨基酸序列seqidno:134mg4-6氨基酸序列seqidno:135mg4-7氨基酸序列seqidno:136mg8-11氨基酸序列seqidno:137mg8-12氨基酸序列seqidno:138mg8-13氨基酸序列seqidno:139mg8-14氨基酸序列seqidno:140mg8-4氨基酸序列seqidno:141mg8-5氨基酸序列seqidno:142mg8-6氨基酸序列seqidno:143mg8-8氨基酸序列當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12