納米氧化石墨烯在促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)和自我更新中的應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及一種納米氧化石墨烯在促進(jìn)小鼠胚胎細(xì)胞培養(yǎng)和自我更新中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

納米技術(shù)是現(xiàn)代科學(xué)中新興并高速發(fā)展的一個(gè)領(lǐng)域。在過(guò)去幾年中，納米技術(shù)被高效運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)研究中，為細(xì)胞成像，基因或其他小分子的運(yùn)載以及組織工程中生物支架的制備提供了新的方法。

胚胎干細(xì)胞（ESCs）是從胚胎的囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來(lái)的細(xì)胞，因其同時(shí)具有無(wú)限增值能力和多向分化潛能而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究中。到目前為止，ESCs逐漸應(yīng)用于臨床疾病的治療，如脊髓損傷、帕金森綜合種、心肌梗塞以及肺纖維化等。因此，對(duì)ESCs增殖或分化的精確調(diào)控是當(dāng)前研究的關(guān)鍵。研究表明，納米技術(shù)與干細(xì)胞的結(jié)合可能為干細(xì)胞的培養(yǎng)及調(diào)控帶來(lái)重大突破，之前研究主要集中于干細(xì)胞的分離示蹤、藥物和基因的運(yùn)載。如今研究范圍逐漸擴(kuò)展于納米材料對(duì)干細(xì)胞自我更新、分化以及細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控上。相關(guān)研究表明，納米層狀雙氫氧化物（LDH）具有代替白血病抑制因子LIF，維持小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新、抑制分化的作用。納米層狀雙氫氧化物是一種陰離子無(wú)機(jī)片層狀材料，因其具有良好的生物相容性和低毒性，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中。

氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）是一種片層狀材料，具有導(dǎo)電性、良好的生物相容性以及表面可修飾性，被越來(lái)越多的應(yīng)用于生物學(xué)研究中。相關(guān)研究表明，氧化石墨烯對(duì)多種干細(xì)胞的增殖、分化具有調(diào)控作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種納米氧化石墨烯在促進(jìn)小鼠胚胎細(xì)胞培養(yǎng)和自我更新中的應(yīng)用。

本發(fā)明提出的納米氧化石墨烯在促進(jìn)小鼠胚胎細(xì)胞培養(yǎng)和自我更新中的應(yīng)用，具體步驟如下：

(１）通過(guò)差速貼壁法將正常培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞去除飼養(yǎng)層細(xì)胞，將其按照20000個(gè)/孔接種在鋪有1%明膠的六孔板上；

（２）將步驟（１）得到的產(chǎn)物采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，去除LIF因子，在完全培養(yǎng)基中添加納米氧化石墨烯，始納米氧化石墨烯終濃度維持在10μg/mL-40μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞，添加納米氧化石墨烯后48小時(shí)后，即可從形態(tài)上顯示其能夠維持小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新能力；其中：完全培養(yǎng)基由高糖DMEM；15％胎牛血清；0．1mmol／L非必需氨基酸；2mmol／L谷氨酰胺；0．1mmol／Lβ-巰基乙醇；1000U／mL白血病抑制因子組成。

通過(guò)堿性磷酸酶染色、Western Blot、熒光定量PCR(rt-PCR)以及免疫熒光染色，表明氧化石墨烯具有維持小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新力并抑制其分化的能力。

本發(fā)明的有益效果在于；本發(fā)明提出了納米氧化石墨烯（GO）用于干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的新用途，在去掉飼養(yǎng)層細(xì)胞及無(wú)白血病抑制因子（LIF）存在的情況下，能夠維持小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新能力。胚胎干細(xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中易發(fā)生分化，為了維持胚胎干細(xì)胞的自我更新能力，傳統(tǒng)胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)需要依賴于飼養(yǎng)層細(xì)胞以及白細(xì)胞抑制因子，這使得胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)成本高昂，培養(yǎng)過(guò)程繁瑣，本發(fā)明能夠簡(jiǎn)化胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)流程，降低胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)成本。

附圖說(shuō)明

圖1為氧化石墨烯的透射電鏡圖。

圖2為不同濃度的氧化石墨烯分別處理胚胎干細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)后對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的MTT檢測(cè)結(jié)果。其中：(ａ)為24小時(shí)，(ｂ)為48小時(shí)。

圖3為不同濃度氧化石墨烯處理4天后的小鼠胚胎干細(xì)胞堿性磷酸酶染色。其中：(ａ)為培養(yǎng)液中加入LIF因子和（b）去除LIF因子作為對(duì)照組。氧化石墨稀加入后終濃度分別為(ｃ)4mg/mL 、(ｄ)8mg/mL 、(ｅ)16mg/mL、(ｆ)32mg/mL、(ｇ)40mg/mL。

圖4為Western Blot檢測(cè)小鼠胚胎干細(xì)胞多潛能性和自我更新相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

圖5為免疫熒光染色檢測(cè)多潛能基因的表達(dá)。其中：（a）、（b）、（c）、（d）圖分別為不添加lif因子的條件下培養(yǎng)4天后的小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新標(biāo)記基因Nanog, Oct4, Sox2和 SSEA-1的表達(dá)情況，（e）、（f）、（g）、（h）圖分別為去掉lif因子的條件下添加氧化石墨烯培養(yǎng)4天后的小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新標(biāo)記基因Nanog, Oct4, Sox2和 SSEA-1的表達(dá)情況。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1：小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)及氧化石墨烯的作用流程操作

原代獲取小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF），培養(yǎng)至3-5代，經(jīng)80kV的γ-射線處理30min后作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，1周內(nèi)使用。小鼠胚胎干細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基：高糖DMEM，15%胎牛血清， 0.1 mmol/L非必需氨基酸，2 mmol/L谷氨酰胺，0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇，1000U/ml0.1白血病抑制因子，正常培養(yǎng)2-3天后，加胰蛋白酶（0.25%）-EDTA（0.02%）消化細(xì)胞，培養(yǎng)液中和胰酶后將細(xì)胞置于包被0.1%的培養(yǎng)皿上，靜置培養(yǎng)30分鐘。吸取未貼壁的mESC計(jì)數(shù)后，按照2×10⁴個(gè)/孔接種在鋪1%明膠包被的六孔板上。

培養(yǎng)24小時(shí)后，去掉LIF因子，在培養(yǎng)液中加入粒徑大小為200nm的氧化石墨烯溶液，使其終濃度在10-40μg/mL，每天更換具有相同濃度的氧化石墨烯的培養(yǎng)液，連續(xù)處理4天后，進(jìn)行小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新能力相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

實(shí)施例2：MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

mESCs經(jīng)消化、吹打成單細(xì)胞，經(jīng)差速貼壁法去除飼養(yǎng)層細(xì)胞后，按照2×10³個(gè)/孔的密度接種于包被明膠的96孔板上，每孔200 μL培養(yǎng)液，過(guò)夜培養(yǎng)。次日，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含有氧化石墨烯的培養(yǎng)液，氧化石墨烯的濃度分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3μg/mL。更換不添加氧化石墨烯培養(yǎng)液的細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都設(shè)立5個(gè)復(fù)孔。分別在氧化石墨烯處理24 h、48 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。配制5 mg/mL溴化3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑[3-（4,5-dimethylthiazol-2yl）-2,5- diphenylterazolium bromide, MTT] 溶液，用PBS稀釋，pH=7.4，每孔加20 μL。孵育4 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，水平振蕩10 min。用酶標(biāo)儀讀取570 nm激發(fā)波長(zhǎng)下各孔光吸收值，記錄結(jié)果并按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率%=A570（實(shí)驗(yàn)組）/A570（空白對(duì)照組）×100 %。

實(shí)施例3：氧化石墨烯對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的影響

（1）堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)。未分化的胚胎干細(xì)胞的一個(gè)重要生物學(xué)特征是能夠表達(dá)高濃度的堿性磷酸酶(AP)，通過(guò)堿性磷酸酶可以反應(yīng)出胚胎干細(xì)胞的分化狀態(tài)。對(duì)由實(shí)施1獲得的mESC固定后進(jìn)行堿性磷酸酶染色。如圖2所示，從形態(tài)上，去除LIF因子的mESC已完全分化，加入氧化石墨烯的mESC維持未分化狀態(tài)，且加入氧化石墨烯的mESC呈堿性磷酸酶強(qiáng)陽(yáng)性；說(shuō)明氧化石墨烯能夠促進(jìn)mESC的自我更新能力。

（2）Western Blot檢測(cè)小鼠胚胎干細(xì)胞多潛能性和自我更新相關(guān)蛋白的表達(dá)。Nanog、Oct4、Sox2、Rex-1這些蛋白對(duì)ES細(xì)胞的自我更新具有重要的調(diào)控作用。Western Blot能夠檢測(cè)這些蛋白的表達(dá)情況，反映細(xì)胞所處的狀態(tài)。如圖4所示，氧化石墨烯能夠上調(diào)這四個(gè)基因的表達(dá)水平，促進(jìn)了小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新能力。

（3）免疫熒光在細(xì)胞水平上檢測(cè)多潛能基因的表達(dá)。選用Rabbit anti-Nanog, Rabbit anti-Oct4, Rabbit anti-Sox2，Mouse anti-SSEA-1作為1抗，F(xiàn)luorescein Conjugated Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody和Fluorescein Conjugated Goat Anti- Mouse Secondary Antibody 作為2抗，DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，熒光顯微鏡觀察染色情況。如圖5所示，與對(duì)照組相比，氧化石墨烯能夠促進(jìn)Nanog、Oct4、Sox2和SSEA-1在細(xì)胞水平的表達(dá)。